Name: Medição flexível de repórteres bioluminescentes usando um Luciferase Longitudinal automatizado de imagem gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a usar o sistema ALLIGATOR para monitoramento longitudinal de repórteres bioluminescentes em células cultivadas. Este método automatizado permite registrar expressão gênica em condições variáveis de gás e temperatura.

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Gostaríamos de agradecer o Cairn pesquisa por trabalhar para desenvolver este sistema, em especial Mark Henson, Jeremy Graham e Joao Correia. Agradecemos também David Welsh e Adriano Reddy para discussão valioso durante a fase de projeto, bem como Peter Laskey (anteriormente de Hamamatsu) para organizar o empréstimo de uma câmera de demo e David Wong para sua entrada crítica ao manuscrito.

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<li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li>
<li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+%28+CK1+%29+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesses existentes.

O protocolo descrito aqui é para cultura de células de mamíferos, tanto em condições estáticas e perfundidas. No entanto, o jacaré pode ser facilmente adaptado para outros sistemas de modelo. Com efeito, já mostrou para fornecer uma excelente plataforma para monitoramento simultâneo de locomoção, sono e ritmos de expressão do gene periférica em Drosophila melanogaster , mantida sob constante escuridão15. É também de notar que, dependendo da aplicação, tipos de câmera diferentes que mencionados aqui podem ser adequados. Prevemos que com os filtros adequados, uma versão modificada da instalação do atual poderia em princípio ser usada para quantificação de fluorescência.
Os aplicativos só por que o jacaré não pode ser apropriado são aqueles para os quais particularmente alta resolução espacial é necessária, como a imagiologia de organização spatiotemporal de expressão PER2::LUC em fatias organotypic dos mamíferos núcleo supraquiasmático, ou outras fatias pequenas de tecido.
O jacaré permite muitas experiências a serem executadas que até então não foram facilmente alcançáveis por técnicas convencionais de gravação. Comparado com os métodos atuais para a medição de bioluminescência, o jacaré fornece maior flexibilidade em ambos o tipo de prato de cultura celular ou slide que pode ser usado, as condições de mídia externa, sensibilidade e processivity.
Isto é particularmente relevante num momento quando há um movimento longe de modelos de cultura padrão celular 2D para 3D organoides e fluxo sistemas de cultura. Como tal, prevê-se que o jacaré irá fornecer um método adaptável pelo qual bioluminescência pode ser medida ao longo de muitos dias e semanas sob uma ampla gama de condições.

O uso de luciferases como repórteres da expressão gênica e atividade de proteína tornou-se uma técnica popular em pesquisa da biologia molecular e celular. Isto é verdadeiro no campo circadiano, onde a cinética da síntese de luciferase de vaga-lume e inativação catalítica são particularmente adequados para relatar as mudanças longitudinais na expressão gênica que ocorrem durante o ciclo circadiano h aproximadamente 24. Como tal, luciferase é empregado como um repórter circadiano em uma ampla gama de organismos, incluindo plantas, fungos, moscas e mamíferos1,2,3,4.
Quando quantifying genética circadian expressão em vitro, um tubo fotomultiplicador (PMT) é comumente usado para gravar o sinal bioluminescente. Medições baseadas em PGTO tem flexibilidade limitada no entanto, geralmente sendo restrito para um tamanho de placa ou prato pré-determinado. Também não é possível recolher qualquer informação espacial das amostras monitoradas usando um PGTO, que pode levar a uma perda de informação quando imagens de amostras que mostram a variação espacial na expressão de luciferase. Além disso, como o pgto e electrónicos associados são propensos a mau funcionamento quando expostos ao ambiente de uma incubadora de cultura de célula padrão umidificado, gravação longitudinal do luciferase usando PMTs é sempre executada em incubadoras não-umedecido. Em consequência, pratos de cultura de células devem ser selados estanque para evitar a perda de umidade por evaporação e os meios de cultura, portanto, deve ser tamponado com 3 - ácido (N- Morpholinos) (MOPS) ou 4-(2-hidroxietil) -1- ácido piperazineethanesulfonic (HEPES), ao invés do CO2/bicarbonate buffer sistema que funciona na vivo e é usado rotineiramente em cultura de tecidos de mamíferos.
Como resultado dessas limitações, medição de bioluminescência por PMTs geralmente lugares fortes restrições sobre as condições sob as quais as células são mantidas durante as experiências. Para superar esses problemas e também para aumentar o leque de possíveis condições experimentais, usamos uma padrão CO2/N2 170L tecido cultura incubadora que foi adaptada pela adição de uma água-refrigerados elétron-multiplicando dispositivo de carga acoplada (EMCCD) câmera com antinévoa óptica e controle digital de níveis de temperatura e gasolina. Isto tem sido apelidado um automatizado Longitudinal Luciferase Imaging gás e Temperature-Optimized gravador ou jacaré. O jacaré permite flexibilidade um aumento substancial de imaging bioluminescentes, ambos para a imagem latente da elevado-produção de placas de cultura de tecido padrão (até 6 x 96 ou 384-poços chapas simultaneamente) e também para os sistemas de cultura de tecidos não-padrão, tais como perfundidas células cultivadas em dispositivos microfluídicos. Este instrumento permite também a imagem para ocorrer sob condições umidificadas e com controle variável de CO2 e O2 parcial pressão tanto da temperatura.
O protocolo abaixo descreve um método para a gravação bioluminescente de células de mamíferos e sistemas de cultura de tecidos utilizando um jacaré (doravante referido como 'incubadora de bioluminescência'). Convém, no entanto, que o sistema seria bem adequado para imagens bioluminescentes e também, com algumas modificações, fluorescente de imagem, em um número de outros contextos e sistemas biológicos.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FetalClone III Serum</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td>meio basal</td></tr><tr><td>Soro bovino Albumina</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Glutationa</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Superóxido Dismutase</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>Holo-transferrina</td><td>Calbiochem</td><td>616424</td><td></td></tr><tr><td>T3 (triiodo-L-tironina</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>L-Carnitina</td><td>Sigma</td><td>C7518</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>D (+) -Galactose</td><td>Sigma</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Corticosterona</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Linoleico</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Linolênico</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Lipóico</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Retinol</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Retinol, todos trans</td><td>Sigma</td><td>95144</td><td></td></tr><tr><td>D, L-alfa-Tocoferol</td><td>Sigma</td><td>95240</td><td></td></tr><tr><td>D, acetato de L-alfa-tocoferol</td><td>Sigma</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S8761-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 170R incubadora&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>CO17301001</td><td></td></tr><tr><td>Luciferina</td><td>Biosynth</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>D -(+)-Solução de glicose</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM em pó</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>PHG0007</td><td></td></tr><tr><td>tubo de silicone de 1 mm de diâmetro interno&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>19-4692-01</td><td></td></tr><tr><td>Conector luer de cotovelo</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Conexões luer macho</td><td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>Conexões luer fêmea</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-slide luer I 0.6</td><td>Seringa Ibidi</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>BD plastipak 20ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1mm Tubulação I.D. ETFE GE</td><td>Healthcare</td><td>18-1142-38</td><td></td></tr><tr><td>PF670462</td><td>Sigma</td><td>SML0795</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento (50x)</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD câmera</td><td>Andor</td><td>iXon 888</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>Graphpad Software</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase Isothermal Pad</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de densidade neutra aquecido&nbsp;</td><td>Cairn Research</td><td>Item</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>Osmomat 030</td><td>Gonotech</td><td>Descontinuado</td><td></td></tr><tr><td>300 mOsmol/kg padrão de calibração</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0020</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de medição</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0010</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de focagem</td><td>Cairn Research</td><td>Item</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>NE-1600 bomba de seringa programável</td><td>Pump Systems inc. </td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis Software</td><td>Andor N</td><td>/A</td><td></td></tr></tbody></table>

medição flexível de repórteres bioluminescentes usando um luciferase longitudinal automatizado de imagem gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Repórteres do luciferase-baseado da expressão gênica celular estão em uso difundido para ambos longitudinal e ensaios de ponto de extremidade de atividade biológica. Na pesquisa de ritmos circadianos, por exemplo, fusões de gene relógio com luciferase de vaga-lume dar origem a ritmos robustos em bioluminescência celular que persistem por muitos dias. Limitações técnicas associadas com tubos fotomultiplicador (PMT) ou os métodos baseados em microscopia convencionais para quantificação de bioluminescência tipicamente exigiram que as células e tecidos ser mantida sob condições bastante não-fisiológicas durante gravação, com um trade-off entre a sensibilidade e a taxa de transferência. Aqui, nós relatamos um refinamento dos métodos anteriores que permite imagens de bioluminescência a longo prazo com alta sensibilidade e taxa de transferência que suporta uma ampla gama de condições de cultura, incluindo gás variável e controle de umidade, e que aceita muitos diferentes placas de cultura de tecido e pratos. Este luciferase longitudinal automatizada de imagem gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré) também permite a observação das variações espaciais na expressão do luciferase em uma monocamada de células ou tecido, que não pode ser observado prontamente pelo tradicional métodos. Destaca-se como o jacaré fornece uma flexibilidade muito maior para a detecção de atividade de luciferase quando comparado com os métodos existentes.

Este artigo descreve um protocolo para a imagem latente bioluminescente de pilhas mamíferas usando um jacaré (incubadora de bioluminescência). Esta técnica permite flexibilidade de configuração física e condições extracelulares quando sistemas bioluminescentes de imagens. Métodos para cultura de tecidos estática simples (Figura 1, complementar Video 1) e cultura de pilha perfundidos (Figura 2, vídeo complementar 2) são descritos, mas muitas outras configurações poderiam ser fotografadas usando este sistema. Todos os dados foram quantificados usando os métodos descritos na seção 7.
A figura 1A mostra um exemplo de vídeo de uma gravação de chapas de 6 x 96 poços contendo PER2::LUC fibroblastos4de bioluminescência. Os poços ultraperiféricas não contêm células como estes não eram necessários para esta experiência. Células sofreram arrastamento de temperatura diferencial, pelo qual passam por qualquer ciclo de temperatura de 12 h, a 32 ° C, seguido por 12 h 37 ° C, durante 72 h ou o inverso (12 h, a 37 ° C, seguido de 12 h, a 32 ° C, durante 72 h), antes sendo realizada a constante de 37 ° C para a gravação. exposições de 60 min foram tiradas a cada hora. Duas dessas condições são quantificadas na figura 1B.
Figura 2A mostra um esquema da instalação de um sistema de cultura de tecidos perfundido. Isto consiste em dois slides canal conectados com a tubulação. Mídia de células é atravessada por uma bomba de seringa. O primeiro destes slides atua como um borbulhador permeável (slide reserva) gás e contém sem células, com o segundo contendo as células do qual bioluminescência é gravada. Um representante de gravação de vídeo a partir deste sistema é mostrado na Figura 2B. 15 min exposições foram tiradas a cada 15 min. Aqui, as células são mantidas em condições padrão de perfusão ou na presença de inibidor de caseína quinase PF670462, que foi mostrado anteriormente para alongar o período circadiano e reduzir a amplitude dos ritmos de expressão de gene de relógio no culto células de mamíferos,14. O efeito na expressão de PER2::LUC é mostrado na Figura 2 (painel superior) contra células tratadas com a mesma concentração de drogas em condições de cultura celular estático padrão mostrado na Figura 2 (painel inferior), com a quantificação do período mostrado na Figura 2D. É claro com isso que o tratamento com PF670462 influências PER2::LUC expressão sob os dois conjuntos de condições. No entanto, enquanto células tratadocom com PF670462 sob condições perfundidas mostrar período alongamento de aproximadamente 3 h (3h ±0.9), as células em condições estáticas, tratadas com a droga apresentam substancialmente maior período de alongamento para um período de &gt; 48 h. Isto pode ser cabido por um cosseno amortecido, conforme descrito na seção 7, (extrasoma-das-praças F teste contra uma linha reta, p &lt; 0,0001). Curiosamente, a magnitude do alongamento do período sob perfusão está mais próxima às observadas na vivo14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
Figura 1: exemplo de dados. (A) exemplo de placas de vídeo instantâneo de bioluminescência de PER2::LUC imortalizado em 6 x 96 bem na incubadora de bioluminescência. Poços para ser quantificada foram destacados em amarelo no complementar Video 1. (B) quantificação de bioluminescência da. Dois conjuntos de 3 placas de células foram arrastados usando ciclos de temperatura (12 h, a 32 ° C; 12 h, a 37° C) que eram antifásicos uns aos outros para produzir em frente as fases de expressão de proteínas PER2 (n = 6, quer dizer ± SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
Figura 2: perfusão com inibidores de CK1δ. (A) diagrama esquemático do sistema de perfusão. (B) exemplo de vídeo instantâneo de uma gravação de PER2::LUC de bioluminescência células sob perfusão. Uma área de amostra de quantificação é realçada em amarelo. (C) a quantificação da bioluminescência dos fibroblastos PER2::LUC em perfusão e em condições estáticas com e sem inibidor de CK1 3 µM PF670462 (n = 3, significa ± SEM). Bioluminescência tem sido normalizada para os valores mínimos e máximos. (D) a análise do período (Two-Way ANOVA, teste de comparações múltiplas do Holm-Sidak).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente de</td>
			<td>Concentração média final (μM)</td>
			<td>Estoque (mg/mL)</td>
			<td>Para NS21 400ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumina bovina</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>0.01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutationa</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulina</td>
			<td>0.6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superóxido dismutase</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrina</td>
			<td>0,062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triiodo-L-Tironina)</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 Μ l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitina</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etanolamina</td>
			<td>16</td>
			<td>Líquido (1 g/ml)</td>
			<td>20 Μ l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-Galactose</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescina</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322-mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenito de sódio</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>Μ L 280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterona</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido linoleico</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido linolênico</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido lipoico</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterona</td>
			<td>0.02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetato de retinol</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol, todos os trans</td>
			<td>0.3</td>
			<td>10</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alfa-tocoferol</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, acetato de L-alfa-tocoferol</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: NS21 preparação.
Suplementares vídeo 1: vídeo de exemplo de bioluminescência de placas bem. Vídeo instantâneo de exemplo de bioluminescência de PER2::LUC imortalizado em 6 x 96 placas bem na incubadora de bioluminescência. Poços para ser quantificados são realçados em amarelo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Vídeo complementar 2: vídeo instantâneo de exemplo de uma gravação de PER2::LUC de bioluminescência células sob perfusão. Uma área de amostra de quantificação é realçada em amarelo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Luciferase geneticamente codificado é um repórter popular não-invasivo da expressão do gene. Uso de um automatizado do longitudinal luciferase gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré) de imagem permite gravação longitudinal das células bioluminescentes sob uma ampla gama de condições. Aqui nós mostramos como jacaré pode ser usado no contexto de pesquisa de ritmos circadianos.

Medição flexível de repórteres bioluminescentes usando um Luciferase Longitudinal automatizado de imagem gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

O objetivo geral deste sistema é permitir a fácil observação de repórteres bioluminescentes sob uma ampla gama de condições extracelulares, inclusive sob perfusão constante de meios. Este método pode ser usado para observar a bioluminescência longitudinalmente de células e tecidos cultivados. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o registro de células sob diferentes condições de meios extracelulares e gases, o que não é possível na maioria dos sistemas existentes.Embora aqui demonstremos essa técnica no contexto de experimentos de ritmo circadiano, ela pode ser prontamente aplicada a outros sistemas que requerem bioluminescência ou registro fluorescente em escalas de tempo de dias a semanas. Para iniciar o procedimento, semeie células cultivadas em placas ou placas de cultura de tecidos. Incubar as células a 37 graus Celsius até que as monocamadas atinjam 100% de confluência.Imediatamente antes do experimento, use uma incubadora de ciclismo controlada por computador para alternar entre 32 e 37 graus Celsius a cada 12 horas por um mínimo de 72 horas para sincronizar os ritmos celulares. A sincronização robusta das oscilações circadianas celulares dentro e entre as culturas é crucial para a reprodutibilidade experimental. Conseguimos isso aplicando ciclos diários de temperatura antes de cada gravação que sincronizam as células imitando os ritmos de temperatura corporal.Alternativamente, a sincronização farmacológica também pode ser bastante eficaz. Em seguida, combine 8,3 gramas de pó de DMEM com alto teor de glicose com 900 mililitros de água ultrapura. Mexa a solução por 30 minutos para dissolver completamente o pó.Em seguida, adicione à solução 50 mililitros de 100 gramas por litro de solução de glicose, 20 mililitros de pH 7,6, uma solução molar de MOPS e 10 mililitros de solução de estreptomicina de penicilina a 100 vezes. Mexa a mistura por 10 minutos. Em seguida, adicione 4,7 mililitros de uma solução de bicarbonato de sódio a 7,5% e mexa a mistura por mais cinco minutos.Use ácido clorídrico ou hidróxido de sódio para ajustar o pH para 7,6 à temperatura ambiente. Adicione água ultrapura à solução para obter um volume final de um litro. Filtrar a solução através de um filtro estéril de 0,22 micrómetros para um balão estéril.Armazene o meio de estoque filtrado a quatro graus Celsius. Imediatamente antes de realizar o experimento, suplemente a quantidade desejada de meio estoque com 10% de soro, dois milimolares de GlutaMAX, 2% NS21 e um milimolar de luciferina. Passe o meio de trabalho resultante por um filtro estéril de 0,22 micrômetro.Use uma solução de cinco molares de cloreto de sódio para ajustar a osmolalidade do meio de trabalho para 350 miliosmoles. Em seguida, aqueça o médio a 37 graus Celsius em banho-maria. Em seguida, para começar a focar a câmera da incubadora de bioluminescência, desparafuse o filtro de densidade neutra aquecido à prova d'água.No software do instrumento, defina o tempo de exposição para 0.2 segundos e o tempo do ciclo cinético para 0.3 segundos. Verifique se o ganho de multiplicação de elétrons está desativado, feche a janela de configuração e inicie a gravação do vídeo. Use o cilindro de foco para girar a lente da câmera até que os itens de teste na prateleira de amostra apropriada estejam claramente em foco.Em seguida, pare a gravação do vídeo. Substitua o filtro de densidade neutra e remova os itens de teste. Em seguida, use o painel de controle na frente da incubadora de bioluminescência para definir os níveis desejados de oxigênio, dióxido de carbono e temperatura para o experimento.Para um experimento umidificado, encha a bandeja de água na base da incubadora. Remova as células da incubadora de cultura de tecidos e substitua o meio de cultura pelo meio de trabalho pré-aquecido. Para experimentos umidificados usando pequenos volumes, sele as placas com filme ou fita permeável a gás.Coloque as placas na incubadora bioluminescente. Feche a incubadora e feche a tampa da porta para excluir a luz do sistema. Em seguida, no software do instrumento, defina o modo de aquisição como cinético.Defina o tempo de exposição pretendido. Defina os acúmulos para um, o comprimento da série cinética para o número desejado de ciclos de aquisição e o tempo do ciclo cinético para o intervalo de imagem desejado. Defina uma velocidade de deslocamento de 4,33 microssegundos, um ganho de um e um ganho EM do nível desejado.Em seguida, defina o tipo de arquivo de salvamento automático como sif ou tiff. Nomeie o arquivo de salvamento automático e defina seu caminho de arquivo. Defina o tipo de arquivo de spool como sif ou tiff.Nomeie a pilha de arquivos e defina seu caminho de arquivo. Feche a janela de configuração e comece a gravar dados. Quando a coleta de dados for concluída, importe a pilha de imagens adquirida para o software de processamento de imagens.Ajuste o brilho e o contraste para uma visualização ideal da bioluminescência. Em seguida, selecione as regiões de interesse e exporte o sinal médio para as áreas selecionadas. Copie os dados para o software de análise para processamento posterior.Para iniciar o experimento, semeie células em lâminas de canal único com conectores Luer e uma profundidade de canal de 0,6 ou 0,8 milímetros. Cultive e arraste as células. Prepare e aqueça o meio de perfusão DMEM tamponado com hidrogênio tamponado com baixo teor de glicose.Em seguida, corte cinco seções de dois centímetros de tubo de silício com um diâmetro interno de um milímetro. Corte tubos de etileno tetrafluoretileno de 1,2 metros, 10 centímetros e 30 centímetros de diâmetro interno de um milímetro. Esterilize a tubulação com etanol a 70% e lave a tubulação com PBS estéril.Use a tubulação de silicone esterilizada para conectar a tubulação ETFE de 1.2 metros a um conector Luer fêmea estéril e a um conector Luer de cotovelo estéril. Use este conjunto para conectar a seringa do meio de perfusão a uma lâmina de canal Luer vazia. Em seguida, substitua o meio de cultura de células por meio de perfusão pré-aquecido.Encha uma seringa estéril de 20 mililitros com meio de perfusão pré-aquecido. Encaixe a tubulação ETFE de 10 centímetros com conectores Luer usando a tubulação de silicone e conecte a tubulação à corrediça. Lave de três a cinco mililitros de meio de perfusão através do tubo e da lâmina do canal.Em seguida, encaixe o tubo ETFE de 30 centímetros na corrediça do canal contendo células. Conecte a extremidade livre do tubo ETFE de 10 centímetros à outra extremidade da lâmina do canal celular para formar o sistema de perfusão completo. Lave um mililitro de meio de perfusão através do tubo e das lâminas para excluir bolhas de ar.Transporte o sistema de perfusão para a incubadora de bioluminescência. Fixe a seringa cheia de meio de perfusão em uma bomba de seringa, tomando cuidado para não desconectar o tubo. Use a bomba de seringa para lavar um mililitro de meio de perfusão através do sistema de perfusão.Insira o diâmetro da seringa na bomba e defina a vazão para 50 microlitros por hora. É crucial que não haja bolhas no sistema de perfusão no início do experimento, pois elas podem interromper o sinal de bioluminescência. Ligue a bomba e feche imediatamente a porta da incubadora de bioluminescência.Feche a tampa da porta para excluir a luz do sistema. Adquira e analise os dados conforme descrito para culturas de tecidos estáticos. Seis placas de fibroblastos PER2 LUC foram arrastadas usando ciclos diários de temperatura e fotografadas usando uma incubadora de bioluminescência.Imagens de poços selecionados foram analisadas e a saída de bioluminescência foi quantificada. As células PER2 LUC também foram fotografadas em condições de perfusão para avaliar os efeitos de um inibidor da caseína quinase na expressão de PER2 LUC. Os resultados foram comparados com células tratadas com a mesma concentração do inibidor em condições estáticas, que revelaram um alongamento de período substancialmente maior em condições estáticas.A magnitude do alongamento do período em condições de perfusão foi próxima à observada in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de bioluminescência estática e perfundida usando um ALLIGATOR.

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Biology

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Medição flexível de repórteres bioluminescentes usando um Luciferase Longitudinal automatizado de imagem gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré) (Vídeo) | JoVE Journal

Medição flexível de repórteres bioluminescentes usando um Luciferase Longitudinal automatizado de imagem gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré)

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