Medição flexível de repórteres bioluminescentes usando um Luciferase Longitudinal automatizado de imagem gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré)

O objetivo geral deste sistema é permitir a fácil observação de repórteres bioluminescentes sob uma ampla gama de condições extracelulares, inclusive sob perfusão constante de meios. Este método pode ser usado para observar a bioluminescência longitudinalmente de células e tecidos cultivados. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o registro de células sob diferentes condições de meios extracelulares e gases, o que não é possível na maioria dos sistemas existentes.

Embora aqui demonstremos essa técnica no contexto de experimentos de ritmo circadiano, ela pode ser prontamente aplicada a outros sistemas que requerem bioluminescência ou registro fluorescente em escalas de tempo de dias a semanas. Para iniciar o procedimento, semeie células cultivadas em placas ou placas de cultura de tecidos. Incubar as células a 37 graus Celsius até que as monocamadas atinjam 100% de confluência.

Imediatamente antes do experimento, use uma incubadora de ciclismo controlada por computador para alternar entre 32 e 37 graus Celsius a cada 12 horas por um mínimo de 72 horas para sincronizar os ritmos celulares. A sincronização robusta das oscilações circadianas celulares dentro e entre as culturas é crucial para a reprodutibilidade experimental. Conseguimos isso aplicando ciclos diários de temperatura antes de cada gravação que sincronizam as células imitando os ritmos de temperatura corporal.

Alternativamente, a sincronização farmacológica também pode ser bastante eficaz. Em seguida, combine 8,3 gramas de pó de DMEM com alto teor de glicose com 900 mililitros de água ultrapura. Mexa a solução por 30 minutos para dissolver completamente o pó.

Em seguida, adicione à solução 50 mililitros de 100 gramas por litro de solução de glicose, 20 mililitros de pH 7,6, uma solução molar de MOPS e 10 mililitros de solução de estreptomicina de penicilina a 100 vezes. Mexa a mistura por 10 minutos. Em seguida, adicione 4,7 mililitros de uma solução de bicarbonato de sódio a 7,5% e mexa a mistura por mais cinco minutos.

Use ácido clorídrico ou hidróxido de sódio para ajustar o pH para 7,6 à temperatura ambiente. Adicione água ultrapura à solução para obter um volume final de um litro. Filtrar a solução através de um filtro estéril de 0,22 micrómetros para um balão estéril.

Armazene o meio de estoque filtrado a quatro graus Celsius. Imediatamente antes de realizar o experimento, suplemente a quantidade desejada de meio estoque com 10% de soro, dois milimolares de GlutaMAX, 2% NS21 e um milimolar de luciferina. Passe o meio de trabalho resultante por um filtro estéril de 0,22 micrômetro.

Use uma solução de cinco molares de cloreto de sódio para ajustar a osmolalidade do meio de trabalho para 350 miliosmoles. Em seguida, aqueça o médio a 37 graus Celsius em banho-maria. Em seguida, para começar a focar a câmera da incubadora de bioluminescência, desparafuse o filtro de densidade neutra aquecido à prova d'água.

No software do instrumento, defina o tempo de exposição para 0.2 segundos e o tempo do ciclo cinético para 0.3 segundos. Verifique se o ganho de multiplicação de elétrons está desativado, feche a janela de configuração e inicie a gravação do vídeo. Use o cilindro de foco para girar a lente da câmera até que os itens de teste na prateleira de amostra apropriada estejam claramente em foco.

Em seguida, pare a gravação do vídeo. Substitua o filtro de densidade neutra e remova os itens de teste. Em seguida, use o painel de controle na frente da incubadora de bioluminescência para definir os níveis desejados de oxigênio, dióxido de carbono e temperatura para o experimento.

Para um experimento umidificado, encha a bandeja de água na base da incubadora. Remova as células da incubadora de cultura de tecidos e substitua o meio de cultura pelo meio de trabalho pré-aquecido. Para experimentos umidificados usando pequenos volumes, sele as placas com filme ou fita permeável a gás.

Coloque as placas na incubadora bioluminescente. Feche a incubadora e feche a tampa da porta para excluir a luz do sistema. Em seguida, no software do instrumento, defina o modo de aquisição como cinético.

Defina o tempo de exposição pretendido. Defina os acúmulos para um, o comprimento da série cinética para o número desejado de ciclos de aquisição e o tempo do ciclo cinético para o intervalo de imagem desejado. Defina uma velocidade de deslocamento de 4,33 microssegundos, um ganho de um e um ganho EM do nível desejado.

Em seguida, defina o tipo de arquivo de salvamento automático como sif ou tiff. Nomeie o arquivo de salvamento automático e defina seu caminho de arquivo. Defina o tipo de arquivo de spool como sif ou tiff.

Nomeie a pilha de arquivos e defina seu caminho de arquivo. Feche a janela de configuração e comece a gravar dados. Quando a coleta de dados for concluída, importe a pilha de imagens adquirida para o software de processamento de imagens.

Ajuste o brilho e o contraste para uma visualização ideal da bioluminescência. Em seguida, selecione as regiões de interesse e exporte o sinal médio para as áreas selecionadas. Copie os dados para o software de análise para processamento posterior.

Para iniciar o experimento, semeie células em lâminas de canal único com conectores Luer e uma profundidade de canal de 0,6 ou 0,8 milímetros. Cultive e arraste as células. Prepare e aqueça o meio de perfusão DMEM tamponado com hidrogênio tamponado com baixo teor de glicose.

Em seguida, corte cinco seções de dois centímetros de tubo de silício com um diâmetro interno de um milímetro. Corte tubos de etileno tetrafluoretileno de 1,2 metros, 10 centímetros e 30 centímetros de diâmetro interno de um milímetro. Esterilize a tubulação com etanol a 70% e lave a tubulação com PBS estéril.

Use a tubulação de silicone esterilizada para conectar a tubulação ETFE de 1.2 metros a um conector Luer fêmea estéril e a um conector Luer de cotovelo estéril. Use este conjunto para conectar a seringa do meio de perfusão a uma lâmina de canal Luer vazia. Em seguida, substitua o meio de cultura de células por meio de perfusão pré-aquecido.

Encha uma seringa estéril de 20 mililitros com meio de perfusão pré-aquecido. Encaixe a tubulação ETFE de 10 centímetros com conectores Luer usando a tubulação de silicone e conecte a tubulação à corrediça. Lave de três a cinco mililitros de meio de perfusão através do tubo e da lâmina do canal.

Em seguida, encaixe o tubo ETFE de 30 centímetros na corrediça do canal contendo células. Conecte a extremidade livre do tubo ETFE de 10 centímetros à outra extremidade da lâmina do canal celular para formar o sistema de perfusão completo. Lave um mililitro de meio de perfusão através do tubo e das lâminas para excluir bolhas de ar.

Transporte o sistema de perfusão para a incubadora de bioluminescência. Fixe a seringa cheia de meio de perfusão em uma bomba de seringa, tomando cuidado para não desconectar o tubo. Use a bomba de seringa para lavar um mililitro de meio de perfusão através do sistema de perfusão.

Insira o diâmetro da seringa na bomba e defina a vazão para 50 microlitros por hora. É crucial que não haja bolhas no sistema de perfusão no início do experimento, pois elas podem interromper o sinal de bioluminescência. Ligue a bomba e feche imediatamente a porta da incubadora de bioluminescência.

Feche a tampa da porta para excluir a luz do sistema. Adquira e analise os dados conforme descrito para culturas de tecidos estáticos. Seis placas de fibroblastos PER2 LUC foram arrastadas usando ciclos diários de temperatura e fotografadas usando uma incubadora de bioluminescência.

Imagens de poços selecionados foram analisadas e a saída de bioluminescência foi quantificada. As células PER2 LUC também foram fotografadas em condições de perfusão para avaliar os efeitos de um inibidor da caseína quinase na expressão de PER2 LUC. Os resultados foram comparados com células tratadas com a mesma concentração do inibidor em condições estáticas, que revelaram um alongamento de período substancialmente maior em condições estáticas.

A magnitude do alongamento do período em condições de perfusão foi próxima à observada in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de bioluminescência estática e perfundida usando um ALLIGATOR.