Na Vivo Avaliação de EPR de pH, pO₂, Status Redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do Tumor

O objetivo geral desta tecnologia de ressonância paramagnética eletrônica in vivo é avaliar quantitativamente e de forma não invasiva os parâmetros fisiologicamente relevantes do microambiente tecidual local em ambientes pré-clínicos em modelos animais de câncer. Esta técnica é baseada na combinação de APR de fluorocampo com sondas paramagnéticas funcionais de design especial para fornecer informações quantitativas sobre a oxigenação tecidual como CDT em status de doca, bem como fosfato orgânico intersticial e concentrações intercelulares. Esta técnica não invasiva fornece uma visão única do mundo do microambiente tumoral e da regênese tumoral e pode contribuir para o futuro design racional de terapias anticancerígenas direcionadas ao microambiente tumoral.

A aplicação desta técnica se estende à correlação do cérebro entre os parâmetros de aplicação de sondas APR multifuncionais. Portanto, fornecendo informações adicionais sobre os mecanismos biológicos subjacentes. Além de mim e Andrey, demonstrando o procedimento estarão Marieta Gencheva e Dr.Benoit Driesschaert e uma estudante de pós-graduação, Kayla Steinberger, do IMMR Center.

Para preparar a sonda sensível ao oxigênio particulado, primeiro pese 60 miligramas dos microcristais. Para calibração da sensibilidade ao oxigênio, suspenda os microcristais em três mililitros de meios de águia modificados com dolbeckas. Sonicar por cinco minutos, no gelo, com um sonicador de sonda a 20 kilohertz usando sete watts de potência em um tubo de fundo redondo de vidro de cinco mililitros.

Em seguida, coloque um mililitro dos microcristais sonicados em um tubo de vidro no ressignificador de bobina de superfície do espectrômetro EPR de banda L. Adquira espectros EPR de ondas contínuas à temperatura fisiológica de 37 graus Celsius e concentrações de oxigênio de zero, um, dois, quatro, oito e 20,9 por cento. Para preparar a sonda de pH e redox de dupla função, dissolva 6,34 miligramas da sonda em um mililitro de solução salina.

Ajuste o pH para 7,2 com pequenas alocações de ácido clorídrico ou hidróxido de sódio usando um medidor de pH. Para realizar a calibração do pH da sonda de nitróxido, primeiro adicione 0,1 mililitro da solução estoque da sonda a 0,9 mililitros de tampão fosfato de sódio de dois milimolares, cloreto de sódio 150 milimolar. Em seguida, titular a solução de sonda milimolar obtida com doses de ácido clorídrico ou hidróxido de sódio até o pH necessário, utilizando um medidor de pH.

Registre os espectros EPR das amostras em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro usando o espectrômetro EPR de banda L. Para preparar a sonda RSSR sensível ao GSH, dissolva 4,05 miligramas da sonda em um mililitro de solução de DMSO. Em seguida, determine o valor da constante de taxa da reação de RSSR com GSH.

Para fazer isso, primeiro adicione 20 microlitros da solução estoque RSSR a 0,98 mililitros de um tampão fosfato milimolar pH 7,2, cloreto de sódio 150 milimolar para obter uma solução de sonda RSSR 0,2 milimolar. Em seguida, misturar volumes iguais de solução de RSSR a 0,2 milimolares numa das soluções de GSH para uma concentração final da sonda a 0,1 milimolar e de GSH a 0,5, um ou 2,5 milimolares. Imediatamente após a mistura da solução RSSR e GSH, colocar a amostra no ressignificador EPR e registar os espectros EPR de 12 em 12 segundos durante 10 minutos.

Em seguida, calcule a cinética do aumento da amplitude espectral monorradical para a sonda multifuncional HOPE para avaliação do pH do oxigênio e Pi. Dissolver 10,7 miligramas da sonda num mililitro de solução salina e ajustar o pH para 7,4. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução estoque preparada a 0,98 mililitros da solução salina para obter uma solução de sonda 0,2 milimolar.

Para a calibração do pH da sonda, titular 0,2 milimolar da solução da sonda pela adição de um pequeno volume de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico, de modo que a diluição final da amostra seja inferior a 1% Adquira os espectros de EPR em pH intermediário, conforme descrito no protocolo de texto. Para calibração da sonda de sensibilidade ao oxigênio, adquira espectros EPR da sonda em várias concentrações de oxigênio, conforme descrito no protocolo de texto. Para calibração da sonda de Pi, adquira espectros de EPR da sonda em várias concentrações de fosfato.

Use a solução radical com um valor de pH próximo ao PKA e titule-a com várias concentrações de fosfato. Mantenha a temperatura e a composição do gás como antes. No caso do modelo de tumor MET1 para internalização da sonda particulada em células MET1, adicione 100 microlitros da suspensão sonicada a um frasco T75 com 10 mililitros de meios de cultura contendo células MET1.

Todos os procedimentos ocorrem em um gabinete de biossegurança e o meio contém penicilina e estreptomicina para minimizar possíveis infecções. Incube as células a 37 graus Celsius por 72 horas ou até atingirem aproximadamente 80% de confluência. Aspire o meio e lave as células cinco vezes com 10 mililitros de PBS.

Retire as células com cinco mililitros de tripson EDTA. Depois de coletar as células e centrifugar como antes, corar a amostra de células do corante de exclusão para determinar a viabilidade e a quantidade celular. Suspenda as células a uma concentração de um milhão de células por 100 microlitros em DMEM mínimo.

Usando uma seringa de insulina, injete lentamente 100 microlitros da suspensão celular contendo os microcristais internalizados nas almofadas de gordura mamária número quatro de um camundongo do tipo selvagem, fêmea de oito semanas de idade, conforme descrito no protocolo de texto. Monitore a iniciação e o crescimento do tumor. Para medições espectroscópicas de EPR, anestesiar os camundongos por inalação de mistura de isofolano a ar usando uma máquina de anestesia, conforme descrito no protocolo de texto.

Realize medições funcionais usando um espectrômetro EPR de banda L, colocando o ressignificador de bobina de superfície em uma glândula mamária normal ou em um tumor mamário. Prossiga para ajustar o espectrômetro. No caso de sondas solúveis, adquira os espectros EPR imediatamente após a injeção da sonda por cinco a 10 minutos.

Adquira os espectros de EPR da sonda de partículas implantada por cinco a 10 minutos durante várias semanas após o implante. Por fim, analise os espectros de EPR e as sondas conforme descrito no protocolo de texto. A sensibilidade espectral EPR da sonda LiNc-BuO particulada ao oxigênio é mostrada aqui.

O espectro EPR foi medido a 0% de pO2 e 37 graus Celsius. Dependentes representativos da largura da linha do espectro EPR da suspensão da sonda na pressão parcial de oxigênio. A largura da linha aumenta linearmente com pO2.

Um espectro medido no tecido tumoral mamário de um camundongo fêmea anestesiado corresponde ao oxigênio parcial do tecido de 7,5 milímetros de mercúrio. Os espectros de EPR de banda L da solução de sonda NR foram adquiridos a 37 graus Celsius em vários níveis de pH. Os dependentes da constante de divisão hiperfina observada no pH são plotados e ajustados com a curva de titulação padrão.

Aqui é mostrada a avaliação multifuncional do microambiente tumoral combinando a sonda LiNc-BuO sensível ao oxigênio na sonda de pH de dupla função em NR redox. O espectro triplo observado do NR é sobreposto com a única linha EPR da sonda LiNc-BuO embutida no tumor. A avaliação in vivo da EPR das concentrações de glutationa no tecido intracelular é mostrada aqui.

A cinética da mudança de intensidade de pico espectral monorradical medida por EPR de banda L em tumor mamário na glândula mamária normal de camundongos FVBN imediatamente após a injeção intratissual da sonda RSSR é mostrada. A cinética mais rápida reflete a maior concentração de GSH no tecido tumoral. A técnica auxilia os investigadores no campo da pesquisa do câncer com oportunidade insuperável para a realização in vivo de parâmetros fisiológicos celulares importantes do microambiente tumoral e o transpotencial para a tradução.

Os sensíveis das sondas de acordo com os procedimentos anteriores requerem experiência em química sintética e são críticos para a apresentação. Nosso centro relatou a dificuldade dessa tecnologia e aos sites de forma colaborativa.