Name: Na Vivo Avaliação de EPR de pH, pO2, Status Redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do Tumor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a avaliar parâmetros do microambiente tumoral usando ressonância paramagnética de elétrons in vivo em modelos de câncer de mama. Esta técnica não invasiva fornece dados quantitativos sobre oxigenação tecidual e status metabólico.

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Este trabalho foi parcialmente financiado pelo NIH concede CA194013, CA192064 e U54GM104942. O WVCTSI é reconhecida pela start-up para VVK, AB e TDE. Os autores Obrigado Dr. M. Gencheva e K. Steinberger para a assistência com os experimentos ilustrativos. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIH.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Os métodos apresentados permitem avaliação não-invasiva em vivo dos parâmetros críticos da TME a química, ou seja pO2, pH, redox status e concentrações de GSH intracelular e intersticial Pi. Técnicas de ressonância magnética, como MRI e baixo-campo EPR, são os métodos de escolha para não-invasiva na vivo perfis desses parâmetros de TME. MRI visualiza estruturas anatômicas, mas carece de sensibilidade funcional. Em contraste com MRI, técnicas EPR fornecem sensibilidade funcional para ...

Um papel fundamental do TME na progressão do câncer e terapia é cada vez mais apreciada1. Entre os parâmetros fisiológicos importantes do TME em tumores sólidos de hipóxia do tecido2, acidose3,4, alta redução de capacidade5, concentrações elevadas de intracelular GSH6,7, e intersticial Pi8 estão bem documentados. Não-invasiva em vivo pO2, pH, Pi, GSH e redox avaliações proporcionam exclusivos insights sobre os processos biológicos em TME e ferramentas de avanço para o rastreio pré-clínico de drogas anti-câncer e estratégias terapêuticas TME-alvo. Uma radiofrequência razoável profundidade de penetração nos tecidos por ressonância magnética (MRI) e técnicas de baixo-campo baseadas em EPR torna as abordagens mais adequadas para avaliação não invasiva destes parâmetros de TME. MRI baseia-se em grande medida na imagem prótons da água e é amplamente utilizado em ambientes clínicos para fornecer resolução anatômica, mas carece de resolução funcional. As medições de ressonância magnética nuclear de fósforo-31 (31P-NMR) de extracelular Pi concentração e pH com base em um sinal de fosfato endógeno são potencialmente atraentes para caracterização de TME, mas normalmente são mascaradas por várias vezes maior intracelular Pi concentrações9,10. Em contraste com isso, medições de EPR dependem de espectroscopia e imagem latente de especialmente projetado paramagnéticos sondas para fornecer resolução funcional. Note que sondas EPR exógenas têm uma vantagem sobre exógena NMR sondas devido a sensibilidade intrínseca muito superior de EPR e ausência de sinais EPR de fundo endógena. O desenvolvimento recente de uma dupla função de pH e redox nitroxyl probe11 e multifuncional trityl sonda12 fornece oportunidades inigualáveis para in vivo medições simultâneas de vários parâmetros do TME e seus análises de correlação independentes na distribuição de sonda e o tempo de medição. A nosso conhecimento, não há nenhum outros métodos disponíveis para avaliar simultaneamente na vivo fisiologicamente importantes parâmetros TME químicos em indivíduos vivos, tais como pO2, pHe, Pi, redox e GSH.
Sondas para Na Vivo Medições funcionais:
A Figura 1 mostra as estruturas químicas das sondas paramagnéticos usadas para acessar parâmetros TME, que incluem sondas solúveis e partículas. Alta sensibilidade funcional, estabilidade em tecidos vivos e toxicidade mínima são alguns benefícios que fazem partículas sondas preferidas sobre sondas solúveis para oximetria de EPR na vivo . Por exemplo, sondas partículas aumentaram tempos de retenção no local de implante de tecido, em comparação com sondas solúveis, permitindo a medição longitudinal de tecido pO2 por várias semanas. Por outro lado, sondas solúveis superam sondas partículas fornecendo medições espaciais-resolvido usando EPR com base em técnicas de imagem, bem como permitindo análises concomitantes de múltiplas funcionalidades (pO2, pH, Pi, redox, e GSH).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> Figura 1. Estruturas químicas das sondas paramagnéticos que montam o ensaio de avaliação de TME. Isso inclui a partículas pO2 sonda, LiNc-BuO (R = - O (CH2)3CH3) e sondas solúveis: sonda de pH e redox de dupla função, NR; Sonda de GSH-sensíveis, RSSR; e multifuncional pO2, pH e sonda de Pi do microambiente extracelular, a sonda de esperança. A síntese de tais sondas tem sido descrita nas referências fornecidas 11,12. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Espectrômetro EPR de banda L</td><td>Magnettech, Alemanha</td><td></td><td>Espectrômetro de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) de banda L (1,2 GHz) para coleta in vitro e in vivo de espectros de moléculas paramagnéticas</td></tr><tr><td>&nbsp; Temperatura e Controlador de Gás&nbsp;</td><td>Noxygen, Alemanha</td><td></td><td>Temperatura & Controlador de Gás projetado para controlar e ajustar a temperatura e a composição do gás&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutationa reduzida)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp; Camundongos</td><td>internos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1 células de câncer de mama murino</td><td>Camundongos C57Bl</td>/6 do tipo selvagem In house<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Exclusão Corante&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoFlo)</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicose oxidase</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lauda Circulator E100</td><td>Medidor de pH Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orion</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda LiNc-BuO</td><td>Internamente</td><td></td><td>A sonda Octa-n-Butoxi-Naftalocianina foi sintetizada de acordo com a ref 13</td></tr><tr><td>Sonda NR</td><td>Internamente</td><td></td><td>A sonda de Nitroxide foi sintetizada de acordo com a ref 11</td></tr><tr><td>Sonda RSSR</td><td>Internamente</td><td></td><td>A sonda de di-Nitróxido foi sintetizada de acordo com a ref 15</td></tr><tr><td>HOPE sonda</td><td>In house</td><td></td><td>A sonda Triarylmethyl monofoshonada foi sintetizada de acordo com a ref 12</td></tr></tbody></table>

na vivo avaliação de epr de ph, po2, status redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do tumor

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Este protocolo demonstra a capacidade do baixo-campo de ressonância paramagnética electrónica (EPR)-com base em técnicas em combinação com sondas paramagnéticos funcionais para fornecer informações quantitativas sobre o microambiente do tumor química (TME), incluindo p Ó2, status de redox, pH, concentrações de fosfato inorgânico intersticial (Pi) e intracelular glutationa (GSH). Em particular, um aplicativo de uma sonda recentemente desenvolvidos solúvel trityl multifuncional fornece inigualável oportunidade para in vivo medições simultâneas de pH, pO2 e Pi em E espaço de xtracellular (sonda de esperança). As medições de três parâmetros, usando um único teste permitem suas análises de correlação independentes de distribuição sonda e hora das medições.

Tecido p O 2 Sondas de avaliação usando o LiNc-BuO:
Usando o procedimento descrito no passo 1.1, realizamos a calibração da suspensão de microcristais de LiNc-BuO preparado na hora. A Figura 2 mostra a dependência de oxigênio típico do linewidth da sonda o LiNc-BuO, bem como seus espectros EPR ex...

Baixo-campo (L-band, 1.2 GHz) ressonância paramagnética electrónica utilizando sondas de nitroxyl e trityl solúveis é demonstrada para avaliação dos parâmetros fisiologicamente importantes no microambiente do tumor em modelos do rato do cancro da mama.

Na Vivo Avaliação de EPR de pH, pO2, Status Redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

O objetivo geral desta tecnologia de ressonância paramagnética eletrônica in vivo é avaliar quantitativamente e de forma não invasiva os parâmetros fisiologicamente relevantes do microambiente tecidual local em ambientes pré-clínicos em modelos animais de câncer. Esta técnica é baseada na combinação de APR de fluorocampo com sondas paramagnéticas funcionais de design especial para fornecer informações quantitativas sobre a oxigenação tecidual como CDT em status de doca, bem como fosfato orgânico intersticial e concentrações intercelulares. Esta técnica não invasiva fornece uma visão única do mundo do microambiente tumoral e da regênese tumoral e pode contribuir para o futuro design racional de terapias anticancerígenas direcionadas ao microambiente tumoral.A aplicação desta técnica se estende à correlação do cérebro entre os parâmetros de aplicação de sondas APR multifuncionais. Portanto, fornecendo informações adicionais sobre os mecanismos biológicos subjacentes. Além de mim e Andrey, demonstrando o procedimento estarão Marieta Gencheva e Dr.Benoit Driesschaert e uma estudante de pós-graduação, Kayla Steinberger, do IMMR Center.Para preparar a sonda sensível ao oxigênio particulado, primeiro pese 60 miligramas dos microcristais. Para calibração da sensibilidade ao oxigênio, suspenda os microcristais em três mililitros de meios de águia modificados com dolbeckas. Sonicar por cinco minutos, no gelo, com um sonicador de sonda a 20 kilohertz usando sete watts de potência em um tubo de fundo redondo de vidro de cinco mililitros.Em seguida, coloque um mililitro dos microcristais sonicados em um tubo de vidro no ressignificador de bobina de superfície do espectrômetro EPR de banda L. Adquira espectros EPR de ondas contínuas à temperatura fisiológica de 37 graus Celsius e concentrações de oxigênio de zero, um, dois, quatro, oito e 20,9 por cento. Para preparar a sonda de pH e redox de dupla função, dissolva 6,34 miligramas da sonda em um mililitro de solução salina.Ajuste o pH para 7,2 com pequenas alocações de ácido clorídrico ou hidróxido de sódio usando um medidor de pH. Para realizar a calibração do pH da sonda de nitróxido, primeiro adicione 0,1 mililitro da solução estoque da sonda a 0,9 mililitros de tampão fosfato de sódio de dois milimolares, cloreto de sódio 150 milimolar. Em seguida, titular a solução de sonda milimolar obtida com doses de ácido clorídrico ou hidróxido de sódio até o pH necessário, utilizando um medidor de pH.Registre os espectros EPR das amostras em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro usando o espectrômetro EPR de banda L. Para preparar a sonda RSSR sensível ao GSH, dissolva 4,05 miligramas da sonda em um mililitro de solução de DMSO. Em seguida, determine o valor da constante de taxa da reação de RSSR com GSH.Para fazer isso, primeiro adicione 20 microlitros da solução estoque RSSR a 0,98 mililitros de um tampão fosfato milimolar pH 7,2, cloreto de sódio 150 milimolar para obter uma solução de sonda RSSR 0,2 milimolar. Em seguida, misturar volumes iguais de solução de RSSR a 0,2 milimolares numa das soluções de GSH para uma concentração final da sonda a 0,1 milimolar e de GSH a 0,5, um ou 2,5 milimolares. Imediatamente após a mistura da solução RSSR e GSH, colocar a amostra no ressignificador EPR e registar os espectros EPR de 12 em 12 segundos durante 10 minutos.Em seguida, calcule a cinética do aumento da amplitude espectral monorradical para a sonda multifuncional HOPE para avaliação do pH do oxigênio e Pi. Dissolver 10,7 miligramas da sonda num mililitro de solução salina e ajustar o pH para 7,4. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução estoque preparada a 0,98 mililitros da solução salina para obter uma solução de sonda 0,2 milimolar.Para a calibração do pH da sonda, titular 0,2 milimolar da solução da sonda pela adição de um pequeno volume de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico, de modo que a diluição final da amostra seja inferior a 1% Adquira os espectros de EPR em pH intermediário, conforme descrito no protocolo de texto. Para calibração da sonda de sensibilidade ao oxigênio, adquira espectros EPR da sonda em várias concentrações de oxigênio, conforme descrito no protocolo de texto. Para calibração da sonda de Pi, adquira espectros de EPR da sonda em várias concentrações de fosfato.Use a solução radical com um valor de pH próximo ao PKA e titule-a com várias concentrações de fosfato. Mantenha a temperatura e a composição do gás como antes. No caso do modelo de tumor MET1 para internalização da sonda particulada em células MET1, adicione 100 microlitros da suspensão sonicada a um frasco T75 com 10 mililitros de meios de cultura contendo células MET1.Todos os procedimentos ocorrem em um gabinete de biossegurança e o meio contém penicilina e estreptomicina para minimizar possíveis infecções. Incube as células a 37 graus Celsius por 72 horas ou até atingirem aproximadamente 80% de confluência. Aspire o meio e lave as células cinco vezes com 10 mililitros de PBS.Retire as células com cinco mililitros de tripson EDTA. Depois de coletar as células e centrifugar como antes, corar a amostra de células do corante de exclusão para determinar a viabilidade e a quantidade celular. Suspenda as células a uma concentração de um milhão de células por 100 microlitros em DMEM mínimo.Usando uma seringa de insulina, injete lentamente 100 microlitros da suspensão celular contendo os microcristais internalizados nas almofadas de gordura mamária número quatro de um camundongo do tipo selvagem, fêmea de oito semanas de idade, conforme descrito no protocolo de texto. Monitore a iniciação e o crescimento do tumor. Para medições espectroscópicas de EPR, anestesiar os camundongos por inalação de mistura de isofolano a ar usando uma máquina de anestesia, conforme descrito no protocolo de texto.Realize medições funcionais usando um espectrômetro EPR de banda L, colocando o ressignificador de bobina de superfície em uma glândula mamária normal ou em um tumor mamário. Prossiga para ajustar o espectrômetro. No caso de sondas solúveis, adquira os espectros EPR imediatamente após a injeção da sonda por cinco a 10 minutos.Adquira os espectros de EPR da sonda de partículas implantada por cinco a 10 minutos durante várias semanas após o implante. Por fim, analise os espectros de EPR e as sondas conforme descrito no protocolo de texto. A sensibilidade espectral EPR da sonda LiNc-BuO particulada ao oxigênio é mostrada aqui.O espectro EPR foi medido a 0% de pO2 e 37 graus Celsius. Dependentes representativos da largura da linha do espectro EPR da suspensão da sonda na pressão parcial de oxigênio. A largura da linha aumenta linearmente com pO2.Um espectro medido no tecido tumoral mamário de um camundongo fêmea anestesiado corresponde ao oxigênio parcial do tecido de 7,5 milímetros de mercúrio. Os espectros de EPR de banda L da solução de sonda NR foram adquiridos a 37 graus Celsius em vários níveis de pH. Os dependentes da constante de divisão hiperfina observada no pH são plotados e ajustados com a curva de titulação padrão.Aqui é mostrada a avaliação multifuncional do microambiente tumoral combinando a sonda LiNc-BuO sensível ao oxigênio na sonda de pH de dupla função em NR redox. O espectro triplo observado do NR é sobreposto com a única linha EPR da sonda LiNc-BuO embutida no tumor. A avaliação in vivo da EPR das concentrações de glutationa no tecido intracelular é mostrada aqui.A cinética da mudança de intensidade de pico espectral monorradical medida por EPR de banda L em tumor mamário na glândula mamária normal de camundongos FVBN imediatamente após a injeção intratissual da sonda RSSR é mostrada. A cinética mais rápida reflete a maior concentração de GSH no tecido tumoral. A técnica auxilia os investigadores no campo da pesquisa do câncer com oportunidade insuperável para a realização in vivo de parâmetros fisiológicos celulares importantes do microambiente tumoral e o transpotencial para a tradução.Os sensíveis das sondas de acordo com os procedimentos anteriores requerem experiência em química sintética e são críticos para a apresentação. Nosso centro relatou a dificuldade dessa tecnologia e aos sites de forma colaborativa.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Imagem de bioluminescência de hipóxia induzida a atividade do fator-1α é aplicada para monitorar o desenvolvimento hipóxia intracraniana tumor em um câncer de mama modelo de cérebro de rato metástase.

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

Aqui, o monitoramento em tempo real do metabolismo das células tumorais, combinado com um modelo de metástase de membrana corio-alantóide (CAM) de embrião de galinha in vivo, é usado para avaliar novos alvos/agentes anticancerígenos quanto à sua capacidade de sensibilizar células tumorais a quimioterápicos prejudiciais ao DNA.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Um novo método de ressonância paramagnética eletrônica (EPR), rápidas digitalização EPR (RS-EPR), é demonstrado para 2D imagens espaciais espectral, que é superior à técnica tradicional de onda contínua (CW) e abre novos espaços para imagiologia in vivo. Os resultados são demonstrados a 250 MHz, mas a técnica é aplicável em qualquer frequência.

Rápida digitalização ressonância paramagnética eletrônica abre novos caminhos para criação de imagens fisiologicamente parâmetros importantes<em&gt; In Vivo</em

Este manuscrito descreve o desenvolvimento de um modelo animal que permite testar diretamente os efeitos da hipóxia tumoral na metástase e decifrar os mecanismos de sua ação. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem no sarcoma de Ewing, uma abordagem semelhante pode ser aplicada a outros tipos de tumores.

No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral

Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

Espectroscopia de ressonância paramagnética (EPR) de elétrons é um método inequívoco para medir radicais livre. A utilização de sondas de rotação seletiva permite detecção de radicais livres em diferentes compartimentos celulares. Apresentamos um método prático e eficiente para coletar amostras biológicas que facilitam a tratar, armazenar e transferir amostras para medições de EPR.

Uso de ressonância paramagnética electrónica em amostras biológicas em temperatura ambiente e 77 K

Nós descrevemos dois métodos para avaliar a permeabilidade vascular transiente associada com o microambiente do tumor da função da entrada da metástase (TMEM) e da intravasação da pilha de cancro usando a injeção intravenosa do dextrano high-molecular do peso (155 kDa) nos ratos. Os métodos incluem a imagem latente intravital em animais vivos e a análise fixa do tecido usando a imunofluorescência.

Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

Desenvolvemos um método reprodutível para visualizar a internalização do triphosfato fluorescente nãohydrolyzável (ATP), um substituto da ATP, com alta resolução celular. Validamos nosso método usando linhas celulares tumorais in vitro e in vivo e camundongos imunodeficentes xenoenxerados com tecido tumoral humano.

Microscopia de Fluorescência para Internalização ATP Mediada por Macropinocistose em Células tumorais humanas e camundongos tumorais-xenorgrafados

Descrevemos um protocolo para produção, cultura e visualização de cânceres humanos com metástase para as superfícies peritoneais. Os espécimes tumorais ressecados são cortados com vibratótomo e cultivados em insertos permeáveis para aumento da oxigenação e viabilidade, seguidos de análises de imagem e a jusante usando microscopia confocal e citometria de fluxo.

Cultura e Imagem de Cortes Extraviais de Tumor Organotípico de Pseudomixoma Peritonei Ex Vivo de Espécimes Tumorais Humanos Ressecados

Mapas quantitativos de oxigênio 3D de tumores murinos foram fotografados de forma não invasiva usando ressonância paramagnética eletrônica de pulso. Ultrassom modo B e Power Doppler foram usados para anatomia e estrutura vascular. As imagens de ambas as modalidades foram sobrepostas, permitindo a análise multiparamétrica do tumor.

Avaliação da hipóxia tumoral: imagens de oxigênio 3D in vivo por ressonância paramagnética eletrônica 

Aprenda a avaliar parâmetros do microambiente tumoral usando ressonância paramagnética de elétrons in vivo em modelos de câncer de mama. Esta técnica não invasiva fornece dados quantitativos sobre oxigenação tecidual e status metabólico.

Na Vivo Avaliação de EPR de pH, pO₂, Status Redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do Tumor

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