Name: Síntese de monócitos-direcionamento do Peptide Amphiphile micelas para a imagem latente da aterosclerose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a sintetizar micelas de peptídeos anfifílicos direcionadas a monócitos para imagem de aterosclerose. Este método permite diferenciar lesões em estágios iniciais e avançados com alta especificidade.

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Os autores gostaria de agradecer o apoio financeiro da University of Southern California, o coração nacional, pulmão e Instituto de sangue (NHLBI), R00HL124279, Eli e Edythe amplo Innovation Award e o L.K. Whittier Fundação Non-câncer Prêmio de pesquisa translacional concedida a EJC. Os autores agradecer o centro de microscopia eletrônica e microanálise, centro de excelência em NanoBiophysics, centro de excelência para a caracterização Molecular e Translational Imaging Center na Universidade de Southern California para assistência em configurações de instrumentais.

Nota: Leia o MSDS para reagentes e siga todas as medidas de segurança química, conforme exigido pela instituição local.
1. preparação de MCP-1 PAMs
<ol><li>
Preparação de peptídeo de MCP-1
	<ol>
<li>Pesar 0,25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang em uma embarcação da reação (RV). Enxágue o lado do VD com 5 mL dimethylforamide (DMF) em uma coifa de química.</li>
		<li>Carrega o RV em um sintetizador de peptídeo de bancada automatizada. Frascos de aminoácido de carga pré-embalados, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', do C a N-terminal. Incluem um frasco vazio no final para a etapa final de desproteção. Nota: Um peptide mexido com sequência, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', pode também ser sintetizada utilizando o mesmo protocolo.</li>
		<li>Finalizada a síntese, transferi os peptídeos na resina do RV para o frasco de cintilação com 2-3 mL de metanol até todas as resinas são transferidas. Depois que a resina afundou-se no fundo, remover o sobrenadante de metanol e evaporar o restante até secar. Vácuo seco para um adicional 2 h ou durante a noite em temperatura ambiente.</li>
		<li>Fazer 12 mL de solução de clivagem contendo trifluoracetic ácido (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 vol % em uma coifa de química. Agite a solução de clivagem para certificar-se que uniformemente misturado. Cuidado: Porque triisopropylsilane e Etanoditiol são sensíveis ao ar, argônio limpar estoque frascos de triisopropylsilane e Etanoditiol por 1 min antes de colocá-los de volta.</li>
		<li>Coloque o recipiente de síntese (SV) em um agitador de braço pela metade do SV de aperto na parte inferior. Transferência do peptide-resina para o SV com 2 mL de solução de clivagem até que todos os peptídeo-resinas são transferidos.</li>
		<li>Lave os lados do SV com 3 mL de solução de clivagem. Feche a tampa do SV e agitar em 300 oscilações/min durante 4 h.</li>
		<li>Pese um tubo de centrifugação de 50 mL vazio. Recorde a massa.</li>
		<li>Após 4 h, drene a solução de peptídeo clivada de SV no tubo de centrífuga de 50 mL. Enxágue o SV várias vezes com o restante da solução clivagem.</li>
		<li>Evapore a solução de peptídeo clivados com nitrogênio até há menos de 4 mL restantes no tubo de centrífuga.</li>
		<li>Adicione 36 mL de éter gelada para a solução de peptídeo-fendida.</li>
		<li>Vórtice a solução até que ele é completamente branca ou amarela. Centrifugar a 3.000 x g por 5 min a 4 ° C e decante o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione éter gelada de 40 mL para o tubo. Vórtice e proceda à sonicação novamente. Repita o processo de centrifugação. Decante o sobrenadante.</li>
		<li>Seca o sedimento de PA bruto com purgação com gás nitrogênio até o éter é evaporado visivelmente.</li>
		<li>Adicionar 20 mL bidestilada água, vórtice e proceda à sonicação até o peptídeo é completamente dissolvido em solução.</li>
		<li>Congelar a solução e lyophilize até secar.</li>
		<li>Uma vez seco o peptídeo, pese a massa do tubo de centrífuga contendo o peptídeo bruto. Dissolva o peptídeo bruto em 5 mg/mL de água.</li>
		<li>Dissolva 25 mg de bruto do peptide de MCP-1 em 5 mL de água bidestilada para fazer uma concentração total de 5 mg/mL. Purificar o peptídeo de MCP-1 bruto por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) utilizando 0,1% TFA em água (solvente A) e 0,1% TFA em acetonitrila (solvente B) como fases móveis em uma coluna de fase reversa C8. Os 5 mL do peptide injete a HPLC. Nota: A fase móvel inicial consistia em 100% solvente A um débito de 9,0 mL/min. diminuir solvente A lentamente para 30% em 27 min e manter esta composição de 3 min. o gradiente de solvente 100% de retorno um 3 min e espera para esta composição para 1 min dar um tempo de execução total de 34 min. manter a temperatura da coluna a 55 ° C. Use o modo de fonte de íon positivo para a análise. Ácido fórmico pode ser usado no lugar do TFA, se TFA é muito ácido para a coluna HPLC. Recomenda-se que a velocidade de subida de composição solvente orgânico não deve exceder 2%/min para melhor separação.</li>
		<li>Analise cada fração usando espectrometria de massa do laser assistida por matriz (MALDI) de dessorção/ionização o produto esperado m/z no 2.890. Nota: Dissolver ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos a 1 mg/mL em acetonitrila/água (50: 50% de vol) como a solução de matriz. Aviste 0,75 µ l da solução de matriz na chapa de MALDI, seguida de 0,75 µ l de cada fração. Realizar a análise utilizando um modo reflexivo de íon positivo em uma faixa de massa de 500-5.000 Da.</li>
		<li>Combine fracções de produto, explodir acetonitrilo, congelar e lyophilize peptídeos purificados até secar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de MCP-1 PA
	<ol>
<li>Prepare um excesso molar 1.1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide de peptídeo em frascos separados de cintilação. Dissolver os dois compostos em água bidestilada tornar ~ 15 mg/mL. Proceda à sonicação por 15 min ou até que ambas as soluções são completamente claras. Nota: DSPE-PEG (2000)-Cy5 é sintetizado usando o mesmo protocolo com DSPE-PEG-amina (2000) e N-Hidroxisuccinimida (NHS) acrescida de éster Cy5, exceto passo 1.2.3, onde o pH da solução é ajustado para 8,5.</li>
		<li>Adicione DSPE-PEG (2000)-maleimide solução para a solução de peptídeo. Vórtice e proceda à sonicação.</li>
		<li>Adicionar 1 M NaOH gota a gota (1 µ l) de cada vez até que o pH da solução é 7.</li>
		<li>Solução de expurgo de nitrogênio por 5 min. agitar a solução durante a noite.</li>
		<li>Congelar a solução e lyophilize até secar.</li>
		<li>Uma vez seco o produto bruto, dissolva o sólido em 5 mg/mL de água.</li>
		<li>Purifica com HPLC como descrito acima. Nota: Na Unconjugated peptídeo e DSPE-PEG(2000) eluir entre 15-30% de concentração orgânica (% vol), enquanto DSPE-PEG (2000)-MCP-1 conjugado deve eluir entre 40-50% de concentração de orgânicos.</li>
		<li>Analise cada fração usando espectrometria de massa MALDI para o correspondente m/z DSPE-PEG (2000)-MCP-1 deve ter um pico m/z amplo no 5.760. Nota: o ácido benzoico-2,5 é melhor usado como matriz para DSPE-PEG (2000)-MCP-1 com MALDI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem de MCP-1 PAMs
	<ol>
<li>Dissolver 1,75 mg PAs de MCP-1, com 3 mL de metanol em um frasco de dram com 1. Proceda à sonicação até o MCP-1 PA é completamente dissolvido. Nota: Amphiphiles Cy5 podem ser incorporados em uma relação molar de 10:90 MCP-1 PA para aplicativos de imagem.</li>
		<li>Evapore o metanol sob nitrogênio em movimentos circulares enquanto enxaguar o restante metanol fora do frasco até um filme uniforme é formado na parte inferior do frasco. Vácuo-seco o filme durante a noite.</li>
		<li>Hidrate o filme com 3 mL de tampão de água ou fosfato salino (PBS) para fazer uma solução de 100 µM de MCP-1 PAMs. Suavemente o vórtice e proceda à sonicação a solução até que desobstruído. Incube a 80 ° C por 30 min. Nota: A temperatura elevada tem sido mostrada para acelerar o processo auto-montagem e permite que o componente de peptídeo formar a estrutura secundária mais estável, reduzindo a concentração (CMC) de crítica micelle42,43.</li>
		<li>Legal a dispersão resultante a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. caracterização de MCP-1 PAMs
<ol><li>
Difusão dinâmica da luz (DLS) e potencial zeta
	<ol>
<li>Lugar de 100 µM de MCP-1 PAM ou mexida PAM em uma cubeta de acordo com as instruções do instrumento potencial DLS ou zeta. Nota: DLS e zeta potenciais cubetas podem ser diferentes com base nas instruções do instrumento.</li>
		<li>Equilibrar o instrumento à temperatura ambiente. Medir o tamanho e carga superficial do PAM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
	<ol>
<li>Adicionar 7 µ l de 50 µM MCP-1 PAM ou mexida PAM para um grid TEM suspensos dentro de uma pinça de auto-fechamento 5 min. pavio fora a gota com uma limpeza delicada tarefa.</li>
		<li>Adicione 7 µ l de água para lavar a grade. Pavio-embora o droplet.</li>
		<li>Adicione 7 µ l de ácido fosfotúngstico 1 wt % por 2 min. pavio fora da gota. Repita a etapa 2.2.2.</li>
		<li>Seque a grade TEM antes da análise de temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Espectroscopia de Dicroísmo circular (CD)
	<ol>
<li>Ligue o nitrogênio por 5-10 min antes da utilização do instrumento.</li>
		<li>Coloque 300 µ l de espaço em branco (água ou PBS) na cubeta.</li>
		<li>Medir espectros no 190-265 nm, 0.2 mm-comprimento do percurso com um tempo de integração s 1 e uma largura de 1, banda nm na temperatura ambiente. Colete 3 repetições.</li>
		<li>Peptídeo de MCP-1 medida de 100 µM, MCP-1 PAM, mexidos do peptide e mexidos PAM sob a mesma condição descrita na etapa 2.3.3. Subtrai o espaço em branco.</li>
		<li>Ajuste os dados usando uma interpolação linear dos espectros de base polylysine.</li>
		<li>Desligue o instrumento. Espere 10 min antes de desligar o nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. análise in Vitro de MCP-1 PAMs
<ol><li>
Biocompatibilidade in vitro
	<ol>
<li>Cultura e expandir WEHI 274.1 murino monócitos em modificado Eagle suplementado de Dulbecco com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina-estreptomicina e 0,05 mM 2-Mercaptoetanol em 37 ° C abaixo de 5% de CO2 para passagem 5. Nota: WEHI 274.1 são células de suspensão. Quando o cultivo, a mídia deve ser alimentada a cada 2-3 dias.</li>
		<li>Monócitos de pipeta nos meios de comunicação em um tubo de centrífuga de 50ml estéril. Centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Aspirar a velha mídia e ressuspender em mídia fresco 10 mL no tubo de centrífuga. Misture lentamente até que as células são distribuídas uniformemente na mídia. Conte as células com coloração azul trypan e um hemocytometer.</li>
		<li>Dilua as células que existem 4.000 monócitos por 90 µ l de mídia por bem. Adicione 90 µ l de células em poços de uma placa de 96 poços. Incube durante 24 h. Nota: Evite usar os poços na borda exterior da placa para evitar diferenças de evaporação e mudanças térmicas na placa. Encha os poços exteriores com 100 µ l PBS.</li>
		<li>Dissolva 0,15 µmol de peptídeo MCP-1, PAM de MCP-1, peptídeo mexido ou ovos mexidos-PAM em 150 µ l PBS, em separado, esterilizado microcentrifuga tubos. Realize uma diluição serial para fazer 65 µ l de 1, 10 e 100 µ m de cada amostra.</li>
		<li>Adicionar 10 µ l PBS de cada concentração em poços contendo WEHI 274.1 (total volume: 100 µ l por bem, 6 linhas, 96 poços totais). Incube durante 72 h.</li>
		<li>Adicionar 10 µ l (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) em cada poço. Incube durante 1 h.</li>
		<li>Analisar a absorvância usando um leitor de placas em 490 nm ou com base nas instruções do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vinculação de micela em vitro
	<ol>
<li>Monócitos de semente 500.000 em cada poço de uma placa de 6 em 2 mL de mídia contendo 100 µM Cy5-rotulado PAM de MCP-1 (10:90 razão molar de DSPE-PEG (2000)-Cy5 e MCP-1 PA). Incube durante 1 h.</li>
		<li>Coletar WEHI 274.1 por centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire os meios de comunicação.</li>
		<li>Resuspenda e lavar as células em 2 mL de PBS. Centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire a PBS. Repita o processo de lavagem com 2 mL de PBS. Aspire a PBS.</li>
		<li>Adicione 2 mL de frio paraformaldeído 4% para consertar as células. Incube a temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Pipetar as células fixas sobre uma lamela de vidro estéril dentro poços de uma placa de 6. Centrifugar a 400 x g durante 5 min.</li>
		<li>Remova o paraformaldeído. Lave e enxágue com 2 mL de PBS uma vez. Resuspenda com 1 mL de PB Nota: Quando enxaguar, evite perturbar as células no sentido da lamela.</li>
		<li>Colocar 10 µ l de 90% de glicerol em PBS para um slide. Use uma agulha e uma pinça para pegar a lamela. Seque a extremidade da lamela. Coloque delicadamente a lamela numa lâmina voltada para baixo.</li>
		<li>Selo gentilmente a extremidade da lamela com esmaltes claros. Coloque na geladeira até que esteja pronto para a imagem latente.</li>
		<li>Usar um laser confocal microscópio (CLSM) instalado com lasers para Cy5 em λexcitação = 650 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Os autores não têm nada para divulgar.

MCP-1 PAMs são uma promissora plataforma de imagem molecular, consistindo de um peptídeo alvo hidrofílico e cauda hidrofóbica que impulsiona a natureza Self montada das nanopartículas. Este micelle monócito-direcionamento pode ser preparado por síntese simples e etapas de purificação de peptídeo de MCP-1 e DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs têm muitas características benéficas na vivo imagem molecular tais como seus auto-montagem sob condições suaves, biodegradabilidade intrínseca e diversidade estrutural e química, pe...

As doenças cardiovasculares continuam a ser as principais causas de morte globalmente com aproximadamente 17,3 milhões de mortes em todo o mundo1. Doenças cardiovasculares são contribuídas por aterosclerose, uma condição em que acumulam placas nas artérias, inibindo assim, sangue e fluxo de oxigênio para as células do corpo2,3. A progressão da aterosclerose envolve o espessamento e endurecimento das artérias por uma resposta inflamatória, metabolismo lipídico irregular e acúmulo de placa bacteriana, levando a placa ruptura e infarto do miocárdio,4,5. Células endoteliais expressam moléculas de aderência e citocinas, que incluem MCP-1 que se liga ao receptor chemokine CC (CCR2) encontrado na superfície de monócitos6,7,8. Colesterol oxidado converte os monócitos em macrófagos durante a fase inicial da formação de placa bacteriana, que amplifica a resposta inflamatória na região e leva à lesão tecidual e a formação de placas instáveis ou vulneráveis9, 10.
Tradicionalmente, a aterosclerose é avaliada através da avaliação de estenose luminal por imagens anatômicas usando ultra-som ou angiografia11,12. No entanto, esses métodos somente podem determinar estreitamento grave da parede arterial e não na fase inicial da aterosclerose, como crescimento de placa inicial provoca remodelamento arterial manter o tamanho da artéria e sangue fluxo taxa12,13, 14. Portanto, angiografia sub-representar prevalência de aterosclerose. Além disso, técnicas de imagem não-invasivas, tais como emissão de fóton único computadorizada tomografia computadorizada, ressonância magnética e tomografia por emissão de pósitrons recentemente tem sido usados para caracterizar a morfologia da placa, como eles podem fornecer detalhes iniciais e caracterização de placas. No entanto, estas modalidades são muitas vezes limitadas pela falta de sensibilidade, resolução espacial, ou exigem o uso de radiação ionizante, fazendo a progressão de placa de imagem em diferentes fases muito mais desafiador15,16, 17. Um sistema de entrega de imagens que iria identificar especificamente placas em diferentes estágios da aterosclerose permanece para ser desenvolvido.
As nanopartículas têm demonstrado ser uma plataforma emergente para na vivo placa diagnóstico e direcionamento18,19,20,21. Em particular, PAMs são vantajosas devido a sua diversidade química e capacidade para acomodar uma variedade de partes, composições, tamanhos, formas e superfície functionalization22. Amphiphiles peptídeo (PAs) consistem de um peptídeo hidrofílico, "headgroup" anexado a uma cauda hidrofóbica, que normalmente são lípidos; Essa estrutura anfifílica confere capacidades auto-montagem e permite uma visualização multivalentes dos peptídeos na superfície da partícula22,23,24. O headgroups de peptídeo pode afetar a forma das partículas através de dobramento e hidrogénio entre peptídeos25. Peptídeos que dobra através da interação de β-folha têm sido mostrados para formar micelas alongadas, enquanto confirmação α-hélice pode formar ambos micelas esféricas e alongadas22,23,24, 2526,de,27. Polietileno glicol (PEG) linkers que protegem a carga superficial do peptide podem ser colocados entre o peptídeo hidrofílico e cauda hidrofóbica do PAMs, aumentando a disponibilidade da nanopartículas na circulação sistêmica28, 29 , 30 , 31. PAMs também são vantajosas porque são biocompatíveis e tem sido demonstrados que têm uma ampla gama de aplicações de32,33. A solubilidade em água de micelas oferece uma vantagem sobre outros sistemas baseados em nanopartículas como certas nanopartículas poliméricas que não são solúveis em água e tem que ser suspenso em solubilizers para injeções34. Além disso, a capacidade de criar PAMs que desmontagem em resposta a um estímulo específico torna PAMs um candidato atraente para drogas intracelular controlada entrega35.
Vinculando-se ao receptor CCR2 e acumular-se no arco aórtico, PAMs anteriormente foram desenvolvidas para monócitos direcionamento para monitorar diferentes fases de lesões ateroscleróticas na aorta9. Em ApoE- / - ratos, acúmulo de monócitos aumenta proporcionalmente a placa progressão36. Além disso, verificou-se que pacientes com estágio final, sujeitos a ruptura de placas contêm quantidades mais elevadas de monócitos37. Portanto, a modificação do PAMs incorporar MCP-1 é útil porque permite maior especificidade de segmentação e diferenciação entre lesões ateroscleróticas e tarde-estágio inicial. Estes estudos de prova de conceito também verificado que PAMs são seguras o suficiente ser usado em pré-clinicamente e são limpas em38. Desde que os monócitos e inflamação são característicos de outras doenças, MCP-1 PAMs têm o potencial para ser usado para aplicações de diagnósticos e terapêuticas em outras doenças além da aterosclerose8,39,40 , 41.
Neste documento, nós relatamos a fabricação de altamente escalável e self montado MCP-1 PAMs que demonstrou o tamanho ideal da partícula, carga de superfície e seleção de alvos para monócitos para aplicativos de imagem aprimorados em aterosclerose.

<table><tbody><tr><td>1,2-etanodital</td><td>VWR</td><td>E0032</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>10 mL pipetas serológicas descartáveis</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>tubos de centrífuga de 15 mL, polipropileno</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>para várias aplicações</td></tr><tr><td>Ácido 2,5-di-hidroxibenzóico, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165200050</td><td>para MALDI</td></tr><tr><td>25 mL descartável pipetas serológicas</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol, 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>5 mL pipetas serológicas descartáveis</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>tubos de centrífuga de 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>para várias aplicações</td></tr><tr><td>Balão de cultura de 75 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>75 mL de vaso de reação</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 96 poços</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td>para ensaio MTS</td></tr><tr><td>Acetonitrila, grau HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>para purificação por HPLC</td></tr><tr><td>Vidro de borossilicato, 1 dram</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>para síntese de PAM</td></tr><tr><td>Pipeta de vidro borosicado, pontas compridas</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>para várias aplicações</td></tr><tr><td>Lamínula, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>para microscopia</td></tr><tr><td>confocal Cy5 amina</td><td>Abcam</td><td>ab146463</td><td>para conjugação peptídica</td></tr><tr><td>Éter dietílico, grau ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>para precipitação peptídica</td></tr><tr><td>Descartável seringas, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td>para purificação de HPLC</td></tr><tr><td>Duplo hemocitômetro neubauer governado</td><td>VWR</td><td>63510-13</td><td>para contagem</td></tr><tr><td>de células DSPE-PEG (2000) amina</td><td>Avanti</td><td>880128P</td><td>para conjugação de peptídeos</td></tr><tr><td>DSPE-PEG (2000) maleimida</td><td>Avanti</td><td>880126P</td><td>para conjugação de peptídeos</td></tr><tr><td>DSPE-PEG (2000) -NHS éster&nbsp;</td><td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td><td>para conjugação com Cy5</td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle médio-alto glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, qualificado, inativado por calor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438026</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-A</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-RBF</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-NT</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-CT</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-QT</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-I</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-L</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-KBC</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-F</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-SB</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-TB</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-YB</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-V</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Resina Fmoc-Lys(Boc)-wang, malha 100-200</td><td>856013 Novabiochem</td><td></td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Ácido fórmico, ótimo grau LC/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>para purificação por HPLC</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td><td>para microscopia confocal</td></tr><tr><td>Contador de contagem manual</td><td>Fisher Scientific</td><td>S90189</td><td>para contagem de células</td></tr><tr><td>Barras de agitação magnéticas, VWR</td><td></td><td>58949-006</td> em forma de <td>ovo para conjugação de peptídeos</td></tr><tr><td>Metanol, certificado ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>para síntese de PAM</td></tr><tr><td>Kit de ensaio colorimétrico de proliferação celular MTS</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>para ensaio MTS</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida, grau de sequenciamento</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>N-metilmorfolina</td><td>Protein Technologies</td><td>S-1L-NMM</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416780250</td><td>para fixação de células</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>para várias aplicações</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina, 10.000 U/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>Vaso de síntese de peptídeos, 25 mL& nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>CG186011</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A248-25</td><td>para TEM</td></tr><tr><td>Espectro de Piperidina</td><td></td><td>P1146-2.5LTGL</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio de vidro simples 75 x 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>para microscopia confocal</td></tr><tr><td>Reservatórios de reagentes, estéreis&nbsp;</td><td>VWR</td><td>95128093</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>Pinça de fechamento automático</td><td>TedPella</td><td>515</td><td>para TEM</td></tr><tr><td>Filme de suporte TEM</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td>para TEM</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP618-500</td><td>para clivagem de peptídeos e purificação por HPLC</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5ml</td><td>para clivagem de peptídeos</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano, 0,4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td>para contagem de células</td></tr><tr><td>Pinça, serrilhada de uso geral</td><td>VWR</td><td>231-SA-SE</td><td>para microscopia confocal</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CRL-1679</td><td>monócito murino</td></tr><tr><td>automatizado sintetizador de peptídeos de bancada</td><td>Protein Technologies</td><td></td><td>PS3 Sintetizador de peptídeos de bancada</td></tr> <tr><td>&alfa; - ciano- 4- ácido hidroxicinâmico, 99%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>476870-2G</td><td>para MALDI</td></tr></tbody></table>

síntese de monócitos-direcionamento do peptide amphiphile micelas para a imagem latente da aterosclerose

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

A aterosclerose é dos principais contribuintes para doenças cardiovasculares, a principal causa de morte no mundo, que reivindica a 17,3 milhões de vidas anualmente. A aterosclerose é também a principal causa de morte súbita e infarto do miocárdio, instigada por placas instáveis que se romper e obstruir o vaso sanguíneo sem aviso. Corrente de imagens modalidades não pode diferenciar entre placas estáveis e instáveis que se romper. Micelas de amphiphiles peptídeo (PAMs) podem superar esta desvantagem, como eles podem ser modificados com uma variedade de direcionamento metades que ligam especificamente ao tecido doente. Os monócitos foram mostrados para ser marcadores início da aterosclerose, enquanto grande acúmulo de monócitos é associado com placas propensas a ruptura. Daí, nanopartículas que podem direcionar os monócitos podem ser usadas para discriminar os diferentes estágios da aterosclerose. Para esse fim, descrevemos aqui, um protocolo para a preparação de monócitos-direcionamento PAMs (monócitos quimiotático proteína-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs self são montadas através de síntese em condições suaves a forma nanopartículas de 15 nm de diâmetro, com perto de carga de superfície neutra. In vitro, PAMs foram encontradas para ser biocompatível e tinha uma afinidade de ligação de alta para os monócitos. Os métodos descritos neste documento são promissores para uma ampla gama de aplicações em aterosclerose, bem como outras doenças inflamatórias.

Preparação de MCP-1 PAM O CCR2-motivo (resíduos 13-35) da proteína de MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] ou mexido peptídeo [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] foi modificado com a adição de um resíduo de cisteína na N-terminal. O peptídeo de MCP-1 foi sintetizado por um método de fase sólida Fmoc-negociada usando um sintetizador de peptídeo automatizado. O peptídeo bruto foi purificado por HPLC de fase reversa em uma coluna de C8 a 50 ° C, utilizando 0,1% TFA em misturas acetonitri...

Este trabalho apresenta um método que envolve a síntese e caracterização de micelas de amphiphile peptídeo monócito-direcionamento e o correspondente ensaios para testar a capacidade do micelle para vincular a monócitos e biocompatibilidade.

Síntese de monócitos-direcionamento do Peptide Amphiphile micelas para a imagem latente da aterosclerose

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

O objetivo geral deste protocolo é sintetizar micelas anfifílicas de peptídeos direcionados a monócitos para imagens de aterosclerose. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo cardiovascular sobre o diagnóstico por imagem da placa aterosclerótica. A principal vantagem desta técnica é que a incorporação de micelas anfifílicas peptídicas com MCP-1 permite uma maior especificidade de direcionamento e diferenciação entre lesões ateroscleróticas em estágio inicial e tardio.As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de placa em diferentes estágios da aterosclerose, pois pacientes com placas propensas a ruptura em estágio avançado contêm maior número de monócitos. Embora esse método possa fornecer informações sobre a aterosclerose, ele também pode ser aplicado a outras doenças, como o câncer. Demonstrando o procedimento comigo estará Jonathan Wang, um estudante de pós-graduação de nosso laboratório.Comece pesando 0,25 milimoles de resina fmach-L-lisina-bach-wong em um recipiente de reação. Transfira o recipiente para uma capela de exaustão química e enxágue as laterais do vaso com cinco mililitros de dimetilforamida. Carregue o recipiente de reação e os frascos de aminoácidos pré-embalados do terminal C-to-N em um sintetizador de peptídeos de bancada automatizado, incluindo um frasco vazio na extremidade para a configuração final de desproteção.Depois de executar a síntese, transfira os peptídeos e a resina do vaso de reação para um frasco de cintilação contendo dois a três mililitros de metanol até que toda a resina tenha sido transferida. Quando a resina tiver afundado no fundo do frasco, remova o supernano e deixe a resina secar ao ar, seguida de secagem a vácuo por pelo menos duas horas em temperatura ambiente. Quando o frasco estiver completamente seco, use um grampo para prender a metade inferior de um vaso de síntese em um agitador de braço e adicione dois mililitros de solução de clivagem ao frasco de cintilação.Transfira todo o volume de resina peptídica para o vaso de síntese e lave as laterais do vaso com três mililitros de solução de clivagem fresca. Em seguida, agite o recipiente, tampado, por quatro horas a 300 oscilações por minuto. No final da incubação agitada, drene a solução peptídica clivada em um tubo cônico de 50 mililitros com peso equilibrado e lave o vaso de síntese várias vezes com a solução de clivagem restante.Evapore a solução peptídica clivada com nitrogênio até que restem menos de quatro mililitros de solução no tubo de centrífuga e adicione 36 mililitros de éter gelado à solução clivada peptídica. Vortex a solução resultante. Quando a suspensão ficar completamente branca ou amarela, pulverize os peptídeos por centrifugação.Ressuspenda o peptídeo em 40 mililitros de éter gelado e vórtice e sonice o peptídeo novamente. Após uma segunda centrifugação e decantação do sobrenadante, secar o pellet anfifílico peptídico bruto com purga de nitrogênio gasoso. Quando o éter tiver evaporado visivelmente, adicione 20 mililitros de água bidestilada ao tubo e ao vórtice e sonice o tubo até que o peptídeo esteja completamente dissolvido em solução.Congele a solução e lifelize até secar. Em seguida, pesar novamente o tubo e dissolver o peptídeo bruto em cinco miligramas por mililitro de água. Em seguida, injete todo o volume do peptídeo MCP-1 bruto em um instrumento de cromatografia líquida de alta eficiência ou HPLC.Analise cada fração usando espectroscopia de massa de ionização por dessorção a laser assistida por matriz para a carga de massa do produto esperada em 2.890. Em seguida, combine as frações do produto. Sopre a acetonitrila e congele e lifelize os peptídeos purificados até secar.Para preparar os anfifílicos ou PAs do peptídeo MCP-1, primeiro dissolva o peptídeo vitalizado em 15 miligramas por mililitro de água e combine a solução peptídica com 15 miligramas por mililitro de solução de milimeto DSPE PEG 2000. Adicione um mol de hidróxido de sódio gota a gota até que o pH da solução seja igual a sete. Em seguida, purgue o nitrogênio por cinco minutos, seguido de agitação durante a noite.Na manhã seguinte, congele e lifelize a solução. Quando o produto bruto estiver seco, dissolva o sólido em cinco miligramas por mililitro de água e purifique o peptídeo por HPLC, como acabamos de demonstrar. Para montar as membranas de PA, dissolva 1,75 miligramas dos PAs MCP-1 em três mililitros de metanol em um frasco de uma dose e sonice até que o PA MCP-1 esteja completamente dissolvido.Evapore o metanol sob nitrogênio enquanto move o frasco em movimentos circulares e enxágue o metanol restante das laterais do frasco, até formar uma película uniforme no fundo. Seque o filme a vácuo durante a noite. Na manhã seguinte, hidrate o filme com três mililitros de água para fazer uma solução de PAM MCP-100 micromolar de 100 micromolares e suavemente vórtice e sonicate a solução até ficar clara.Incubar a solução a 80 graus Celsius durante 30 minutos e, em seguida, arrefecer a dispersão resultante. No experimento representativo a seguir, o MCP-1 e o peptídeo embaralhado foram purificados por HPLC de fase reversa em uma coluna de CA a 50 graus Celsius usando ácido trifluoroacético a 0,1% em misturas de água acetonitrila. E caracterizado por espectrometria de massa de ionização por dessorção a laser assistida por matriz, como acabamos de demonstrar.Peptídeos contendo desistentes foram conjugados em miliamida DSPE PEG 2000 para produzir conjugados peptídicos DSPE PEG 2000 por meio de uma ligação tioéter e purificados por HPLC usando uma coluna C4. A análise dinâmica de espalhamento de luz e a imagem de microscopia eletrônica de transmissão dos monócitos direcionados aos PAMs revelaram nanopartículas esféricas bem dispersas com potenciais zeta ligeiramente positivos. A análise de espectroscopia de dicroísmos circulares confirmou que a incorporação do peptídeo MCP-1 dentro da micela aumentou a estrutura secundária.A incubação de monócitos amalse com concentrações de até 100 micromolares de peptídeo MCP-1, MCP-1 PAM, peptídeo embaralhado e PAM mexido por 72 horas demonstrou a viabilidade e biocompatibilidade dos peptídeos. A ligação específica dos monócitos aos PAMs MCP-1 em comparação com os PAMs embaralhados é então estabelecida por microscopia confocal. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar a micela anfifílica do peptídeo direcionado ao monócito por meio da síntese e purificação do peptídeo MCP-1 e da preparação do peptídeo MCP-1 anfifílico e da montagem da micela.Não se esqueça de que trabalhar com reagente químico pode ser extremamente perigoso e que devem ser sempre tomadas precauções, como ler a FISPQ e trabalhar dentro de um exaustor químico.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Para demonstrar imagem molecular do câncer MR com um pequeno peptídeo alvo MRI agente de contraste específico para proteínas do plasma coagulado no estroma tumoral em um modelo de câncer de próstata do rato.

MR Imagem Molecular do cancro da próstata com um pequeno Molecular CLT1 Peptide alvejado agente de contraste

Um exemplo de uma droga baseada em nano ácido polymalic é apresentado para o desenho racional de medicina personalizada que é aplicável para o cancro. Ela descreve a síntese de um fármaco nano para tratar o cancro da mama humano HER2-positivos em um ratinho nu.

À base de ácido Polymalic Nano Biopolímeros para Segmentação de múltiplos marcadores tumorais: uma oportunidade para a medicina personalizada?

Mostramos a preparação e abordamos a viabilidade de veículos celulares contendo nanobastões de ouro para a imagem fotoacústica do câncer.

Preparação e Fotoacústica Análise de Veículos celulares contendo ouro nanobastões

tecnologia de microondas permite a síntese extremamente rápida de nanopartículas de óxido de ferro para a caracterização placa de aterosclerose. O uso de um aminobifosfonado no lado externo da nanopartícula fornece uma acumulação rápida na área aterosclerótica.

Síntese orientada por microondas de óxido de ferro nanopartículas para detecção rápida de Aterosclerose

Para fornecer medicamentos contra o câncer a locais de tumor com alta especificidade e efeitos colaterais reduzidos, são necessários novos métodos baseados em nanopartículas. Aqui, descrevemos micelas reticuladas de dissulfeto que podem ser facilmente preparadas por oxidação mediada por peróxido de hidrogênio e são capazes de se dissociar eficientemente sob um ambiente tumoral redutor para liberar cargas úteis.

Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

Peptídeos virais-derivado acoplados ao anticorpo-conjugados (ACs) é uma abordagem ganhando impulso devido ao potencial de entregar cargas moleculares com acumulação de células de tumor aumento. Utilizando métodos comuns para avaliar a conjugação do peptide, AC e acúmulo intracelular de carga e direcionamento do tumor, este protocolo ajuda pesquisadores durante as fases de desenvolvimento inicial chave.

Avaliação inicial do anticorpo cojugado modificado com peptídeos virais-derivado para aumentar a acumulação celular e melhorando o direcionamento do Tumor

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

Descreveremos um protocolo para medir transmigração por monócitos em monocamadas endoteliais humanas e sua maturação subsequente em células de espuma. Isso fornece um método versátil para avaliar as propriedades aterogênico de monócitos isoladas de pessoas com doenças diferentes condições e avaliar fatores no sangue que pode melhorar esta propensão.

Quantificação de transmigração de monócitos e formação de célula de espuma de indivíduos com doenças inflamatórias crônicas

Aqui nós apresentamos um protocolo para quantificar a atividade Quimiotáticos de monócitos do sangue em modelos do rato, para avaliar os efeitos de intervenções nutritivas, farmacológicas e genéticas no monocyte do sangue e para caracterizar os macrófagos derivados do sangue dos monócitos em modelos de mouse usando o monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-carregado porão membrana-derivado gel plugs.

Quantificação da atividade quimiotática de monócitos in vivo e caracterização de macrófagos derivados de monócitos sanguíneos

Aqui nós descrevemos o uso de uma auto-montagem 3-dimensional andaime para a cultura humana células progenitoras neurais. Nós apresentamos um protocolo para liberar as células da scaffolds a serem analisados ​​posteriormente por exemplo, por citometria de fluxo. Este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de células para realizar estudos detalhados mecanicamente.

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

Aprenda a sintetizar micelas de peptídeos anfifílicos direcionadas a monócitos para imagem de aterosclerose. Este método permite diferenciar lesões em estágios iniciais e avançados com alta especificidade.

Síntese de monócitos-direcionamento do Peptide Amphiphile micelas para a imagem latente da aterosclerose

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