Fluxo de trabalho abrangente para a identificação de todo o genoma e Meta-análise da expressão da ATL E3 ubiquitina Ligase Gene família em videira

O objetivo geral deste procedimento é obter uma caracterização exaustiva de uma família de genes em plantas para uma abordagem global, incluindo a definição da estrutura do gene, motivos proteicos em questão, localização cromossômica, duplicações de genes e padrões de expressão. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na classificação de plantas em famílias, como a identificação genômica mundial de membros da família e sua transcriptomia fornece isso por meio da análise da expressão gênica. A principal vantagem de todo o procedimento é fornecer uma lista exaustiva de etapas experimentais para obter uma caracterização completa da família de genes.

Este procedimento pode ser aplicado a qualquer família de genes de qualquer espécie de planta para a qual haja dados genéticos disponíveis. Além disso, essa abordagem fornece informações valiosas para identificar candidatos interessantes para estudos funcionais. Demonstrando todo o procedimento estará Pietro Ariani do meu laboratório.

Abra a página da web do Blast e clique na seção de explosão de proteínas. No campo inserir sequência de consulta, insira a sequência de aminoácidos da proteína que será usada como sonda para identificar os outros membros da família. Use uma proteína que tenha todas as características importantes que caracterizam a família.

Em seguida, no campo escolha o conjunto de pesquisa, selecione o banco de dados de proteínas de referência e o organismo de interesse. Agora, na seleção do programa de campo, selecione o algoritmo PSI-BLAST. Se desejar, clique nos parâmetros do algoritmo para ajustar parâmetros avançados, como sequência máxima de destino e matriz de pontuação.

O valor E é o limite, que para essa pesquisa é reduzido de 005 para 001. Clique no botão BLAST para executar a análise. De todas as sequências que exibem correspondências relativas à consulta, desmarque as entradas que claramente não pertencem à família.

Para tal, clique na marca de seleção na coluna selecionar para PSI-BLAST. Em seguida, execute uma segunda iteração do PSI-BLAST clicando no botão ir. Todas as sequências recém-identificadas serão destacadas em amarelo.

Novamente, desmarque as ocorrências que não pertencem à família. Continue esse processo até que o algoritmo não encontre nenhuma entrada relevante ou atinja a convergência. Depois que todos os falsos positivos forem eliminados, colete as sequências de aminoácidos em um arquivo formatado FASTA e carregue o arquivo no pacote de software de bioinformática.

Em seguida, selecione todas as sequências importadas na lista e clique no botão alinhar/montar na barra de ferramentas. Em seguida, clique em emparelhar alinhamento múltiplo e selecione Alinhamento MUSCULAR e OK. O alinhamento agora será feito usando os padrões. Agora visualize o logotipo da sequência do alinhamento e inspecione os genes visualmente para procurar falsos positivos.

Uma análise mais aprofundada dos parâmetros e domínios físicos das proteínas, distribuição cromossômica, duplicações e organização do íntron do éxon são descritas no protocolo de texto. Em seguida, analisamos as relações entre os membros da família ATL por meio da construção de uma árvore filogenética de alta qualidade e da definição de uma nomenclatura familiar. Primeiro, recupere as sequências ATL da systeliana adotada árabe, necessárias como referências para uma nomenclatura de genes de videira, do banco de dados UmoProt para referência.

Em seguida, faça um arquivo FASTA incluindo todas as sequências de nucleotídeos da videira e os membros da família do gene Arabidopsis para a análise filogenética. Agora navegue na página inicial da filogenia França e selecione o pipeline de análise de filogenia. Um clique é adequado na maioria dos casos, mas se necessário, é possível selecionar configurações avançadas específicas usando as opções avançadas ou até mesmo uma análise totalmente personalizada usando as opções à la carte.

Em seguida, insira um nome para a análise e carregue o arquivo FASTA. Em seguida, clique em enviar para executar a análise. Se esse procedimento resultar em uma mensagem de erro, conclua cada etapa do pipeline do conjunto de filogenia individualmente.

Primeiro, vá para a página inicial do software MUSCLE e carregue o arquivo FASTA. Selecione Pearson FASTA como formato de saída e envie. Em seguida, baixe o arquivo no formato FASTA e elimine quaisquer posições mal alinhadas.

Abra a ferramenta do servidor G-block, carregue o arquivo FASTA de alinhamento, selecione DNA como tipo de sequência e escolha o rigor que melhor se encaixa na análise. Para um alinhamento da família de genes ATL da videira de uva, selecione todas as três opções propostas para uma seleção menos rigorosa devido à alta divergência de sequência. Em seguida, clique em obter blocos para executar a análise.

Para salvar os resultados, clique no alinhamento resultante na parte inferior da página de saída e crie um novo arquivo FASTA. Os blocos G eliminam a posição mal alinhada em regiões divergentes de um DNA ou estimulam o alinhamento para que se tornem mais adequados para uma análise filogenética. Para esta etapa, a seleção de parâmetros impericilos para o rigor das colunas é crucial para garantir que elas sejam uma responsabilidade das três.

Para completar a árvore, recorremos à página inicial da Phylogeny France. Lá, selecione o pipeline à la carte e desmarque as seguintes opções:alinhamento múltiplo e curadoria de alinhamento. Em seguida, clique em criar fluxo de trabalho, carregue o arquivo FASTA com curadoria de blocos G, selecione o procedimento de inicialização e use os parâmetros e configurações padrão.

Por fim, clique em enviar para executar a análise. Isso conclui o processo passo a passo. Agora que a árvore filogênica foi feita, recolha os galhos mal suportados com valores de bootstrap inferiores a 70%Em seguida, baixe os resultados finais no formato Newick para uma análise mais aprofundada.

O protocolo de texto fornece instruções sobre como atribuir um nome de gene com base na filogenia. Para este protocolo, crie um arquivo de formato de texto com toques e linhas de valores de expressão normalizados por arma retirados de uma biblioteca de expressões gênicas. Organize os valores de cada gene da família nas mesmas linhas de padrão.

Em seguida, execute a análise hierárquica bi-clusterizada usando o software visualizador de vários experimentos. Primeiro, carregue a matriz de dados de trabalho e selecione o arquivo de texto. Selecione a matriz de cor única e remova a marca de seleção da anotação de carga quando uma anotação automática não for fornecida.

Selecione o valor de expressão superior esquerdo da visualização da tabela de expressões e clique no botão carregar. Em seguida, ajuste os dados, aplicando a transformação Log2 e a normalização gene/linha. Em seguida, defina o limite de escala adequado.

Agora calcule o agrupamento hierárquico. No campo de otimização de ordenação, selecione otimizar a ordem das folhas do gene e otimizar a ordem das folhas da amostra. Em seguida, no campo de seleção do método de ligação, selecione agrupamento de ligação média e, no campo de seleção da matriz de distância, escolha Correlação de Pearson.

Em seguida, clique em OK para executar a análise. Visualize os resultados no painel esquerdo da janela e exporte o mapa de calor clicando em salvar imagem no menu do arquivo. O gene mais semelhante ao arabidopsis thaliana ATL2, de acordo com uma pesquisa BLAST-P, foi usado para pesquisar os membros da família ATL no genoma da videira.

A análise PSI BLAST convergiu após alguns ciclos, fornecendo uma lista de genes putativos na família de genes. A presença do domínio H2 do anel canônico para cada candidato foi avaliada pela inspeção visual do alinhamento MUSCLE. Isso reduziu a pesquisa a 96 genes de videira.

Uma análise filogenética dos genes identificados comparando-os com a família de genes ARABIDOPSIS ATL foi usada para uma nomenclatura. 13 de 96 ATLs de videira receberam um identificador específico como um ortólogo do gene ARABIDOPSIS ATL. O mapeamento dos genes identificados para o atlas global de expressão gênica da videira usando uma análise hierárquica bi-agrupada mostrou que todos os 96 são expressos em pelo menos um tecido e cinco clusters de expressão podem ser identificados.

Uma abordagem semelhante foi aplicada para estudar a expressão desses genes em resposta a estresses bióticos. Houve envolvimento direto da família de genes ATL em resposta à infecção por patógenos, com 62 genes mostrando uma modulação significativa em pelo menos duas condições. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como lidar com os softwares usados para caracterizar uma família de genes.

Ao tentar este procedimento, é importante definir cuidadosamente as características de uma determinada família de genes e a sonda correspondente usada para a identificação de todo o membro da família do genoma. Seguindo este procedimento, é possível investigar a evolução da família de genes e a função do P30 fazendo árvores filogenéticas adicionais com base em algumas espécies diferentes das espécies necessárias para a atribuição da nomenclatura das famílias de genes.