Name: Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprenda a isolar mitocôndrias funcionais de Arabidopsis thaliana para estudar respiração e metabolismo energético vegetal. Este método permite obter organelas puras a partir de pequenas quantidades de tecido.

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Este estudo foi suportado por um australiano Conselho centro de excelência em pesquisa na planta de energia CE140100008 de biologia, um australiano Conselho futuro bolsa de pesquisa (FT130100112) para MWM e uma bolsa de pesquisa Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fundação, Alemanha) de JS.

Este protocolo é usado para a isolação de mitocôndrias intactas de órgãos de Arabidopsis thaliana cultivadas em solo usando gradientes de densidade colloidal contínua. A coleta do material a seguir todos os procedimentos são realizados a 4 ° C.
1. preparação de moagem média, Wash Buffer e soluções de gradientes
<ol><li>Preparar 300 mL de moagem média (menos ascorbato e cisteína) e 200 mL de tampão de lavagem 2 x por tabela 1 um dia antes do isolamento, mantê-los frios a 4 ° C. Nota: Adicione ascorbato de sódio e L-cisteína (base livre) a uma concentração final de 17,84 e 20,36 mM, respectivamente, para o meio de moagem na manhã do isolamento. Se as mitocôndrias são a ser usado para o borrão ocidental ou nativo-poliacrilamida azul gel análises de eletroforese (BN-página), compõem 2x do tampão de lavagem sem BSA.</li>
	<li>Prepare-se gradientes na manhã do isolamento mitocondrial (Figura 1 e tabela 1).<ol>
<li>Fazer as soluções gradientes pesadas e leves dois copos; 35 mL de cada uma é suficiente para dois tubos de gradientes.</li>
		<li>Lave as câmaras do gradiente com bico e peristáltico tubos de PVC com água desionizada e garantir o mesmo fluxo através do tubo do tubo todas.</li>
		<li>Colocar 2 tubos de centrífuga (50 mL) em um ângulo ligeiro no gelo com as tomadas de tubulação peristáltica PVC colado no interior dos tubos para assegurar que a solução de gradiente é executada pelo lado dos tubos.</li>
		<li>Feche a conexão entre as câmaras internas e externas (manípulo preto para baixo). Coloque o gradiente com bico em um agitador magnético com um bar pequeno rebuliço na câmara interna.</li>
		<li>Despeje a 35 mL de solução de gradiente pesado a câmara interna (câmara com saída de tubulação). Dispense o pesado gradiente de solução para os tubos de dois centrífuga colocados no gelo até metade está permanecendo com a taxa de bomba peristáltica definida como rápida (300 mL/h).</li>
		<li>Despeje a 35 mL de solução de gradiente luz câmara exterior (câmara sem saída de tubulação). Abrir a conexão entre as câmaras (alavanca de empurrão preto acima do outro) e permitir soluções misturar suavemente. Misture as soluções usando o agitador magnético.</li>
		<li>Permitir que as soluções executar lentamente (60 mL/h) até que todos da mistura gradiente tem sido dispensado das câmaras resultando em dois 0 - 4,4% (p/v) polivinilpirrolidona (PVP) preenchido com gradiente tubos. Manter os gradientes no gelo até estar pronto para usar no passo 2.12. Nota: Uma vez que o gradiente foi preparado, diluir 2 x médio e lavagem 1X com prechilled-deionizada e manter fria a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. homogeneização e isolamento mitocondrial
<ol><li>Cortar o tecido todo roseta de 4 semana de idade Arabidopsis plantas cultivadas em solos com uma tesoura, pelo menos 80 plantas serão necessárias para a 1 preparação. Nota: 10-14 dias velho água culturas, mínimo 5 potes/prep, ou 2 - semana velhas mudas cultivadas em placas de ágar de Murashige & Skoog Basal sal mistura (MS), mínimas de 4 placas, também podem ser usadas.</li>
	<li>Coloque metade do material vegetal que foi cortado em pedaços pequenos em um pre-refrigeração a 4 ° C grande pilão com 75 mL de esmeris (tabela 1) e moer extensivamente por vários minutos até que não há grandes pedaços de tecido são deixados.</li>
	<li>Pre-molhado 4 camadas de material de filtragem (22-25 µm poro tamanho) com moagem média e filtrar homogenate através das 4 camadas de material de filtragem através de um funil de plástico num erlenmeyer de 500 mL.</li>
	<li>Triture a restante metade do tecido com outro 75 mL de meio de moagem.</li>
	<li>Combine homogenates nos materiais de filtração e, tanto quanto possível homogenate através do filtro.</li>
	<li>Triture o tecido restante restante sobre o material de filtração novamente com o restante 150 mL de moagem média, filtro novamente para o balão de Erlenmeyer de 500 mL.</li>
	<li>Centrifugue o homogenate filtrada em 8 tubos de centrífuga plástico 50ml pre-refrigerados a 2.500 x g a 4 ° C, em um rotor de ângulo fixo por 5 min.</li>
	<li>Despeje o sobrenadante em tubos de centrífuga limpo (50ml; evitar perturbar a pelota verde) e centrifugar 17.500 x g a 4 ° C por 20 min em um rotor de ângulo fixo.</li>
	<li>Descartar tudo, mas < 3 mL do sobrenadante por aspiração (ou Despeje delicadamente sem perturbar o sedimento). Delicadamente, resuspenda o pellet no sobrenadante residual usando um pincel bem pequeno.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de tampão de lavagem 1x a cada tubo e combinar 4 tubos em 1 tubo limpo (i.e., resultando em 2 tubos).</li>
	<li>Encha esses tubos com tampão de lavagem 1 x 50 ml e repetir os passos 2,7-2,9.</li>
	<li>Piscina brutas pelotas mitocondriais em 1 tubo usando um conta-gotas e dispersarem uniformemente com o pincel fino (uma pequena quantidade de tampão de lavagem pode ser utilizada, mas o volume final deve ser menor que 3 mL para caber no topo do gradiente). Suavemente da camada da suspensão mitocondrial com um conta-gotas para os 2 contínua 0 - 4,4% (p/v) PVP gradientes.</li>
	<li>Equilibrar os tubos por peso (usando o tampão de lavagem 1X) e centrifugar a 40.000 x g a 4 ° C por 40 min. Certifique-se o intervalo estiver desligado. As mitocôndrias migrarão para uma banda na parte inferior do tubo, ou podem estar presentes na solução pesada na parte inferior do tubo (identificado por uma banda nublada, amarelada; A Figura 2).</li>
	<li>Remova cuidadosamente o superior 5 cm da solução acima da faixa mitocondrial por aspiração.</li>
	<li>Distribuir o restante da solução contendo as mitocôndrias em 2 tubos limpos e encha com tampão de lavagem 1X. Distribua uniformemente o gradiente de densidade coloidal e mitocôndrias cobrindo a boca do tubo com uma película de plástico da parafina e invertendo várias vezes. Centrifugar por 15 min a 31.000 x g a 4 ° C, com frenagem lenta. Nota: Antes da centrifugação, certifique-se que as mitocôndrias e o gradiente de densidade coloidal restantes estão distribuídas uniformemente. Caso contrário, o gradiente de densidade coloidal pode concentrar-se na parte inferior do tubo e impedir a granulação das mitocôndrias.</li>
	<li>Retire o sobrenadante por aspiração, preencher o tubo com lavagem 1X buffer até 50 mL e inverter novamente para garantir a mistura. Centrifugar por 15 min a 31.000 x g a 4 ° C, com frenagem lenta.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e recolher as pelotas mitocondriais em como pequeno um volume (~ 500 µ l) possível, usando uma pipeta com modificados 200 µ l dicas, (cortadas a ponta um pouco acima de sua extremidade para aumentar sua abertura). Coloque as mitocôndrias em um tubo de 1,5 mL e manter no gelo para uso imediato ou loja a-80 ° C. Nota: Se mitocôndrias serão usadas para eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE), BN-página, ou análises de immunoblot, usam 1x tampão de lavagem sem BSA para as lavagens finais (ou seja, passo 2.15 e 2.16).</li>
	<li>Determine a concentração de proteína mitocondrial usando o método de Bradford. Nota: Para alíquotas de centrífuga BN-página a 4 ° C e pellet loja a-80 ° C até o uso. Para as medições de consumo de oxigênio, única mitocôndria recentemente isolada pode ser usada.</li>
</ol>3. as medições de consumo de oxigênio
Nota: Consumo de oxigênio pelo recém isolado planta mitocôndrias podem ser analisadas com um eletrodo de oxigênio Clark-tipo, permitindo a determinação da atividade da via alternativa, atividade de via do citocromo c e integridade mitocondrial.
<ol><li>Instalação do software<ol>
<li>Instale oxigênio licenciado que monitora o software para o computador usado para as medições de consumo de oxigênio.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de meio de respiração, substratos, soluções químicas de estoque e o eletrodo de oxigênio tipo Clark<ol>
<li>Prepare o suporte de respiração (300 mM sacarose, 10 mM de NaCl, 5mm KH2PO4, 2mm MgSO4, 0,1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA), 10 mM TES (pH 7,2)) usado para ensaios de consumo de oxigênio.</li>
		<li>Prepare substratos, inibidores e efetores usados para medir a respiração mitocondrial (tabela 2). Estes podem ser preparados anteriormente e armazenados a-20 ° C. Nota: Neutralizar o pH das soluções ácidas tais como ácidos orgânicos com pH 7.0 usando NaOH antes do uso.</li>
		<li>Aquecer o meio de respiração para a mesma temperatura da câmara de ensaio (25 ° C).</li>
		<li>Monte o eletrodo de oxigênio tipo Clark, conforme descrito no protocolo do fabricante.</li>
		<li>Colocar água saturada com ar de 1 mL (água saturada com ar é obtida agitando vigorosamente uma pequena quantidade de água deionizada em um balão de Erlenmeyer grande) na câmara de medição. Para ligar o agitador, clique no botão "Velocidade do agitador". Clique no botão "On" e definir a velocidade do misturador para 65 rpm. Clique em "Okey" para continuar. Misture a água continuamente a 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibração do eletrodo de oxigênio<ol>
<li>Aquecer a água que será usada para a calibração para a mesma temperatura da câmara de ensaio (25 ° C).</li>
		<li>Espere a corrente estabilizar e calibrar o eletrodo de oxigênio.</li>
		<li>Para iniciar a calibração do eletrodo de oxigênio, clique no botão "Calibrar", selecione "Calibração de fase líquida" e "Água saturada de ar."</li>
		<li>Uma nova janela será aberta (oxigênio calibração (fase líquida) - etapa 1 de 5). Selecione o canal para calibrar (o canal que a caixa de controle do eletrodo é anexada ao) e digite variáveis (conjunto "Temperatura de câmara" e 25 ° C e a "Pressão atmosférica"-101.32 kPa). Clique em "Okey" para continuar.</li>
		<li>Na próxima etapa (etapa 2 de 5), a instalação a velocidade do agitador (65 rpm) e clique em "Okey" para continuar.</li>
		<li>Na etapa 3 de 5, aguarde o sinal atingir um platô. O termo "platô atingido, pressione Okey para continuar" irá aparecer na caixa. Clique em "Okey" para continuar.</li>
		<li>Na etapa 4 de 5, estabelece zero oxigênio na câmara adicionando ditionito de sódio 5 mg. Clique em "Okey" para continuar. Nota: Um declínio na concentração de oxigênio deve ser visível no rastreamento e deve chegar a 0.</li>
		<li>Na última etapa de calibração (etapa 5 de 5), aguarde o sinal atingir um platô. O termo "platô atingido, pressione Okey para continuar" irá aparecer na caixa. Clique em "Okey" para continuar.</li>
		<li>Clique em "Salvar a calibração" para salvar a calibragem. Abrirá uma nova janela. Clique em "Okey" para confirmar para salvar a nova calibração para a caixa de controle de oxigênio. Nota: Após a calibração bem sucedida, o rotulagem "oxigênio (nmol/mL)" aparecerá no eixo y.</li>
		<li>Após a calibração, limpe a câmara de medição enxaguando a câmara com água (pelo menos 5 - 10 vezes) para garantir a limpeza apropriada. Coloque 1 mL de meio de respiração para a medição de câmara e permitir que a membrana equilibrar por alguns minutos até que o rastreamento do consumo de oxigênio é linear.</li>
		<li>Adaptar-se a escala do rastreamento do consumo de oxigênio em uma inclinação boa vista. Clique em "Zoom XY" e digite variáveis (posição "Oxigênio" 0 - 300 e o eixo de"tempo" para 0 - 45 min).</li>
	</ol></li>
	<li>Determinação da integridade mitocondrial<ol>
<li>Com êmbolo aberto, adicione meio de respiração de ar saturado 970 µ l para a câmara de reação.</li>
		<li>Adicionar 30 mitocôndrias µ l isolado ou 150 µ g de proteína mitocondrial total conforme determinado após isolamento de mitocôndrias (proteína total deve ser incluído nos cálculos depois) para a câmara de reação, com uma pipeta com uma ponta de corte.</li>
		<li>Agite a suspensão mitocondrial continuamente, utilizando um agitador magnético bar (65 rpm) a 25 ° C ar-saturar a solução.</li>
		<li>Veda-se a câmara com o êmbolo, clique em "Iniciar gravação" para registrar o consumo de oxigênio e permitir o rastreamento do consumo de oxigênio para estabilizar (1-2 min).</li>
		<li>Determine a taxa de consumo de oxigênio manualmente após a adição de ascorbato de 10 mM e 25 µM citocromo c por 5 min obter a taxa de "antes de detergente". Nota: Para rotular a adição de substratos, inibidores e efetores diretamente no rastreamento, clique no botão "Adicionar evento marca" e digite a designação de rótulo correspondente. Clique em "Okey" para continuar.</li>
		<li>Determine a taxa de consumo de oxigênio manualmente por 3 min após a adição de detergente de 0,05% (v/v) para dar a taxa de "depois de detergente". Clique em "Parar gravação".</li>
		<li>Clique no botão "Tabela de taxas de alteração". 2 cursores aparecerão como linhas verticais na tela do gráfico. Clique e arraste o par de cursores de taxa para as posições necessárias no rastreamento para definir o intervalo de taxa. Mova o intervalo de taxa ao longo do rastreamento usando o cursor esquerdo taxa. Defina o intervalo de taxa usando o cursor direito taxa em si. O oxigênio que monitora o software automaticamente desenha uma linha de melhor ajuste entre os dois cursores enquanto movendo os cursores de intervalo de taxa ao longo do traço.</li>
		<li>Uma vez que o intervalo de taxa desejada e a posição foi definido, introduza a taxa na tabela com um clique direito em 1 dos 2 cursores e selecione "Adicionar taxa de tabela". Clique no botão "Adicionar" para confirmar para exibir a taxa na tabela principal taxa.</li>
		<li>Calcular a integridade mitocondrial dividindo a taxa de "antes de detergente" pela "depois detergente" taxa, expressada em percentagem e subtrair-100.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinação da respiração mitocondrial<ol>
<li>Com êmbolo aberto, adicione 970 µ l de meio de respiração de ar saturado para a câmara de reação. Adicione 500 µM ATP e 30 mitocôndrias µ l isolado ou 150 µ g de proteína mitocondrial total usando uma pipeta com uma ponta cortada ao meio de respiração na câmara de reação.</li>
		<li>Agitar a suspensão mitocondrial continuamente, utilizando um agitador magnético bar (65 rpm) a 25 ° C.</li>
		<li>Êmbolo de fechar, clique em "Iniciar gravação" para registrar o consumo de oxigênio e esperar pelo 1-2 min para a taxa de consumo de oxigênio estabilizar (quando o rastreamento do consumo de oxigênio é linear). Adicione o succinato de 5 mM. A taxa de consumo de oxigênio por cerca de 2 min de registro. Nota: Para rotular a adição de substratos, inibidores e efetores diretamente no rastreamento, clique no botão "Adicionar evento marca" e digite a designação de rótulo correspondente. Clique em "Okey" para continuar.</li>
		<li>Adicione 1 mM difosfato de adenosina (ADP). Continue gravando a taxa de consumo de oxigênio por 2 min.</li>
		<li>Adicione 1 mM NADH. Recorde, a taxa de consumo de oxigênio por 4-8 min. Esta taxa é a capacidade de respiração através do citocromo oxidase.</li>
		<li>Adicionar 1 mM cianeto de potássio (KCN) (ou 2,5 µM myxothiazol ou 5 µM antimycin A) para inibir a via de citocromo c e continuar a gravar por cerca de 2 min observar o consumo de oxigênio através da oxidase alternativa.</li>
		<li>Adicione 5 mM ditiotreitol (DTT) e piruvato de 10 mM para ativar completamente a oxidase alternativa. Continuar a gravar por 5-7 min: esta é a capacidade da oxidase alternativa.</li>
		<li>Adicionar 500 µM n-propil galato (nPG) e gravar por 2 min. Este avalia a taxa de consumo de oxigênio residual que não pode ser inibida quimicamente. Subtrai a este ritmo de outras taxas de gravado, que não seja susceptível de ser mitocondrial na origem. Consumo de oxigênio ainda ocorrendo após a inibição do citocromo c e caminho AOX (por KCN e nPG) é muito provável que venha de peroxidases presentes como contaminantes em mitocôndrias isoladas9.</li>
		<li>Clique em "Parar gravação".</li>
		<li>Clique no botão "Tabela de taxas de alteração" e inserir a taxa na tabela com um clique direito em um dos dois cursores e selecione "Adicionar a tabela de taxas". Clique no botão "Adicionar" para confirmar para exibir a taxa na tabela principal taxa. Nota: Quando adicionar efetores dissolvida em solventes orgânicos (ex., antimycin A, nPG, myxothiazol), a câmara e o atuador deve ser lavados com etanol e depois água para garantir a limpeza apropriada.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não há conflito de interesses.

Normalmente, isolamento de mitocôndrias de Arabidopsis deixa rendimentos acima de 3 mg de mitocôndrias de aproximadamente 80-100 3 - 4 semana de idade plantas, embora rendimentos superiores a 5 mg, muitas vezes podem ser alcançados com moagem completa. O rendimento varia com as condições de crescimento e diminui drasticamente, como deixa senesce, embora as mitocôndrias estrutura parece ser bem conservado durante a senescência9. Uma das características mais importantes para obter um bom rendimento ...

A história da pesquisa mitocondrial planta remonta a mais de 100 anos1. Mitocôndrias intactas foram primeiramente isoladas no início de 1950 usando centrifugação diferencial. O advento de um gradiente de densidade coloidal na década de 1980 permitiu a mitocôndria ser purificado sem sofrer ajuste osmótico. Enquanto as mitocôndrias purificadas gradientes são adequadas para os fins mais, devido à sensibilidade de espectrometria de massa, mesmo relativamente menores contaminantes podem ser detectados e podem ser inadequadamente atribuídos uma localização mitocondrial2. O uso de fluxo livre eletroforese pode remover ambos plastidic e Peroxissoma contaminação3, mas o livre fluxo de electroforese é uma técnica altamente especializada e não é necessária para a grande maioria dos estudos. Além disso, quando determinar a localização de uma proteína que precisa ser lembrado que dupla ou múltipla segmentação das proteínas ocorre nas células. Mais de 100 proteínas alvo duplas são descritas por cloroplastos/plastídios e mitocôndrias4e um número de proteínas direcionados para mitocôndrias e peroxissomos são também conhecidos5. Além disso, a re-localização de proteínas sob estímulos específicos, por exemplo, estresse oxidativo, é um tema emergente na célula biologia6. Assim, a localização de proteínas precisa ser considerado no contexto da biologia estudou, e uma variedade de abordagens são usadas para determinar e verificar o local2.
As mitocôndrias são tipicamente isoladas de tecidos vegetais por homogeneização, um equilíbrio é necessário entre quebrar aberto a parede celular para liberar as mitocôndrias e não danificar as mitocôndrias. Tradicionalmente, com batata e couve-flor, homogeneização envolve o uso de aparelhos domésticos de liquidificador/espremedor para fazer um extrato líquido em um buffer com vários componentes para manter a atividade. Isolamento de mitocôndrias de folhas de ervilha, (um material popular para isolamento mitocondrial usando mudas jovens (~ 10 dias de idade), utiliza um liquidificador para lyse pilhas como o material da folha é macio. Com a disponibilidade de linhas de nocaute insercional Arabidopsis thaliana T-DNA, a necessidade de ser capaz de purificar as mitocôndrias para realizar estudos funcionais exigiu o desenvolvimento de métodos para isolar mitocôndrias de folha, raiz ou flor tecido. No geral, os métodos desenvolvidos para outras plantas trabalharam bem7, com a gratificação que moagem do material necessário para ser otimizado. Para Arabidopsis, isto pode ser alcançado em uma variedade de maneiras (veja abaixo) e difere entre os tipos de tecido (raiz contra atirar). O uso do gradiente contínuo também pode ser otimizado como a densidade de mitocôndrias de diferentes órgãos ou fases do desenvolvimento, eles podem migrar de forma diferente. Assim, para a separação máxima a densidade do gradiente pode ser refinada para garantir para alcançar a melhor separação.
Uma vez purificado a mitocôndria pode ser usada para uma variedade de estudos, incluindo experimentos de absorção de proteína e tRNA, ensaios de atividade enzimática, borrão ocidental análises e medições de cadeia respiratória. Mitocôndrias isoladas também podem ser usadas para análise de espectrometria de massa da abundância de proteína. Alvo de reação múltiplas análises (MRM) de monitoramento permite a quantificação de definidas proteínas, mas exigem o desenvolvimento significativo do ensaio. Em contraste, quantificação de dimetil ou outros rótulos de isótopo8, fornece uma abordagem de descoberta em identificar diferenças entre o proteome inteiro que pode ser usado para descobrir novos insights biológicas.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Químico, dissolver em etanol</td></tr><tr><td>anticorpo AOX</td><td>de Tom Elthon Elthon</td><td></td><td>et al., 1989</td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>Ascorbato Oxidase de Cucurbita sp.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td>Albumina química</td></tr> de <tr><td>soro bovino (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSAS 1.0</td><td>Clareza química</td></tr><tr><td>substrato ECL ocidental</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Criterion Géis pré-moldados sem manchas 8-16% 18 Wells</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678104</td><td></td></tr><tr><td>cianeto</td> químico <td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>químico</td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3131</td><td>Ágar Difco Químico</td></tr><tr><td>, granulado</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Químico Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Sal dissódico EDTA</td> químico <td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg B-5 Meio Basal</td><td>Austratec</td><td>G398-100L</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Solução de Vitamina Gamborg (1000x)</td><td>Austratec</td><td>G219-100ML</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Rato IgG (H + L)-HRP Conjugado</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706516-2ml</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Coelho IgG (H + L)-HRP Conjugado</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706515-2ml</td><td>Químico</td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7352-100G</td><td>Sulfato</td></tr> <tr><td></td><td>de magnésio químicoSigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Murashige & Mistura de sal basal Skoog (MS)</td> <td>Austratec</td><td>M524-100L</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Myxothiazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5580</td><td>Chemical, dissolver em etanol</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Ndufs4 anticorpo</td><td>de Etienne Meyer Meyer</td><td></td><td>et al., 2009</td></tr><tr><td>galato de n-propil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td>Chemical, dissolver em etanol</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>Químico, gradiente de densidade coloidal</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona (PVP40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>Cianeto de potássio</td><td>químico Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>Fosfato</td></tr> de <tr><td>potássio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td> químico <td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td> químico <td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td></td></tr><tr><td>Ditionito de sódio</td> químico <td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbato de sódio</td> químico <td>Sigma</td><td>A4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>Succinato</td> químico <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td> química <td>Chem-Supply</td><td>SA030</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfato Químico Tetrassódico (Na4P2O7 &middot; 10H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221368</td><td>Kit</td></tr><tr><td>de Transferência de Nitrocelulose Midi Turbo RTA Químico</td><td>1704271 Bio-Rad</td><td></td><td>Laboratories</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Químico, detergente</td></tr><tr><td>Reagente de Bloqueio Ocidental</td><td>Sigma</td><td>11921681001</td><td></td></tr><tr><td>Equilíbrio Químico</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Copos</td><td>Isolab</td><td>50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-26XP</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>Nalgene</td><td>3117-9500</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Circulador</td><td>Julabo</td><td>1124971</td><td>Anexado a câmara de eléctrodos de oxigénio</td></tr><tr><td>Balão cónico</td><td>Isolab</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Conta-gotas</td><td></td><td>3 mL</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento Funil</td><td>Per Alimenti</td><td>14 cm</td><td>Para filtragem</td></tr><tr><td>Derramador de gradiente</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4120</td><td>Para preparação de gradientes</td></tr><tr><td>Agitador magnético ATE</td><td>VELP Scientifica</td><td>F20300165</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>VWR</td><td>EM475855-1R</td><td>Material de filtração</td></tr><tr><td>Almofariz e pilão</td><td>Jamie Oliver</td><td>Granite, equipamento de 6 polegadas</td><td></td></tr><tr><td>O2view</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td>Software de monitoramento de oxigênio</td></tr><tr><td>Sistema Oxygraph Plus</td><td>Hansatech Instruments</td><td>1187253</td><td>Eletrodo de oxigênio tipo Clark</td></tr><tr><td>Pincel</td><td>Artista primeira escolha</td><td>1008R-12</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>filme de parafina de plástico</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td>F155001</td><td>Para preparação de gradientes</td></tr><tr><td>Tubulação peristáltica de PVC</td><td>Gilson</td><td>F117930</td><td>Para preparação de gradientes</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>VELP Scientifica</td><td>OCB</td><td>Equipamento</td></tr></tbody></table>

isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitocôndrias são organelas essenciais envolvidos em diversas vias metabólicas nas plantas, mais notavelmente a produção de adenosina trifosfato (ATP) a partir da oxidação de compostos reduzidos como o dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADH) e adenina flavina dinucleótido (DANIII2). A anotação completa do genoma de Arabidopsis thaliana tem estabelecido como o mais amplamente utilizado sistema modelo de planta, e assim a necessidade de purificar a mitocôndria de uma variedade de órgãos (folha, raiz ou flor) é necessária utilizar plenamente as ferramentas que estão agora disponíveis para Arabidopsis estudar Biologia mitocondrial. As mitocôndrias são isoladas por homogeneização do tecido usando uma variedade de abordagens, seguido por uma série de etapas de centrifugação diferencial, produzindo uma pelota mitocondrial bruta que é ainda mais purificada usando gradiente de densidade colloidal contínua centrifugação. O material de densidade coloidal é posteriormente removido por várias etapas de centrifugação. A partir de 100 g de tecido foliar fresco, 2-3 mg de mitocôndrias pode ser rotineiramente obtido. Experiências respiratórias com essas mitocôndrias exibir as taxas típicas de 100-250 nmol O2 min-1 mg proteína mitocondrial total-1 (taxa de NADH-dependente) com a capacidade de usar diferentes substratos e inibidores para determinar quais substratos estão sendo oxidados e a capacidade das alternativa e citocromo oxidases terminais. Este protocolo descreve um método de isolamento de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana folhas usando gradientes de densidade colloidal contínua e uma eficiente medições respiratória de mitocôndrias de plantas purificada.

Usando este protocolo, fomos capazes de detectar diferentes proteínas mitocondriais por SDS-PAGE e immunoblotting. Como mostrado na Figura 3A, a proteína isolada do tecido de cultura de água é suficiente para detectar uma banda fraca (2 µ g). Intensidade do sinal aumenta proporcionalmente aos montantes carregados. Por mitocôndrias isoladas de tecidos cultivados em placas (Figura 3B), a resposta ao estresse de luz alta o tratament...

Como as mitocôndrias são apenas uma pequena percentagem da célula vegetal, eles precisam ser purificado para uma gama de estudos. Mitocôndrias podem ser isoladas em uma variedade de órgãos da planta por homogeneização, seguida de centrifugação gradiente diferencial e densidade para obter uma fração mitocondrial altamente purificada.

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

O objetivo geral de isolar mitocôndrias de plantas intactas e puras é estudar a respiração, a composição mitocondrial, a biogênese e o metabolismo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia energética das plantas, como a importância das mitocôndrias e da tolerância ao estresse, sob condições ambientais variáveis. A principal vantagem dessa técnica é que quantidades suficientes de mitocôndrias puras, intactas e funcionais podem ser isoladas de quantidades relativamente pequenas de tecido vegetal.Demonstrando o procedimento estarão Wenhui Lyu e Jennifer Selinski, do meu laboratório. No dia do isolamento mitocondrial, lave o derramador de gradiente e a tubulação peristáltica de PVC com água deionizada para preparar os gradientes. Incline para posicionar dois tubos de centrífuga de 50 mL no gelo, de modo que a saída do tubo peristáltico toque a parede dos tubos.Em seguida, gire a alavanca preta para baixo para fechar a conexão entre as câmaras interna e externa. Coloque o derramador gradiente com a barra de agitação magnética dentro da câmara interna em um agitador magnético. Em seguida, despeje 35 mL de solução de gradiente pesado na câmara interna.Dispensar met

isolation-respiratory-measurements-mitochondria-from-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca...

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

Muitos mRNAs que codificam as proteínas mitocondriais são associados com a membrana exterior mitocondrial. Descreve-se um processo de fracionamento subcelular que visa o isolamento de mitocôndrias de levedura com seus mRNAs e ribossomos associados. Este protocolo pode ser aplicado a células cultivadas sob diversas condições, a fim de revelar os mecanismos de localização de mRNA e tradução localizada perto das mitocôndrias.

Isolamento de mRNAs Associated com mitocôndrias de levedura para estudar mecanismos de regionalização de Tradução

A comparação do potencial da membrana mitocondrial entre as amostras produz informações valiosas sobre o status celular. São descritas etapas detalhadas para isolar mitocôndrias e avaliar a resposta a inibidores e desacopladores usando fluorescência. O método e a utilidade deste protocolo são ilustrados pelo uso de uma cultura de células e modelo animal de estresse celular.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Os métodos apresentados fornecem instruções passo a passo para a realização de uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de músculo esquelético de camundongo. Esses ensaios são capazes de medir mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio mitocondrial em um modelo animal comumente usado.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

Aqui, apresentamos uma modificação de um método relatado anteriormente que permite o isolamento de mitocôndrias purificadas e de alta qualidade de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo. Este procedimento resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com alta função durante ensaios respiratórios baseados em microplacas.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Aqui, uma amostra de músculo quadríceps é retirada de um porco anestesiado e as mitocôndrias são isoladas por centrifugação diferencial. Em seguida, as frequências respiratórias dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial são determinadas por meio de respirometria de alta resolução.

Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

É fornecido um protocolo de alta produtividade para a esterilização superficial de sementes arabidopsisthaliana (Arabidopsis), otimizando as etapas de manuseio líquido com um simples dispositivo de sucção construído com uma bomba de vácuo. Centenas de amostras de sementes podem ser esterilizadas em um dia.

Método de alta produtividade, robusto e altamente flexível para esterilização superficial de sementes arabidopsis

Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.

Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos

Descrevemos uma abordagem para medir mudanças na eficiência fotossintética em plantas após tratamento com baixo CO2 usando fluorescência de clorofila.

Avaliação da Eficiência Fotossintética em Mutantes Fotorrespiratórios por Análise de Fluorescência de Clorofila

A viabilidade e a eficácia de métodos scRNA-seq de alto rendimento anunciam uma era de célula única na pesquisa de plantas. Apresentamos aqui um procedimento robusto e completo para o isolamento de tipos específicos de células de raízes de Arabidopsis thaliana e posterior construção e análise da biblioteca de transcriptomas.

Isolamento e Análise do Transcriptoma de Tipos Celulares Vegetais

Aprenda a isolar mitocôndrias funcionais de Arabidopsis thaliana para estudar respiração e metabolismo energético vegetal. Este método permite obter organelas puras a partir de pequenas quantidades de tecido.

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

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