Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)

O objetivo geral deste protocolo é caracterizar os processos iniciais de desenvolvimento cerebral de células precursoras neurais humanas de maneira rápida e reprodutível e definir os efeitos de importantes fatores extracelulares na regulação desses processos. Este método pode ajudar a abordar questões importantes nos campos da neuropsiquiatria e distúrbios do neurodesenvolvimento, como todos os indivíduos afetados têm a mesma anormalidade celular ou, alternativamente, cada um exibe a disfunção específica de uma pessoa? A principal vantagem do nosso protocolo é que ele é rápido, altamente reprodutível e fácil de implementar.

Embora esse método possa ser usado para fornecer informações sobre distúrbios do neurodesenvolvimento, ele também pode ser usado para estudar distúrbios neurodegenerativos e neuropsiquiátricos, como Alzheimer e depressão. A demonstração visual de alguns desses métodos é necessária, pois algumas técnicas envolvem a movimentação de células de um prato para outro ou requerem análises morfológicas que são melhor comunicadas por meio de demonstração visual. Para levantar as células precursoras neurais humanas, aspire o meio e lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato 1X.

Aspire a solução salina tamponada com fosfato e adicione 500 microlitros de solução de descolamento de células 1X a um poço com as células precursoras neurais. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta P1000 para adicionar 500 microlitros de solução salina tamponada com fosfato mantida em temperatura ambiente para lavar e remover as células.

Em seguida, transfira as células em solução salina tamponada com fosfato para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave o poço novamente com um mililitro de solução salina tamponada com fosfato e transfira a lavagem para o tubo. Em seguida, gire as células a 300 G por cinco minutos para formar o pellet.

Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um a cinco mililitros de meio DMEM F12 pré-aquecido. Placa 100.000 células em poços triplicados em uma placa de 24 poços. Após 46 horas, adicionar timidina tritiada ao meio de cultura e incubar a 37 graus Celsius durante duas horas.

Em seguida, após remover o meio, adicione 300 microlitros de EDTA de tripsina a 0,25% pré-aquecido e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius para separar as células e liberar o DNA. Em seguida, ligue o coletor de células e ligue. Coloque um papel de filtro no coletor de células.

Continue coletando os tubos do coletor de células em uma bandeja vazia em branco. Em seguida, pressione a pré-lavagem para molhar o papel de filtro. Coloque os tubos coletores em poços de amostra e comece.

Use uma fonte de luz quente para secar o papel de filtro e arrume os frascos correspondentes na bandeja. Perfure chads de papel nos frascos e, em seguida, adicione dois mililitros de coquetel de cintilação líquida a cada frasco. Incubar os frascos durante uma hora no contador de cintilação antes de utilizar a máquina para obter as contagens por minuto de cada amostra que reflicta a síntese activa de ADN.

Semeie 500.000 células em uma placa de cultura de 35 milímetros. Em seguida, agite o prato em todas as direções para distribuir uniformemente as células. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por 46 horas.

Em seguida, adicione dois microlitros por mililitro de cinco EdU milimolares à cultura e incube por duas horas. Em seguida, dissocie e pelete as células. Ao pellet celular, adicione três mililitros de meio de expansão a 30% com ou sem fatores de crescimento ou drogas.

Coloque um mililitro da suspensão celular nos pratos pré-revestidos e incube a placa a 37 graus Celsius por duas horas. Para estudar o número de células precursoras neurais em cultura, após dois dias, rotular e preparar tubos de microcentrífuga. Em seguida, aspire o meio do poço e adicione 200 microlitros de solução de descolamento de células 1X e incube a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Após o descolamento da célula, adicione 300 microlitros de solução salina tamponada com fosfato 1X a cada poço. Use uma pipeta P1000 para pipetar a solução de células várias vezes e retire as células da placa. Em seguida, transfira a solução celular para o tubo preparado de 1,5 mililitro e inverta o tubo duas a três vezes.

Usando uma pipeta, retire 50 microlitros de células até a metade do tubo e adicione à solução de azul de tripano em um tubo de 0,5 mililitro. Em seguida, conte as células usando um hemocitômetro. Para formar a neuroesfera, pipete um mililitro de meio de expansão a 100% em um prato de 35 milímetros sem nenhum substrato de revestimento.

Em seguida, adicione um milhão de células precursoras neurais em cada uma dessas placas e incube a placa a 37 graus Celsius por 48 a 96 horas. Para preparar a placa para a migração da neuroesfera, dissolva alíquotas de gel imitador de ECM em seis mililitros de meio de expansão a 30%. Adicione um mililitro de gel imitador de ECM com 30% de meio de expansão em um único poço de uma placa de seis poços.

Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para plaquear as neuroesferas, use uma pipeta para coletar as células do meio do prato de 35 milímetros e transferi-las para um tubo cônico. Em seguida, gire o tubo a 100 G para pellet as neuroesferas.

Em seguida, ressuspenda o pellet em um a três mililitros de meio de expansão pré-aquecido a 30%. Em seguida, pipete 200 microlitros das neuroesferas ressuspensas na placa de seis poços contendo o gel imitador de ECM com meio de expansão de 30% e balance a placa. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 48 horas.

Aspire o gel imitador de ECM com meio de expansão a 30% e, em seguida, fixe as células por 30 minutos usando paraformaldeído a 4%. Para analisar as neuroesferas, capture imagens usando configurações de contraste de fase com ampliação de 10X. Use o software NIH ImageJ para medir a migração média das neuroesferas.

No ImageJ, use a ferramenta de linha à mão livre para traçar o contorno externo da neuroesfera. Em seguida, use a função de medida para calcular a área de rastreamento e trace a massa celular interna da esfera. Subtraia a massa celular interna da área total da neuroesfera para quantificar a migração média.

A coloração imunocitoquímica foi feita para estudar a expressão de proteínas do citoesqueleto e fatores de transcrição como SOX2, PAX6 e nestina em células precursoras neurais na passagem três. Em seguida, imagens de contraste de fase foram capturadas para identificar as células portadoras de neuritos. A partir da imagem, as células com processos iguais ou maiores que dois corpos celulares são consideradas portadoras de neuritos, enquanto as células com processos menores que dois corpos celulares não são consideradas portadoras de neuritos.

Para confirmar a formação da neuroesfera, foram capturadas imagens de contraste de fase que mostram que as neuroesferas coletadas no ponto de tempo de 72 horas têm entre 80 micrômetros e 120 micrômetros de tamanho e, portanto, podem ser usadas para ensaio de migração. Para definir a capacidade proliferativa, as células precursoras neurais foram cultivadas em condições de controle ou fator de crescimento de fibroblastos e coradas para a presença de EdU. As imagens fluorescentes de contraste de fase mostram que as células tratadas com fator de crescimento de fibroblastos têm uma proporção maior de células envolvidas na fase S, conforme mostrado pela coloração EdU.

Em seguida, para verificar o crescimento de neuritos, as células foram testadas em condições de controle e comparadas com PACAP. Imagens de contraste de fase foram capturadas e mostram um aumento no número de células com neuritos sob tratamento com PACAP. Em seguida, para entender a migração da neuroesfera, as células foram tratadas com neuropeptídeos PACAP.

As imagens de contraste de fase obtidas mostram aumento da migração da neuroesfera em comparação com o controle. Nosso protocolo contém muitas técnicas e ensaios, cada um exigindo diferentes quantidades de tempo. Após o domínio, o ensaio médio pode levar de duas a três horas para ser configurado e de 30 minutos a três horas para ser analisado.

Ao realizar esses procedimentos, é fundamental garantir que você esteja usando células precursoras neurais de alta qualidade e que essas células estejam completamente dissociadas e uniformemente distribuídas em todas as condições, com exceção do ensaio da neuroesfera. Após esses procedimentos, outras análises podem ser realizadas, incluindo Western blotting, QRT-PCR, transcriptômica, proteômica e metabolômica, a fim de caracterizar os mecanismos subjacentes. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.