Name: Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar progenitores neurais cerebelares para análise de modificações epigenéticas H3K79me2 durante o desenvolvimento cerebral. Este método permite estudar marcações histona in vivo em regiões específicas do cérebro.

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Agradecemos Henriette Bertemes ajudando a estabelecer o protocolo de cultivo CGN dentro do laboratório. Este papel método foi suportada pela DFG-financiado CRC992 médica epigenética financiamento para TV. Os autores reconhecem o apoio da equipe Galaxy Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning e Prof Rolf Backofen, bioinformática, Universidade de Freiburg, Alemanha, financiado pela colaboração pesquisa centro 992 médica epigenética (grant DFG SFB 2012 992/1) e o Ministério Federal alemão de educação e pesquisa (BMBF concessão 031 A538A RBC (de. NBI)).

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<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).</li>
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<li>Ng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+within+the+globular+domain+of+histone+H3+by+Dot1+is+important+for+telomeric+silencing+and+Sir+protein+association%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association.</a> Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).</li>
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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente

Há duas maneiras principais para realizar a imunoprecipitação da cromatina para detectar a ocupação genômica de modificações do histone, fatores de transcrição, leitores de código de histona, escritores ou borrachas. Um é o método de ChIP nativo usando nuclease digerida, cromatina nativa para a imunoprecipitação, e o outro é o método apresentado usando cromatina PFA-fixas, distorcida, em que os nucleosomes e outras proteínas DNA-inscritos são ligados covalentemente ao DNA 39. ChIP nativo com sua t...

As funções cognitivas, motor e sensoriais do cérebro são altamente complexo e suscetível a mudanças físicas e ambientais. O cérebro é composto por três partes gerais o hind-, mid-e prosencéfalo, que estão profundamente ligados. Dentro do posencéfalo, o telencéfalo pode ser dividido em um telencéfalo dorsal (DT) e um telencéfalo ventral (VT). O DT de ratos consiste de seis camadas corticais que são formadas entre E11.5 e E18.5 em uma maneira de "dentro para fora"1. O VT inclui as Eminências ganglionar em desenvolvimento, que mais tarde formam o gânglio basal2,3. Vários tipos de células podem ser classificados no sistema nervoso central dos mamíferos como neurônios, astrócitos ou oligodendrócitos4, que se desenvolvem em uma maneira temporo-espacial5. Primeiro, as células progenitoras neurais (NPCs) dão origem a diferentes tipos de neurônios, interneurônios no VT e os neurônios de projeção no DT e mais tarde sobre células gliais (por exemplo, astrócitos6). Durante o desenvolvimento cortical, a camada mais superficial (camada mim), que contém células de Cajal-Retzius, é formado em primeiro lugar. Então, entre E12.5 e E14.5, NPCs geram camadas mais profundas neuronais (VI, V) enquanto entre 14,5 e 16.5, progenitores dão origem a camada superior (IV-II) neurônios7,8. Identidade neuronal é especificada por programas de transcriptional temporo-espacial induzida por morphogen diferentes e, adicionalmente, por programas epigenéticas2.
O cerebelo, que está implicado na coordenação motora, situa-se no rombencéfalo e se desenvolve entre E10 e aproximadamente P20 em ratos9. Ele contém o córtex cerebelar e os núcleos Cerebelares10. O córtex cerebelar adulto consiste de três camadas, a camada mais externa de molecular, a camada de células de Purkinje e a camada mais interna granular contendo neurônios granulares10. As células grânulo cerebelar são os menores neurônios e representam cerca de 80% de todos os neurônios do cérebro de vertebrados11. Eles desenvolvem a partir de precursores, localizados na zona germinal externa e migram através da camada de células de Purkinje para seu destino12. Como no telencéfalo, o desenvolvimento do cerebelo é regulamentado por vários morphogens importantes, que têm funções específica e espaço-dependente do tempo e iniciar definido programas transcriptional10.
O desenvolvimento das camadas corticais e Cerebelares é controlado pela expressão transcricional de morphogens específicas e, assim, pelo estado da cromatina do DNA. Em uma visão simplificada, cromatina Estados podem ser divididos em eucromatina como transcricionalmente ativo e heterocromatina como regiões transcriptionally silenciosas. Nucleossoma como unidade básica da cromatina contém duas cópias de cada histona núcleo H2A, H2B, H3 e H4, rodeado por 147 pares de bases do ADN13. Histonas são altamente post-translationally modificadas por metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitination, sumoylation, ADP-do ribosylation do, desaminação e prolina isomerização14,15. Metilação de histonas lisina é considerada a modificação do histone mais estável que controla a transcrição, replicação, recombinação16, danos no DNA resposta17e imprinting genômico18. Lisinas podem ser mono-, di- ou tri-misturado19 e aparecem não só sobre as caudas de histona acessível, mas também dentro do domínio globular de histonas20. Methylations específicos em H3K4 e H3K36 são principalmente associados com eucromatina, methylations específicas em H3K9, H3K27 ou H4K20 são encontradas principalmente em regiões heterocromático, apesar de todos os resíduos estão localizados dentro da cauda do histone14, 19,21. Metilação de H3K79 está localizada dentro do domínio globular de histona e tem sido associada com atividade transcricional, mas também com as regiões genômicas transcricionalmente inerte22. A modificação é evolutivamente conservada desde que foi observado no fermento, timo de vitela, frango e humano23. H3K79 mono, di e trimethylation (H3K79me1, me2, me3) são catalisadas por histona metiltransferases DOT1L24,25 e o Nuclear conjunto domínio-contendo proteínas 2 (Nsd2)26. DOT1L está implicada na proliferação e reparação do DNA celular reprograming27. Perda de Dot1l em ratos leva a uma morte pré-natal em torno de28,de E10.5 o estágio desenvolvente29. Durante o desenvolvimento do coração e na diferenciação de myocardiocyte, DOT1L é essencial para a expressão de gene Regulamento30. No sistema nervoso central, função DOT1L pode ser implicada no tubo neural desenvolvimento31, está envolvido em suprimir Tbr1-expressão durante o desenvolvimento de prosencéfalo32e podem funcionar na regulação do stress-ER genes de resposta33. O contexto-dependente ativando ou reprimir ação de H3K79me, especialmente com situações na vivo como o desenvolvimento do sistema nervoso central, é até à data apenas parcialmente compreendido32. Desde que a metilação de H3K79 situa-se no domínio globular de histona 3, é estericamente menos acessível em comparação com as modificações sobre a caudas de histona flexível23. Para entender a função do methylation H3K79, são necessários métodos de análise confiável e reprodutível para determinar sua localização e ambiente genômico. Neste trabalho de métodos, apresentamos os métodos de isolamento de diferentes progenitores neurais (CPCs para o córtex) e CGNPs para o cerebelo, tratamento eficaz de inibidor de DOT1L e um método de ChIP para analisar H3K79 metilação através do sequenciamento em horário diferente ou qPCR pontos durante o desenvolvimento cortical e cerebelar. Para uma visão geral do protocolo e suas possibilidades, veja a Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviatura/Comentário: Diluição de immunoblot 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviatura/Comentário: Diluição de immunoblot 1:3000</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Diagenode</td><td>pAb-051-050</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviação/Comentário: Anticorpo ChIP</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviatura/Comentário: Diluição de imunotransferência 1:1000</td></tr><tr><td>Diagenode</td><td>anti-IgG de coelho</td><td>C15410206</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviação/Comentário: Anticorpo ChIP Ctrl</td></tr><tr><td>Anti-Tubulina alfa</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviação/Comentário: Diluição de immunoblot 1:3000</td></tr><tr><td>Apo-Transferrina (1 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para</td></tr><tr><td>CCM B27 Suplemento (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para CCM</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent technologies</td><td>G2940CA</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Para análise de cromatina cisalhada</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Category: ChIP Abreviação/Comentário: Ultrasonicator</td></tr><tr><td>Ácido bórico pH 8,4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC</td></tr><tr><td>Sistema de detecção de PCR CFX Connect RT</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>Categoria: ChIP Analysis Abreviação/Comentário: Sistema de detecção para qPCR</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para CGM</td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: Grânulos magnéticos, para ChIP</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td><td>Categoria: Inibição de DOT1L Abreviatura/Comentário: Para inibição de DOT1L em cultura</td></tr><tr><td>de células Ácido etilenodiamina tetracético</td><td>SERVA</td><td>39760.01</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: EDTA</td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino 10% (v/v)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para isolamento de CPC e</td></tr><tr><td>CGM Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para isolamento de CGNP</td></tr><tr><td>Glutationa (1,25 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para CCM</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3187</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: Para fixação celular</td></tr><tr><td>GoTaq mastermix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Category: ChIP Analysis Abreviação/Comentário: DNA polimerase master mix para qPCR</td></tr><tr><td>Hank' s Solução de sal balanceada</td><td>Life Technologies</td><td>14025-100</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: HBSS</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para CCM</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC</td></tr><tr><td>Cloreto de lítio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Suplemento LiCl</td></tr><tr><td>N2</td><td></td><td>Life Technologies 17502048</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para CGM</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: Fluoroespectrômetro para quantificação</td></tr><tr><td>de DNA NEB Next Kit de preparação para biblioteca de DNA Ultra para Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645S</td><td>Categoria: ChIP Analysis Abreviação/Comentário: Kit para preparação de biblioteca</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos para Illumina</td><td>NEB</td><td>E7335</td><td>Category: ChIP Analysis Abreviação/Comentário: Oligos para preparação de biblioteca</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para CCM</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td> Alternativo <td>492016</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: Para tampão ChIP</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Carl Roth</td><td>335</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: PFA, para fixação celular</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Neomicina 1% (v/v)</td><td>Life Technologies</td><td>15640055</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: PSN, para solução salina tamponada com fosfato CCM e CGM</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: PBS, para isolamento de CPC</td></tr><tr><td>PicoGreen Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td>Categoria: ChIP Analysis Abreviação/Comentário: Visualizando corante para quantificação</td></tr><tr><td>de DNA Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para isolamento de CGNP</td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-L-ornitina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9640G</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: KCl, para o</td></tr><tr><td>inibidor de protease</td> CGM <td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Para</td></tr><tr><td>ChIP Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Para ChIP</td></tr><tr><td>Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Kit para purificação de DNA</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Categoria: ChIP Abreviação / Comentário: Para ChIP</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td> <td> Categoria: Inibição de DOT1L Abreviatura / Comentário: Para inibição de DOT1L em cultura de células</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>8551.1</td> <td> Categoria: ChIP Abreviatura / Comentário: para tampão de eluição</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td> <td> Categoria: ChIP Abreviatura / Comentário: NaCl, para tampão ChIP</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td> <td> Categoria: ChIP Abreviatura / Comentário: Para ChIP</td></tr><tr><td>Sódio dodecilsulfato</td><td>Carl Roth</td><td>183</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: SDS, para ChIP</td></tr><tr><td>Sonic hedgehock (SHH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP6004</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para isolamento CGNP</td></tr><tr><td>Superóxido dismutase (1mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7571</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para CCM</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: TRIS, para tampão ChIP</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>X100</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: Para tampão ChIP</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05% (p/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59417C</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para isolamento CPC</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Para preparação de esferas</td></tr><tr><td>Outros dispositivos de laboratório: Câmara de contagem de Neubauer, Incubadora, Rotador, Agitador, Conjunto de dissecação, Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCM: Meio</td><td></td><td></td><td></td>de célula cortical</tr><tr><td>CGM: Meio</td><td></td><td></td><td></td> de cultura de células CGNP</tr></tbody></table>

isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Desenvolvimento do cérebro é um processo complexo, que é controlado de forma temporo-espacial por gradientes de diferentes programas transcriptional e morphogens. Além disso, modificações epigenéticas cromatina, como metilação de histonas, têm um papel importante para o estabelecimento e manutenção de destinos de célula específica dentro deste processo. A grande maioria de metilação de histonas ocorre na cauda do histone flexível, que é acessível para modificadores de histona, borrachas e histona leitor de proteínas. Em contraste, a metilação de H3K79 situa-se no domínio globular de histona 3 e está implicada nas diferentes funções do desenvolvimento. H3K79 metilação é evolutivamente conservada e pode ser encontrada em uma ampla gama de espécies de Homo sapiens de Saccharomyces cerevisiae. A modificação ocorre em populações de células diferentes dentro de organismos, incluindo os progenitores neurais. A localização da metilação de H3K79 no domínio globular de histona 3 torna difícil de avaliar. Aqui, apresentamos métodos para isolar células e e progenitoras cortical de cultura (CPCs) de tecido embrionário cerebral cortical (E11.5-E14.5) ou progenitores cerebelar neurônio granular (CGNPs) do tecido pós-natal (P5-P7) e de forma eficiente immunoprecipitate H3K79me2 por PCR quantitativo (qPCR) e sequenciamento do genoma-largo.

Regime geral de progenitoras neurais isolamento, cultivo, métodos de análise H3K79me2 ChIP e ChIP: A Figura 1 mostra um fluxograma para executar o ChIP H3K79me2 de células progenitoras cortical em pontos de tempo diferentes durante o desenvolvimento embrionário do cérebro ou de progenitores cerebelar neurônio granular em estágios pós-natal. Como primeiro passo, o cérebro tem de ser isolado e o telencéfalo (entre E11.5 e E14.5) ou o cerebelo (...

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar as modificações epigenéticas durante o desenvolvimento do cérebro, especialmente no córtex cerebral e no cerebelo. Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo da neurobiologia, como como modificações de histonas, como a metilação de H3K79, podem afetar o desenvolvimento de camadas corticais e cerebelares. A principal vantagem dessa técnica é que podemos estudar in vivo as modificações das histonas, específicas do locus ou de todo o genoma, em regiões cerebrais distintas em momentos específicos de desenvolvimento.Comece com cérebros de P5 a P7 e camundongos de ressonância magnética. Remova todas as meninges e vasos sanguíneos. Em seguida, transfira de três a cinco cerebelos por chip para tubos de 15 mililitros.Lave o cerebelo com glicose HBSS antes da centrifugação. Centrifugue os tubos para coletar o tecido. Após a lavagem final, homogeneizar o cerebelo pipetando suavemente para cima e para baixo duas a três vezes com uma pipeta de um mililitro até que os fragmentos tenham 0,5 a um milímetro cúbico de tamanho.Remova suavemente todo o líquido até que restem 2,5 mililitros. Em seguida, adicione 0,05% de tripsina no tubo com glicose HBSS contendo o cerebelo. E incube o tecido em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos.Inverta o tecido a cada um ou três minutos. Após a incubação, interrompa a digestão adicionando cinco mililitros de meio de cultura de células CGNP, ou CGM, e colete o tecido por centrifugação como antes. Após centrifugação, remova o sobrenadante e adicione um mililitro CGM.Triturar o tecido com uma ponta de pipeta de um mililitro, evitando a formação de bolhas de ar. Em seguida, adicione cinco mililitros de CGM e incube a mistura por dois minutos no gelo para assentar os restos de tecido. Assim que o tecido assentar, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 15 mililitros.Em seguida, adicione dois mililitros de CGM ao tecido residual e repita o procedimento de trituração antes de colher o sobrenadante e descartar os restos de tecido. Junte os sobrenadantes de cada tubo de tecido de 15 mililitros e centrifugue para coletar as células cerebelares. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de CGM.Como os astrócitos aderem mais rápido e mais forte à poli-D-lisina do que aos CGNPs, adicione até quatro mililitros de suspensão celular aos poços de placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius para remover os astrócitos. Agitar a placa, recolher o sobrenadante num tubo de 15 mililitros e centrifugar o sobrenadante como antes. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de CGM e conte as células com uma câmara de contagem de Neubauer.Após quatro a seis horas, os CGNPs aderidos aparecem redondos e proliferativos. Semeie as células em CGM em placas revestidas de poli-L-ornitina e incube a 37 graus Celsius, 5% de CO2 e 100% de umidade relativa. Depois de um dia in vitro, ou DIV1, a maioria dos CGNPs é redonda e prolifera.Alguns CGNPs começarão a se diferenciar e começarão a crescer de protrusões neuronais. Para fixar as células cultivadas, adicione até um mililitro de 1% de PFA diretamente aos poços contendo CGNPs. Após uma incubação de cinco minutos a 22 graus Celsius, adicione 53 microlitros de glicina e lave duas vezes com três mililitros de PBS gelado.Use um raspador de células para colher as células em um mililitro de PBS. Transfira as células para tubos de 1,5 mililitro e centrifugue por cinco minutos a 1.000 g e quatro graus Celsius. Após remover o sobrenadante, adicione 700 microlitros de tampão de lise contendo inibidor de protease e incube as amostras por 15 minutos a quatro graus Celsius.Vortex as amostras a cada cinco minutos durante este tempo. Após a incubação, divida os tubos de amostra para garantir que o volume não exceda 400 microlitros por tubo. Em seguida, sonicar por 10 minutos na potência máxima para cisalhar a cromatina das células de lise.Após 10 minutos, vortex as amostras e repita a sonicação e o vórtice mais duas vezes. Verifique o lisado quanto aos núcleos restantes com um microscópio de contraste de fase ou microscópio fluorescente usando DAPI. Granular os restos celulares centrifugando durante 10 minutos a 13 000 g e a quatro graus Celsius.Quando terminar, use o sobrenadante para a etapa de pré-limpeza. Para pré-limpar as amostras, primeiro lave 20 micro litros de esferas magnéticas não conjugadas por amostra em PBS Tween gelada. Remova as lavagens com o auxílio de um suporte magnético.Em seguida, adicione 600 microlitros de tampão de diluição e 20 microlitros de esferas magnéticas lavadas a cada amostra para pré-limpeza e incube por duas horas a quatro graus Celsius em um rotador. Após a incubação, remova as contas usando um suporte magnético. Em seguida, pegue 5% de cada lisado como amostras de entrada e congele-as a menos 20 graus Celsius.O acoplamento de anticorpos pode ser realizado enquanto as amostras estão sendo pré-limpas. Lave 45 microlitros de contas magnéticas de proteína A por chip com PBS Tween gelado, como antes. Após a lavagem final, adicione um mililitro de PBS gelado às contas.Em seguida, adicione três microgramas de anticorpo por alíquota de 45 microlitros de contas. Incube por duas horas a quatro graus Celsius em um rotador para ligar os anticorpos às contas. Quando o tempo de incubação tiver decorrido, ressuspenda os grânulos acoplados a anticorpos lavados em um volume de grânulo de PBS gelado.Divida cada extrato pré-eliminado em dois tubos de aproximadamente 643,5 microlitros. Adicione o mesmo volume de tampão de diluição e grânulos ligados a anticorpos e incube as amostras a quatro graus Celsius durante a noite em um rotador. No dia seguinte, lave as contas com tampões de cavacos gelados de um a três por 10 minutos cada em um rotador a quatro graus Celsius, seguido de três lavagens de cinco minutos com tampão TE.Adicionar tampão de eluição e diluir durante uma hora a 1 400 RPM num agitador à temperatura ambiente. Decorrido o tempo de uma hora, adicionar 10 microgramas de Rnase a cada amostra de pastilhas e cinco microgramas às amostras de entrada. Incube as amostras no agitador por 30 minutos a 37 graus Celsius.Finalmente, adicione 100 microgramas de proteinase K por amostra de chip e 50 microgramas por entrada. Incube durante a noite a 65 graus Celsius a 1.400 RPM. Os níveis de dimetilação de H3K79 diminuem após três dias de cultivo de CPC e inibição de DOT1L por SGC 0946.O QCPR após a análise do chip revelou que os genes com altos níveis de metilação de histona-3-lisina-79 na linha de base foram mais responsivos ao tratamento com inibidor. Genes com menor cobertura de dimetilação de H3K79 não mostraram alteração significativa nos níveis de metilação. Este mapa de calor mostra que os níveis de metilação da histona-3-lisina-79 atingem o pico em torno do local de início da transcrição e diminuem em direção ao local final da transcrição.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de uma semana, se for executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como realizar a imunoprecipitação da cromatina em modificações de histonas em células cerebrais isoladas.

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Neurociência

A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.

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Aqui, descrevemos a forma de produzir, expandir e pós-natal do hipocampo immunolabel células progenitoras neurais (NPCs), em três dimensões da cultura (3D). Em seguida, usando tecnologias de visualização híbrida, que demonstram como as imagens digitais de criosecções immunolabelled pode ser usado para reconstruir e mapear a posição espacial de células imuno todo o neurosphere 3D inteiro.

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Este vídeo demonstra o isolamento e o cultivo de células progenitoras neurais cerebelares do cerebelo de um filhote de camundongo. Os progenitores dos neurônios do grânulo cerebelar são isolados e purificados por meio de adesão diferencial, removendo efetivamente os astrócitos. Esses progenitores cultivados subsequentemente se diferenciam em neurônios granulares cerebelares.

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Fonte: Mendez, F. M. et al., Imunoprecipitação de cromatina nativa usando neuroesferas de tumor cerebral murino. J. Vis. Exp. (2018). Este vídeo demonstra o isolamento de complexos proteína-DNA de células neuroesféricas derivadas de um tumor cerebral de camundongo usando imunoprecipitação de cromatina nativa. Ele detalha as etapas de preparação da cromatina, imunoprecipitação, lavagem e digestão de proteínas para liberar DNA para análise posterior.

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Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

Mecanismos epigenéticos são frequentemente alterados no glioma. Imunoprecipitação da cromatina pode ser usada para estudar as consequências de alterações genéticas no glioma que resultam de mudanças nas modificações do histone que regulam a transcrição de gene e a estrutura da cromatina. Este protocolo descreve imunoprecipitação da cromatina nativa na neurospheres de tumor murino de cérebro.

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Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

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Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

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Aprenda a isolar e cultivar progenitores neurais cerebelares para análise de modificações epigenéticas H3K79me2 durante o desenvolvimento cerebral. Este método permite estudar marcações histona in vivo em regiões específicas do cérebro.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3 (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

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