Name: Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar progenitores neurais cerebelares para análise de modificações epigenéticas H3K79me2 durante o desenvolvimento cerebral. Este método permite estudar marcações histona in vivo em regiões específicas do cérebro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos Henriette Bertemes ajudando a estabelecer o protocolo de cultivo CGN dentro do laboratório. Este papel método foi suportada pela DFG-financiado CRC992 médica epigenética financiamento para TV. Os autores reconhecem o apoio da equipe Galaxy Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning e Prof Rolf Backofen, bioinformática, Universidade de Freiburg, Alemanha, financiado pela colaboração pesquisa centro 992 médica epigenética (grant DFG SFB 2012 992/1) e o Ministério Federal alemão de educação e pesquisa (BMBF concessão 031 A538A RBC (de. NBI)).

<ol><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).</li>
<li>Kandel, E. R., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+breaking+down+scientific+barriers+to+the+study+of+brain+and+mind%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind.</a> Science. 290, 1113-1120 (2000).</li>
<li>Götz, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+development%3A+the+art+of+generating+cell+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Cortical development: the art of generating cell diversity.</a> Dev. Camb. Engl. 132, 3327(2005).</li>
<li>Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+neural+precursor+cell+fate+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of neural precursor cell fate during development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).</li>
<li>Davis, A. A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-renewing+multipotential+stem+cell+in+embryonic+rat+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex.</a> Nature. 372, 263-266 (1994).</li>
<li>Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+cortical+gliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).</li>
<li>McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+dependence+of+laminar+determination+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex.</a> Science. 254, 282-285 (1991).</li>
<li>Desai, A. R., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+restriction+in+fate+potential+by+neural+progenitors+during+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development.</a> Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).</li>
<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellum%3A+history%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li>
<li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).</li>
<li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).</li>
<li>Sanders, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H4+lysine+20+controls+recruitment+of+Crb2+to+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage.</a> Cell. 119, 603-614 (2004).</li>
<li>Martin, C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functions+of+histone+lysine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse functions of histone lysine methylation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).</li>
<li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation%3A+a+dynamic+mark+in+health%2C+disease+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).</li>
<li>Ng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+within+the+globular+domain+of+histone+H3+by+Dot1+is+important+for+telomeric+silencing+and+Sir+protein+association%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association.</a> Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).</li>
<li>Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+types+and+sites+of+histone+modifications+emerge+as+players+in+the+transcriptional+regulation+contest%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest.</a> FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).</li>
<li>Roidl, D., Hacker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+during+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methylation during neural development.</a> Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).</li>
<li>Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tale+beyond+the+tail%3A+histone+core+domain+modifications+and+the+regulation+of+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).</li>
<li>van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dot1p+Modulates+Silencing+in+Yeast+by+Methylation+of+the+Nucleosome+Core%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core.</a> Cell. 109, 745-756 (2002).</li>
<li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190(2008).</li>
<li>Woo Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RE-IIBP+Methylates+H3K79+and+Induces+MEIS1-mediated+Apoptosis+via+H2BK120+Ubiquitination+by+RNF20%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20.</a> Sci. Rep. 5, 12485(2015).</li>
<li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. , (2016).</li>
<li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190(2008).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+mammalian+erythropoiesis+requires+the+Dot1L+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase.</a> Blood. 116, 4483-4491 (2010).</li>
<li>Cattaneo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L-mediated+H3K79me2+modification+critically+regulates+gene+expression+during+cardiomyocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation.</a> Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li>
<li>Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Af9%2FMllt3+interferes+with+Tbr1+expression+through+epigenetic+modification+of+histone+H3K79+during+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).</li>
<li>Roidl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L+Activity+Promotes+Proliferation+and+Protects+Cortical+Neural+Stem+Cells+from+Activation+of+ATF4-DDIT3-Mediated+ER+Stress+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dayt.+Ohio%22%5BJournal%5D)">DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9, R137(2008).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Roidl, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoidl%2C+D+%22Histone+modifications+during+cerebral+cortex+development%22">Histone modifications during cerebral cortex development</a>. , (2015).</li>
<li>Turner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP+with+Native+Chromatin%3A+Advantages+and+Problems+Relative+to+Methods+Using+Cross-Linked+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Mapping+Protein%2FDNA+Interactions+by+Cross-Linking%22%5BJournal%5D)">ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material.</a> Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).</li>
<li>Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cortical+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente

Há duas maneiras principais para realizar a imunoprecipitação da cromatina para detectar a ocupação genômica de modificações do histone, fatores de transcrição, leitores de código de histona, escritores ou borrachas. Um é o método de ChIP nativo usando nuclease digerida, cromatina nativa para a imunoprecipitação, e o outro é o método apresentado usando cromatina PFA-fixas, distorcida, em que os nucleosomes e outras proteínas DNA-inscritos são ligados covalentemente ao DNA 39. ChIP nativo com sua t...

As funções cognitivas, motor e sensoriais do cérebro são altamente complexo e suscetível a mudanças físicas e ambientais. O cérebro é composto por três partes gerais o hind-, mid-e prosencéfalo, que estão profundamente ligados. Dentro do posencéfalo, o telencéfalo pode ser dividido em um telencéfalo dorsal (DT) e um telencéfalo ventral (VT). O DT de ratos consiste de seis camadas corticais que são formadas entre E11.5 e E18.5 em uma maneira de "dentro para fora"1. O VT inclui as Eminências ganglionar em desenvolvimento, que mais tarde formam o gânglio basal2,3. Vários tipos de células podem ser classificados no sistema nervoso central dos mamíferos como neurônios, astrócitos ou oligodendrócitos4, que se desenvolvem em uma maneira temporo-espacial5. Primeiro, as células progenitoras neurais (NPCs) dão origem a diferentes tipos de neurônios, interneurônios no VT e os neurônios de projeção no DT e mais tarde sobre células gliais (por exemplo, astrócitos6). Durante o desenvolvimento cortical, a camada mais superficial (camada mim), que contém células de Cajal-Retzius, é formado em primeiro lugar. Então, entre E12.5 e E14.5, NPCs geram camadas mais profundas neuronais (VI, V) enquanto entre 14,5 e 16.5, progenitores dão origem a camada superior (IV-II) neurônios7,8. Identidade neuronal é especificada por programas de transcriptional temporo-espacial induzida por morphogen diferentes e, adicionalmente, por programas epigenéticas2.
O cerebelo, que está implicado na coordenação motora, situa-se no rombencéfalo e se desenvolve entre E10 e aproximadamente P20 em ratos9. Ele contém o córtex cerebelar e os núcleos Cerebelares10. O córtex cerebelar adulto consiste de três camadas, a camada mais externa de molecular, a camada de células de Purkinje e a camada mais interna granular contendo neurônios granulares10. As células grânulo cerebelar são os menores neurônios e representam cerca de 80% de todos os neurônios do cérebro de vertebrados11. Eles desenvolvem a partir de precursores, localizados na zona germinal externa e migram através da camada de células de Purkinje para seu destino12. Como no telencéfalo, o desenvolvimento do cerebelo é regulamentado por vários morphogens importantes, que têm funções específica e espaço-dependente do tempo e iniciar definido programas transcriptional10.
O desenvolvimento das camadas corticais e Cerebelares é controlado pela expressão transcricional de morphogens específicas e, assim, pelo estado da cromatina do DNA. Em uma visão simplificada, cromatina Estados podem ser divididos em eucromatina como transcricionalmente ativo e heterocromatina como regiões transcriptionally silenciosas. Nucleossoma como unidade básica da cromatina contém duas cópias de cada histona núcleo H2A, H2B, H3 e H4, rodeado por 147 pares de bases do ADN13. Histonas são altamente post-translationally modificadas por metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitination, sumoylation, ADP-do ribosylation do, desaminação e prolina isomerização14,15. Metilação de histonas lisina é considerada a modificação do histone mais estável que controla a transcrição, replicação, recombinação16, danos no DNA resposta17e imprinting genômico18. Lisinas podem ser mono-, di- ou tri-misturado19 e aparecem não só sobre as caudas de histona acessível, mas também dentro do domínio globular de histonas20. Methylations específicos em H3K4 e H3K36 são principalmente associados com eucromatina, methylations específicas em H3K9, H3K27 ou H4K20 são encontradas principalmente em regiões heterocromático, apesar de todos os resíduos estão localizados dentro da cauda do histone14, 19,21. Metilação de H3K79 está localizada dentro do domínio globular de histona e tem sido associada com atividade transcricional, mas também com as regiões genômicas transcricionalmente inerte22. A modificação é evolutivamente conservada desde que foi observado no fermento, timo de vitela, frango e humano23. H3K79 mono, di e trimethylation (H3K79me1, me2, me3) são catalisadas por histona metiltransferases DOT1L24,25 e o Nuclear conjunto domínio-contendo proteínas 2 (Nsd2)26. DOT1L está implicada na proliferação e reparação do DNA celular reprograming27. Perda de Dot1l em ratos leva a uma morte pré-natal em torno de28,de E10.5 o estágio desenvolvente29. Durante o desenvolvimento do coração e na diferenciação de myocardiocyte, DOT1L é essencial para a expressão de gene Regulamento30. No sistema nervoso central, função DOT1L pode ser implicada no tubo neural desenvolvimento31, está envolvido em suprimir Tbr1-expressão durante o desenvolvimento de prosencéfalo32e podem funcionar na regulação do stress-ER genes de resposta33. O contexto-dependente ativando ou reprimir ação de H3K79me, especialmente com situações na vivo como o desenvolvimento do sistema nervoso central, é até à data apenas parcialmente compreendido32. Desde que a metilação de H3K79 situa-se no domínio globular de histona 3, é estericamente menos acessível em comparação com as modificações sobre a caudas de histona flexível23. Para entender a função do methylation H3K79, são necessários métodos de análise confiável e reprodutível para determinar sua localização e ambiente genômico. Neste trabalho de métodos, apresentamos os métodos de isolamento de diferentes progenitores neurais (CPCs para o córtex) e CGNPs para o cerebelo, tratamento eficaz de inibidor de DOT1L e um método de ChIP para analisar H3K79 metilação através do sequenciamento em horário diferente ou qPCR pontos durante o desenvolvimento cortical e cerebelar. Para uma visão geral do protocolo e suas possibilidades, veja a Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviatura/Comentário: Diluição de immunoblot 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviatura/Comentário: Diluição de immunoblot 1:3000</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Diagenode</td><td>pAb-051-050</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviação/Comentário: Anticorpo ChIP</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviatura/Comentário: Diluição de imunotransferência 1:1000</td></tr><tr><td>Diagenode</td><td>anti-IgG de coelho</td><td>C15410206</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviação/Comentário: Anticorpo ChIP Ctrl</td></tr><tr><td>Anti-Tubulina alfa</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td>Categoria: Anticorpo Abreviação/Comentário: Diluição de immunoblot 1:3000</td></tr><tr><td>Apo-Transferrina (1 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para</td></tr><tr><td>CCM B27 Suplemento (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para CCM</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent technologies</td><td>G2940CA</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Para análise de cromatina cisalhada</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Category: ChIP Abreviação/Comentário: Ultrasonicator</td></tr><tr><td>Ácido bórico pH 8,4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC</td></tr><tr><td>Sistema de detecção de PCR CFX Connect RT</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>Categoria: ChIP Analysis Abreviação/Comentário: Sistema de detecção para qPCR</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para CGM</td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: Grânulos magnéticos, para ChIP</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td><td>Categoria: Inibição de DOT1L Abreviatura/Comentário: Para inibição de DOT1L em cultura</td></tr><tr><td>de células Ácido etilenodiamina tetracético</td><td>SERVA</td><td>39760.01</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: EDTA</td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino 10% (v/v)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para isolamento de CPC e</td></tr><tr><td>CGM Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para isolamento de CGNP</td></tr><tr><td>Glutationa (1,25 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para CCM</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3187</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: Para fixação celular</td></tr><tr><td>GoTaq mastermix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Category: ChIP Analysis Abreviação/Comentário: DNA polimerase master mix para qPCR</td></tr><tr><td>Hank' s Solução de sal balanceada</td><td>Life Technologies</td><td>14025-100</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: HBSS</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para CCM</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC</td></tr><tr><td>Cloreto de lítio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Suplemento LiCl</td></tr><tr><td>N2</td><td></td><td>Life Technologies 17502048</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para CGM</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: Fluoroespectrômetro para quantificação</td></tr><tr><td>de DNA NEB Next Kit de preparação para biblioteca de DNA Ultra para Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645S</td><td>Categoria: ChIP Analysis Abreviação/Comentário: Kit para preparação de biblioteca</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos para Illumina</td><td>NEB</td><td>E7335</td><td>Category: ChIP Analysis Abreviação/Comentário: Oligos para preparação de biblioteca</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para CCM</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td> Alternativo <td>492016</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: Para tampão ChIP</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Carl Roth</td><td>335</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: PFA, para fixação celular</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Neomicina 1% (v/v)</td><td>Life Technologies</td><td>15640055</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: PSN, para solução salina tamponada com fosfato CCM e CGM</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: PBS, para isolamento de CPC</td></tr><tr><td>PicoGreen Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td>Categoria: ChIP Analysis Abreviação/Comentário: Visualizando corante para quantificação</td></tr><tr><td>de DNA Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para isolamento de CGNP</td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-L-ornitina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9640G</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviação/Comentário: KCl, para o</td></tr><tr><td>inibidor de protease</td> CGM <td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Para</td></tr><tr><td>ChIP Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Para ChIP</td></tr><tr><td>Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Kit para purificação de DNA</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Categoria: ChIP Abreviação / Comentário: Para ChIP</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td> <td> Categoria: Inibição de DOT1L Abreviatura / Comentário: Para inibição de DOT1L em cultura de células</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>8551.1</td> <td> Categoria: ChIP Abreviatura / Comentário: para tampão de eluição</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td> <td> Categoria: ChIP Abreviatura / Comentário: NaCl, para tampão ChIP</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td> <td> Categoria: ChIP Abreviatura / Comentário: Para ChIP</td></tr><tr><td>Sódio dodecilsulfato</td><td>Carl Roth</td><td>183</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: SDS, para ChIP</td></tr><tr><td>Sonic hedgehock (SHH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP6004</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para isolamento CGNP</td></tr><tr><td>Superóxido dismutase (1mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7571</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para CCM</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: TRIS, para tampão ChIP</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>X100</td><td>Categoria: ChIP Abreviatura/Comentário: Para tampão ChIP</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05% (p/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59417C</td><td>Categoria: Cultura de células Abreviatura/Comentário: Para isolamento CPC</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td>Categoria: ChIP Abreviação/Comentário: Para preparação de esferas</td></tr><tr><td>Outros dispositivos de laboratório: Câmara de contagem de Neubauer, Incubadora, Rotador, Agitador, Conjunto de dissecação, Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCM: Meio</td><td></td><td></td><td></td>de célula cortical</tr><tr><td>CGM: Meio</td><td></td><td></td><td></td> de cultura de células CGNP</tr></tbody></table>

isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Desenvolvimento do cérebro é um processo complexo, que é controlado de forma temporo-espacial por gradientes de diferentes programas transcriptional e morphogens. Além disso, modificações epigenéticas cromatina, como metilação de histonas, têm um papel importante para o estabelecimento e manutenção de destinos de célula específica dentro deste processo. A grande maioria de metilação de histonas ocorre na cauda do histone flexível, que é acessível para modificadores de histona, borrachas e histona leitor de proteínas. Em contraste, a metilação de H3K79 situa-se no domínio globular de histona 3 e está implicada nas diferentes funções do desenvolvimento. H3K79 metilação é evolutivamente conservada e pode ser encontrada em uma ampla gama de espécies de Homo sapiens de Saccharomyces cerevisiae. A modificação ocorre em populações de células diferentes dentro de organismos, incluindo os progenitores neurais. A localização da metilação de H3K79 no domínio globular de histona 3 torna difícil de avaliar. Aqui, apresentamos métodos para isolar células e e progenitoras cortical de cultura (CPCs) de tecido embrionário cerebral cortical (E11.5-E14.5) ou progenitores cerebelar neurônio granular (CGNPs) do tecido pós-natal (P5-P7) e de forma eficiente immunoprecipitate H3K79me2 por PCR quantitativo (qPCR) e sequenciamento do genoma-largo.

Regime geral de progenitoras neurais isolamento, cultivo, métodos de análise H3K79me2 ChIP e ChIP: A Figura 1 mostra um fluxograma para executar o ChIP H3K79me2 de células progenitoras cortical em pontos de tempo diferentes durante o desenvolvimento embrionário do cérebro ou de progenitores cerebelar neurônio granular em estágios pós-natal. Como primeiro passo, o cérebro tem de ser isolado e o telencéfalo (entre E11.5 e E14.5) ou o cerebelo (...

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar as modificações epigenéticas durante o desenvolvimento do cérebro, especialmente no córtex cerebral e no cerebelo. Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo da neurobiologia, como como modificações de histonas, como a metilação de H3K79, podem afetar o desenvolvimento de camadas corticais e cerebelares. A principal vantagem dessa técnica é que podemos estudar in vivo as modificações das histonas, específicas do locus ou de todo o genoma, em regiões cerebrais distintas em momentos específicos de desenvolvimento.Comece com cérebros de P5 a P7 e camundongos de ressonância magnética. Remova todas as meninges e vasos sanguíneos. Em seguida, transfira de três a cinco cerebelos por chip para tubos de 15 mililitros.Lave o cerebelo com glicose HBSS antes da centrifugação. Centrifugue os tubos para coletar o tecido. Após a lavagem final, homogeneizar o cerebelo pipetando suavemente para cima e para baixo duas a três vezes com uma pipeta de um mililitro até que os fragmentos tenham 0,5 a um milímetro cúbico de tamanho.Remova suavemente todo o líquido até que restem 2,5 mililitros. Em seguida, adicione 0,05% de tripsina n

isolation-cultivation-neural-progenitors-followed-chromatin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.

Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Aqui, descrevemos a forma de produzir, expandir e pós-natal do hipocampo immunolabel células progenitoras neurais (NPCs), em três dimensões da cultura (3D). Em seguida, usando tecnologias de visualização híbrida, que demonstram como as imagens digitais de criosecções immunolabelled pode ser usado para reconstruir e mapear a posição espacial de células imuno todo o neurosphere 3D inteiro.

Proteína localização em Cultura de Células-tronco neurais 3D: uma Metodologia de visualização híbrida

Este protocolo demonstra métodos utilizados para estabelecer ambientes 2D e 3D em câmaras de design personalizado electrotactic, que pode acompanhar...

Campo elétrico controlado de migração dirigida de células progenitoras neurais em ambientes 2D e 3D

Isolamento de crista neural embrionário a partir do tubo neural facilita o uso...

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

Fonte: Tagliafierro, L., et al. Plataforma de vetor lentiviral para a entrega eficiente de ferramentas de edição de epigenoma em modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a transdução lentiviral de células progenitoras neurais (NPCs) para modificação epigenética direcionada da alfa-sinucleína, uma proteína-chave na doença de Parkinson. O protocolo permite a metilação do DNA mediada por metiltransferase, reduzindo...

Transdução lentiviral de células progenitoras neurais para regulação epigenética da expressão de alfa-sinucleína

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar células progenitoras neurais induzidas (iNPCs) derivadas de fibroblastos humanos adultos. Ele descreve as etapas envolvidas no isolamento das colônias de iNPC e na cultura delas em poços de placas de vários poços revestidos com laminina na presença de meios de cultura adequados que facilitam a proliferação e expansão contínuas da população de iNPC.

Isolando colônias de células progenitoras neurais induzidas derivadas de fibroblastos humanos adultos

Este vídeo demonstra o isolamento e o cultivo de células progenitoras neurais cerebelares do cerebelo de um filhote de camundongo. Os progenitores dos neurônios do grânulo cerebelar são isolados e purificados por meio de adesão diferencial, removendo efetivamente os astrócitos. Esses progenitores cultivados subsequentemente se diferenciam em neurônios granulares cerebelares.

Isolando e Cultivando Progenitores de Neurônios Granulares Cerebelares Murinos

Fonte: Mendez, F. M. et al., Imunoprecipitação de cromatina nativa usando neuroesferas de tumor cerebral murino. J. Vis. Exp. (2018). Este vídeo demonstra o isolamento de complexos proteína-DNA de células neuroesféricas derivadas de um tumor cerebral de camundongo usando imunoprecipitação de cromatina nativa. Ele detalha as etapas de preparação da cromatina, imunoprecipitação, lavagem e digestão de proteínas para liberar DNA para análise posterior.

Imunoprecipitação da cromatina nativa de células da neuroesfera

Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

A medula espinhal de mamíferos adultos contém células-tronco neurais/progenitoras (NSPCs) que podem ser isoladas e expandidas em cultura. Este protocolo descreve a coleta, isolamento, cultura e passagem de NSPCs geradas a partir da região periventricular da medula espinhal adulta do rato e de doadores de transplante de órgãos humanos.

Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

Mecanismos epigenéticos são frequentemente alterados no glioma. Imunoprecipitação da cromatina pode ser usada para estudar as consequências de alterações genéticas no glioma que resultam de mudanças nas modificações do histone que regulam a transcrição de gene e a estrutura da cromatina. Este protocolo descreve imunoprecipitação da cromatina nativa na neurospheres de tumor murino de cérebro.

Imunoprecipitação da cromatina nativa usando Neurospheres de Tumor de cérebro murino

Aprenda a isolar e cultivar progenitores neurais cerebelares para análise de modificações epigenéticas H3K79me2 durante o desenvolvimento cerebral. Este método permite estudar marcações histona in vivo em regiões específicas do cérebro.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3 (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Explorar mais vídeos