Name: Metodologia para neuromodulação Biomimetic químico de Retinas de ratos com o neurotransmissor glutamato em Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Aprenda a técnica de neuromodulação química biomimética de retinas de ratos usando glutamato in vitro. Este método oferece potencial para restaurar a visão em doenças degenerativas de fotorreceptores com maior acuidade visual.

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O trabalho apresentado no livro foi apoiado pela Fundação Nacional de ciência, fronteiras emergentes na pesquisa e programa de inovação (NSF-EFRI) conceder o número 0938072. O conteúdo deste artigo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não necessariamente representam a opinião oficial da NSF. Os autores também desejam agradecer Dr. Samsoon Inayat o trabalho de projetar e testar a configuração inicial e experimental para a estimulação química e Sr. Ashwin Raghunathan pelo seu trabalho, projetar, fabricar e avaliar o dispositivo microfluidic multiport usado em Este estudo.

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Os autores não têm nada para divulgar.

O método apresentado aqui demonstra um paradigma único de estimulação neural, onde os neurônios da retina são quimicamente estimulados injetando produtos químicos neurotransmissor nativo no subsolo da retina em vitro. Esta técnica de estimulação química oferece várias vantagens sobre a técnica de estimulação elétrica convencional, incluindo alta especificidade focal de neurônios alvo e seletividade. O protocolo acima detalhes como pequenos injeções pneumático de volume de glutamato o neurotransmissor entregues p...

Fotoreceptor doenças degenerativas, como retinite pigmentosa e degeneração macular relacionada à idade, são principais causas herdáveis da perda da visão e são atualmente incurável1,2. Embora essas doenças surgem de uma variedade de mutações genéticas específicas, doenças degenerativas fotorreceptoras caracterizam-se como um grupo pela perda progressiva das células fotoreceptoras na retina, que eventualmente causa cegueira. A perda de gatilhos de fotorreceptores generalizadas de remodelação em toda a retina, mas sobrevivendo os neurônios da retina, incluindo as células bipolares e RGCs, permanecem intactas e relativamente funcional mesmo em estágios avançados de degeneração de fotorreceptoras3 ,4,5,6,7.
Os mecanismos e patologias destas doenças foram bem caracterizadas3,4,5,6,7 , mas ainda não se alcançou um tratamento eficaz. Nas últimas três décadas, pesquisadores em todo o mundo têm investigado uma variedade de tratamentos terapêuticos para restaurar a visão para as pessoas afectadas com doenças degenerativas fotoreceptor, incluindo gene terapia8, tratamento de células-tronco9, transplante de retina10e estimulação artificial11,12 dos neurônios sobreviventes da retina. Destes, o mais clìnica disponível é próteses da retina, que são dispositivos de neuroestimulação artificial que tradicionalmente têm utilizado uma matriz de eletrodos para estimular eletricamente a células bipolares ou RGCs em padrões específicos, com o objetivo de Criando percepções visuais artificiais em pacientes11. Próteses elétrica da geração atual, como o Argus II13 e dispositivos de14 alfa-IMS, alcançaram aprovação clínica e estudos preliminares indicaram que pode melhorar a qualidade de vida para pacientes restaurando um medida da visão usando epiretinal (frente da retina) e apresentam (parte traseira do retina) implantados dispositivos15,16. Grupos de pesquisa ao redor do mundo estão trabalhando em próteses da retina, além dos sucessos desses dispositivos da primeira geração17,18,19,20 a avançar mas têm enfrentado dificuldades de projetar uma prótese elétrica capaz de restaurar a visão de alta acuidade, abaixo do nível de cegueira legal aos pacientes. Estudos recentes têm mostrado que alcançar maior resolução espacial que isso habilitado pela atual geração elétrica com base em próteses é um desafio por causa do limite de injeção de carga, que exige o uso de grandes eletrodos para estimular com segurança neurônios da retina ao custo de resolução espacial, ou seja, a acuidade visual11,21. Além disso, a estimulação elétrica é mais limitado porque normalmente estimula todas as células vizinhas e portanto provoca percepções antinaturais e confusas em pacientes, em grande parte porque é um paradigma de estimulação inerentemente antinatural21. No entanto, os sucessos iniciais de estimulação elétrica demonstraram que a neuroestimulação artificial pode ser um tratamento eficaz para doenças degenerativas fotoreceptor. Isto leva-na hipótese de que um tratamento mais eficaz pode ser viável, estimulando a retina com produtos químicos de neurotransmissor, os agentes naturais de comunicação em sinapses químicas. O objetivo do método apresentado neste artigo é explorar a viabilidade terapêutica de estimulação química, que procura imitar o sistema natural de comunicação sináptica entre os neurônios da retina, como uma estimulação alternativa elétrica biomimetic para uma prótese de retina.
Tradução do conceito de estimulação química terapêutica para uma prótese de retina química baseia-se quimicamente, ativando os neurônios da retina do alvo com pequenas quantidades de neurotransmissores nativos, como o glutamato, lançado através de um microfluídicos dispositivo composto por uma grande variedade de microports em resposta a estímulos visuais. Desta forma, uma prótese retiniana química seria essencialmente uma camada de fotorreceptoras artificial biomimético que traduz fótons naturalmente atingindo a retina para sinais químicos. Uma vez que estes sinais químicos usam os mesmos neurotransmissores utilizados na sinalização da retina normal e estimulam os neurônios da retina sobreviventes de um degenerado retina através da vias sinápticas mesmas usado por caminhos de visão normal, o visual resultante percepção conseguida através de uma prótese de retina química poderia ser mais natural e compreensível em relação a um evocado através de uma prótese elétrica. Além disso, desde que o microports através do qual os neurotransmissores são liberados podem ser feitas extremamente pequeno e matriz de alta densidade, ao contrário dos eléctrodos, um potencial químico protético pode ser capaz de atingir mais estímulo focal e maior espacial resolução de uma prótese elétrica. Assim, baseando-se estas vantagens potenciais, uma prótese de retina química oferece uma alternativa altamente promissora para próteses elétricas.
Estimulação química da retina, no entanto, tem sido relativamente pouco explorada até recentemente. Enquanto a estimulação elétrica da retina foi bem caracterizada ao longo de décadas de trabalho através de de22, em vitro23, na vivo23,24e estudos clínicos13 ,14, estudos sobre estimulação química têm sido limitados exclusivamente para alguns em vitro obras25,26,,27,28. Iezzi e Finlayson26 e Andre et al 27 demonstrou epiretinal estimulação química da retina em vitro usando um único eletrodo e uma matriz multielectrode (MEA), respectivamente, para gravar as respostas de glutamato evocado dos neurônios da retina. Mais recentemente, Rountree et al 28 demonstraram a estimulação diferencial das vias e desligar da retina usando glutamato de lado subretinal e um MEA para gravar as respostas neuronais de diversos sites na retina.Embora essas obras estabeleceram preliminarmente a viabilidade da estimulação química, mais estudos são essenciais para investigar muitos aspectos dessa abordagem além daqueles abordados até agora25,26,27 , 28e ajustar os parâmetros de estimulação terapêutica em modelos animais, tanto in vitro e in vivo antes de traduzir este conceito para uma prótese de retina química, como discutido acima. No entanto, atualmente não há nenhuma metodologia estabelecida para realizar estimulação química da retina na literatura e os métodos utilizados em obras anteriores não foram descritos em detalhes como seria essencial para estudos replicative. Portanto, a justificativa para este papel de métodos é fornecer uma estrutura bem definida para a realização em vitro química estimulação da retina para os investigadores interessados ou replicar nossos estudos anteriores27, 28 ou avançando ainda mais este conceito emergente de neuroestimulação química.
Aqui vamos demonstrar um método para a condução em vitro química estimulação dos neurônios da retina em wholemount retinas de ratos do selvagem-tipo e um modelo de rato degenerado fotorreceptoras que imita pròxima a progressão do fotoreceptor degenerativa doenças em seres humanos. A lógica por trás do desenvolvimento deste método de estimulação em modelos em vitro é avaliar a terapêutica varia de vários parâmetros de estimulação e estudar as características de resposta neural que seriam impossível ou difícil de observar no em vivo modelos, especialmente durante os estudos iniciais focado em avaliar a viabilidade desta abordagem. Neste procedimento, mostramos o único site e simultâneos multissite estímulos químicos da retina entregando pequenas quantidades de glutamato 1 mM perto de neurônios da retina de destino via Micropipetas de vidro de porta única comercialmente disponível e um costume dispositivo de multi-porta microfluidic microusinado, respectivamente. Enquanto estímulos tanto sites multi e single-site realizar o objectivo básico de investigar a viabilidade terapêutica de neuromodulação química, cada um serve a um propósito distinto com uma vantagem única. A estimulação de site único, que pode ser realizada com Micropipetas de vidro pré-puxada comercialmente disponível, pode ser usada para injetar produtos químicos diretamente no subsolo da retina em um único local e serve para investigar se observável RGC spike taxa respostas que são semelhantes às respostas luz visualmente evocadas podem ser eliciadas focally sob o local da injeção. Por outro lado, estimulação de vários local, que requer um dispositivo microfluidic multiport especialmente fabricados, pode ser usada para injetar produtos químicos espacialmente em vários sites sobre a superfície da retina e serve para investigar como glutamato-evocada RCG padrões de resposta correspondem os padrões de injeção de glutamato em estudos de estimulação padrão.

<table><tbody><tr><td>Matriz de microeletrodos, layout perfurado</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>60pMEA200/30iR-Ti-pr</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti</td></tr><tr><td>Amplificador MEA</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv</td></tr><tr><td>Placa de aterramento de perfusão inferior para sistemas multicanal pMEA</td><td>, GmbH</td><td>MEA1060-Inv-(BC)-PGP</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp</td></tr><tr><td>Micromanipulador Motorizado de 3 eixos</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MP-285</td><td>Sistema</td></tr><tr><td>de Controle de Micromanipulador</td> https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html <td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MPC-200</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html</td></tr><tr><td>Estilo pórtico suporte para micromanipulador com corrediça linear</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MT-75/LS</td><td>https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html</td></tr><tr><td>Injetor de pressão multicanal programável de 8 canais</td><td>OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Fornecedor: Harvard Apparatus UK</td><td>PM-8000 ou PM-8</td><td>OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Fornecedor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail</td></tr><tr><td>Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200A</td><td>Axopatch 200A foi substituído por um modelo mais recente Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier</td></tr><tr><td>Patch clamp headstage</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV 201A http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage</td><td></td></tr><tr><td>Kit de resíduos a vácuo</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VMK</td><td>http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/</td></tr> <tr><td>Porta-pipetas</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>QSW-A10P</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915</td></tr><tr><td>Pré-puxado 10 &mu; micropipetas de vidro de diâmetro de ponta m</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>TIP10TW1</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/</td></tr> <tr><td>Zoom estereomicroscópio</td><td>Nikon, Tóquio, Japão</td><td>SMZ-745T</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745</td></tr><tr><td>Suporte de lança de microscópio com bola linear dupla braço de rolamento</td><td>Old School Industries, Inc., Dacono, CO</td><td>OS1010H-16BB</td><td>http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm</td></tr><tr><td>Zoom Microscópio Estéreo com Suporte LED Híbrido C-LEDS</td><td>Nikon, Tóquio, Japão</td><td>SMZ-445</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445</td></tr><tr><td>Sistema de microscópio invertido</td><td>Nikon, Tóquio, Japão</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420</td></tr><tr><td>Ácido L-glutâmico (glutamato)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S8761</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761</td></tr><tr><td>placa de Petri de 60 mm (10 mm de altura)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>FB0875713A</td><td>placa de Petri transparente de 60 mm; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a</td></tr><tr><td>Jewelers #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>555227F</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/</td></tr> <tr><td>Bisturi Padrão #24</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500247</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/</td></tr> <tr><td>Cabo de bisturi #4</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500237</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/</td></tr> <tr><td>Tesoura de dissecação Vannas Tubingen</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>503378 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/</td><td></td></tr> Kit <tr><td>de malha de nylon</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>NYL / MESH</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173</td></tr><tr><td>Grelha de fatia de harpa</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>HSG-5AD</td><td>http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/</td></tr> Ag/<tr><td>AgCl pellet de eléctrodo de referência</td> Sistemas <td>multicanal, GmbH</td><td>P1060</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/p1060</td></tr><tr><td>Sistema de perfusão por gravidade controlada por válvula de 4 canais</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VC3-4xG</td><td>http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/</td></tr> <tr><td>Zyla 5.5 sCMOS câmera de microscópio</td><td>Andor Technology, Belfast, Reino Unido</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td>http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos</td></tr><tr><td>Fio de prata (50 &mu; m de diâmetro)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>AA44461G5</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5</td></tr><tr><td>Tubulação microbore Tygon (1,6 mm de diâmetro)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>EW-06419-01</td><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901</td></tr><tr><td>Suporte de ferramenta basculante com cânula de</td> <td>açoALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>TILTPORT</td><td>Um de cada um deles foi utilizado para perfusão e sucção superiores; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/</td></tr> <tr><td>Roscolux #26 Folha de Filtro Vermelho Claro</td><td>Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT</td><td>R2611</td><td>Fabricante: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Fornecedor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html</td></tr><tr><td>Smith & Lanterna Wesson Galaxy Red</td><td>Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA</td><td>4588</td><td>Fabricante: https://www.smith-wesson.com/ Fornecedor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588</td></tr><tr><td>MC_Rack Software</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MC_Rack</td><td></td></tr><tr><td>http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack Labview Software</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>LabVIEW</td><td>http://www.ni.com/labview/</td></tr> <tr><td>NIS-Elements: Software de Pesquisa Básica</td><td>Nikon, Tóquio, Japão</td><td>NIS-Elements BR</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research</td></tr></tbody></table>

metodologia para neuromodulação biomimetic químico de retinas de ratos com o neurotransmissor glutamato em vitro

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Doenças degenerativas fotorreceptoras causam cegueira irreparável através da perda progressiva de células fotorreceptoras na retina. Próteses da retina são um tratamento emergente para fotorreceptoras doenças degenerativas que visam restaurar a visão, artificialmente estimulando os neurônios da retina sobreviventes na esperança de suscitar compreensível percepção visual em pacientes. Atual da retina próteses têm demonstrado sucesso em restaurar a visão limitada aos pacientes usando uma matriz de eletrodos para eletricamente estimular a retina, mas enfrentam barreiras físicas substanciais na restauração de alta acuidade, visão natural aos pacientes. Neuroestimulação química usando neurotransmissores nativos é uma estimulação alternativa elétrica biomimetic e poderia contornar as limitações fundamentais associadas com as próteses da retina usando neuroestimulação elétrica. Especificamente, neuroestimulação química tem o potencial de restaurar a visão mais natural com comparáveis ou melhores acuidades visual aos pacientes através da injeção de quantidades muito pequenas de neurotransmissores, os mesmos agentes naturais de comunicação utilizados pela retina sinapses químicas, a resolução muito melhor do que a corrente elétricas próteses. No entanto, como um paradigma de estimulação relativamente inexplorada, não há nenhum protocolo estabelecido para alcançar a estimulação química da retina em vitro. O objetivo deste trabalho é fornecer um quadro pormenorizado para realizar estimulação química da retina para os investigadores que desejem estudar o potencial de neuromodulação química da retina ou similar de tecidos neurais em vitro. Neste trabalho, descrevemos a instalação experimental e metodologia para suscitar ganglionares da retina célula (RGC) pico respostas para visual luz respostas semelhantes no tipo selvagem e wholemount fotorreceptoras-degenerou as retinas de rato pela injeção controlada de volumes de o glutamato neurotransmissor no espaço subretinal utilizando Micropipetas de vidro e um dispositivo microfluidic multiport personalizado. Esta metodologia e protocolo são gerais o suficiente para ser adaptado para neuromodulação usando outros neurotransmissores ou até mesmo outros tecidos neurais.

Este protocolo pode ser usado para estimular quimicamente retina normal, tipo selvagem, bem como fotorreceptoras degenerou as retinas, apesar da substancial celular remodelação causada pela perda dos FOTORRECEPTORES. Antes de iniciar experimentos com qualquer fotorreceptoras degenerou ou as retinas do selvagem-tipo, a necessidade de equipamento (Figura 1 e Figura 2) gravação e estimulação para ser preparado e o pMEA (<strong clas...

Este protocolo descreve um método novo para investigar uma forma de neuroestimulação química do wholemount rato as retinas em vitro com o neurotransmissor glutamato. Neuroestimulação química é uma alternativa promissora para a neuroestimulação elétrica convencional de neurônios da retina no tratamento de cegueira irreversível, causada por doenças degenerativas fotoreceptor.

Metodologia para neuromodulação Biomimetic químico de Retinas de ratos com o neurotransmissor glutamato em Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

O objetivo geral desta metodologia é permitir uma nova neuromodulação química dos neurônios da retina usando neurotransmissores, o que poderia substituir a funcionalidade das células retinianas defeituosas em pacientes com cegueira neurodegenerativa para restaurar a visão. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da visão artificial. Como o glutamato, um neurotransmissor primário da retina, pode ser usado para estimular terapeuticamente uma retina degenerada fotorreceptora?A principal vantagem da nossa técnica é que ela é biomimética, estimulando a retina desta forma oferece o potencial para maior acuidade visual e visão mais naturalista do que é possível com estimulação elétrica. As implicações dessa técnica se estendem ao tratamento da cegueira, devido a doenças degenerativas dos fotorreceptores, pois a intervenção terapêutica precoce de uma retina degenerada pode restaurar a sensibilidade ao glutamato nos neurônios da retina. Para iniciar este procedimento, coloque os dois olhos enucleados em uma placa de Petri de 60 milímetros de diâmetro com solução fresca oxigenada de meio de Ames.Usando um microscópio estéreo de dissecação, faça uma pequena incisão na face da córnea usando um bisturi ou uma tesoura afiada. Em seguida, faça um corte desta pequena incisão até a borda da córnea. E estenda-o em uma seção circunferencial ao redor de toda a borda da córnea.Em seguida, remova a córnea descolada junto com o cristalino, os humores aquoso translúcido e vítreo. Enquanto segura suavemente a ocular com um par de pinças, faça cuidadosamente duas pequenas incisões em lados opostos da ocular. Em seguida, use dois pares de pinças para separar suavemente a ocular em cada uma das incisões.E separe a retina da esclera. Levante lentamente toda a retina da esclera e da ocular e corte o nervo óptico se ainda estiver preso. Depois disso, faça cortes longitudinais na retina para obter meias ou quartos de seções.Em seguida, espalhe suavemente uma seção da retina em uma malha de náilon com as células ganglionares voltadas para longe da malha. Coloque a malha e a retina em um MultiElectrode Array perfurado com as células ganglionares em contato com uma superfície PMEA. Em seguida, coloque um peso em cima da malha para manter a retina no lugar.Neste procedimento, sob iluminação vermelha fraca, coloque PMEA no MEA amplifier e feche as travas do amplificador. Posicione a saída de perfusão superior dentro da câmara PMEA e ligue a válvula de perfusão superior para atingir uma taxa de perfusão de aproximadamente três mililitros por minuto. Em seguida, posicione a entrada de sucção superior no nível de perfusão oito desejado.Certifique-se de que está funcionando. Depois, abra o software de aquisição de dados e clique no botão play para começar a receber os dados. Certifique-se de que todos os canais PMEA estejam livres de ruído e gravando neurosinais.Caso contrário, reposicione o PMEA dentro do amplificador para obter um melhor contato entre os pinos do amplificador e os contatos PMEA. Em seguida, certifique-se de que a linha de perfusão inferior esteja livre de bolhas de ar. Ligue a válvula de perfusão inferior para garantir que a retina seja fornecida com oxigênio e nutrientes.Em seguida, ligue a câmera de alta velocidade conectada ao microscópio óptico invertido e abra o software de imagem. Assim que a perfusão inferior for confirmada como fluindo, aumente lentamente a sucção inferior girando manualmente o botão de pressão de vácuo no kit de resíduos de vácuo enquanto observa a retina através do microscópio invertido. Uma vez observada uma força de sucção agindo na retina, pare de aumentar a sucção.Depois de garantir que a retina foi mantida no lugar pela sucção inferior, retire o peso da retina usando uma pinça e remova suavemente a malha de náilon descascando um canto cuidadosamente da retina. Mantenha a perfusão funcionando por aproximadamente 30 minutos para permitir que a retina se estabilize do trauma cirúrgico. Nesta etapa, insira cuidadosamente uma micropipeta pré-puxada de 10 micrômetros de diâmetro em um porta-pipeta padrão contendo um eletrodo de fio de cloreto de prata-prata de 50 micrômetros de diâmetro.Se estiver usando um dispositivo microfluídico multiportas, insira a haste de aço inoxidável conectada ao dispositivo em um porta-pipeta padrão sem um eletrodo de fio. Se estiver utilizando uma micropipeta de vidro, conecte o porta-pipeta com um patch clamp headstage e conecte a conexão inferior da porta de pressão do porta-pipeta para canalizar um do sistema de injeção de pressão. Ou, se estiver usando o dispositivo multiportas, conecte as conexões luer da porta de pressão de cada uma das oito portas de injeção, com o canal de um a oito do sistema de injeção de pressão.Em seguida, ligue manualmente o sistema de injeção de pressão e ligue o canal um. Certifique-se de que o sistema seja ventilado para a atmosfera e defina a pressão de injeção para 0.1 libras por polegada quadrada. Em seguida, ligue o micromanipulador e calibre-o pressionando o botão calibrar no controlador do manipulador.Posicione o micromanipulador de forma que a ponta da micropipeta fique aproximadamente 30 milímetros acima do MEA ampmais vivo. Em seguida, encha uma pequena placa de Petri com solução de glutamato e coloque-a embaixo do micromanipulador. Abaixe a ponta da micropipeta na solução e encha a micropipeta de vidro ou a tubulação do dispositivo multiportas com aproximadamente 20 milímetros de solução.Em seguida, levante a ponta da micropipeta, ou dispositivo, para fora da solução. Remova a placa de Petri e posicione o micromanipulador acima da câmara PMEA. Usando um microscópio estéreo montado em suporte de haste, alinhe a ponta da micropipeta ou os cantos do dispositivo com uma marca de referência gravada no anel da câmara PMEA.Em seguida, armazene as posições do manipulador na superfície de controle usando os botões de referência de armazenamento A e referência de armazenamento B para mapear o sistema de coordenadas do manipulador dos eletrodos PMEA. Em seguida, use o software de controle do manipulador. Selecione um eletrodo PMEA alvo com atividade espontânea robusta e clique no botão mover para o canal para alinhar a micropipeta de vidro com o eletrodo alvo.Se estiver usando o dispositivo multiportas, alinhe as microportas do dispositivo com os eletrodos PMEA alvo com atividade espontânea robusta usando o mesmo processo. Se a medição de impedância estiver disponível, ligue o patch clamp amplifier e inicie o software de visualização de impedância clicando no botão Iniciar para visualizar a impedância do eletrodo de cloreto de prata-prata dentro do suporte da pipeta. Enquanto observa os sinais de impedância em tempo real, abaixe lentamente a micropipeta, ou dispositivo, até que entre em contato com a superfície da retina, conforme indicado por um rápido aumento no sinal de impedância.Para estimulação subsuperficial, abaixe a pipeta 40 micrômetros mais para S334 tera três retinas, ou 70 micrômetros para retinas do tipo selvagem. Execute algumas injeções de curta duração usando o sistema de injeção de pressão. Determinar se as células próximas à ponta da micropipeta, ou microportas do dispositivo, são receptivas à estimulação do glutamato observando os neurosinais.Agora, oriente o LED verde em direção à superfície superior da retina. Comece a gravar usando o software de aquisição de dados digitando o nome do arquivo e clicando no botão de gravação. Assim que a gravação for iniciada, abra o programa de controle de estímulo e carregue o arquivo de estímulo padrão clicando no botão ler arquivo de estímulo.Em seguida, clique no botão executar arquivo de estímulo para iniciar o arquivo de estímulo padrão. Após a conclusão do arquivo de estímulo, pare a gravação para salvá-lo para futura classificação de pico e análise de dados. Aqui estão as gravações representativas de nove eletrodos PMEA, mostrando os dados do eletrodo filtrado passa-alta durante a estimulação visual da luz com um LED verde, onde cada retângulo mostra os dados neurais de um eletrodo exclusivo.Cada gravação de eletrodo ilustra os dados coletados no primeiro segundo após acender o LED verde. Os picos foram identificados usando uma tensão limite de 18 microvolts negativos. A estimulação visual causou uma explosão de picos em todos os eletrodos, exceto no centro superior, que possuía uma resposta inibitória à luz.Um gráfico semelhante para os mesmos eletrodos, mostrando atividade neural espontânea sem estimulação visual ou de injeção. Embora rajadas menores estivessem presentes, os padrões de picos eram muito diferentes daqueles registrados em resposta à estimulação visual. Aqui estão as gravações representativas do mesmo subconjunto de eletrodos gravados imediatamente após uma injeção de glutamato no eletrodo central.O glutamato injetado provocou uma explosão de picos no eletrodo central que era muito semelhante às explosões de espinhos evocadas visualmente. Todos os outros eletrodos não foram afetados pela injeção de glutamato, o que demonstra a resolução espacial fina da técnica de estimulação química. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro a seis horas se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de monitorar a perfusão para garantir que a retina seja continuamente fornecida com oxigênio e nutrientes durante todo o experimento. Essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores no campo da visão artificial e desenvolvimento de próteses visuais explorarem a neuromodulação química para o tratamento da cegueira de doenças degenerativas fotorreceptoras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a neuromodulação dos neurônios da retina usando neurotransmissores.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Imunohistoquímica protocolos são usados ​​para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

Com este estudo, apresentamos um modelo de estresse padronizado para a retina bovina superfundido isolado para o futuro teste pré-clínico terapêutico. O efeito de qualquer hipóxia (puro N 2) ou estresse glutamato (250 mM glutamato) em função da retina representado por a- e amplitudes da onda-b foi avaliado.

Glutamato e hipóxia como um modelo de estresse para o isolado perfundido Vertebrate Retina

O método de imunoouro pós-incorporação é uma das maneiras mais eficazes de fornecer análises de alta resolução da localização subcelular de moléculas específicas. Aqui descrevemos um protocolo para analisar quantitativamente os receptores de glutamato nas sinapses da fita retiniana.

High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

Este artigo ilustra como a expressão de receptores de neurotransmissores pode ser quantificada e o padrão analisado em sinapses com elementos pré e pós-sinápticos identificados usando uma combinação de transdução viral de ferramentas optogenéticas e a técnica de imunomarcação de réplica de fratura por congelamento.

Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala

Aqui, descrevemos a configuração, navegação software e análise de dados para um método espacial e temporalmente precisa de medir a tônica e fásica mudanças glutamato extracelulares in vivo utilizando matrizes de microeletrodos ligado a enzima (MEA).

Utilizando biossensores baseados em Enzyme medir Tonic e Phasic glutamato na doença de Alzheimer rato Models

Aqui apresentamos um protocolo para medir fluxos in vitro ca2+ em neurônios de cérebro médio e seus efeitos a jusante no caspase-3 usando culturas primárias de cérebro médio do rato. Este modelo pode ser empregado para estudar alterações fisiosiopatológicas relacionadas à atividade anormal do Ca2+ em neurônios do cérebro médio, e para tela de novas terapêuticas para propriedades anti-apoptóticas.

Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neurorregenerativa de glia ensheathing glia (OEG), após lesão neural. Baseia-se em uma cocultura de neurônios gânglios de retina adulto axotomizados (RGN) em monocamadas OEG e estudo subsequente de regeneração axonal, analisando marcadores axonal e somatodendritic RGN.

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

A modificação do equipamento de matriz de multieletrodos ou patch clamp existente torna o eletrorretinograma ex vivo mais amplamente acessível. Métodos aprimorados para registrar e manter respostas à luz ex vivo facilitam o estudo da função fotorreceptora e das células ON-bipolar na retina saudável, modelos animais de doenças oculares e retinas de doadores humanos.

Otimizando a configuração e as condições do eletrorretinograma ex vivo para estudar a função da retina em olhos pequenos e grandes

O protocolo demonstra que, realizando microtransplante de membranas sinápticas em oócitos Xenopus laevis , é possível registrar respostas consistentes e confiáveis de receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropônico e receptores de ácido γ-aminobutírico.

Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais

As próteses retinianas têm a capacidade de gerar percepções visuais. Para avançar no desenvolvimento de novas próteses, são necessários métodos ex vivo para testar os dispositivos antes do implante. Este artigo fornece um protocolo abrangente para o estudo da atividade do cálcio na camada de células ganglionares da retina quando submetido à estimulação elétrica.

Imagem de cálcio em retinas planas eletricamente estimuladas

Aprenda a técnica de neuromodulação química biomimética de retinas de ratos usando glutamato in vitro. Este método oferece potencial para restaurar a visão em doenças degenerativas de fotorreceptores com maior acuidade visual.

Metodologia para neuromodulação Biomimetic químico de Retinas de ratos com o neurotransmissor glutamato em Vitro

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