Name: Abordagem do Canal Semicircular posterior para a orelha interna Gene entrega no rato Neonatal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Aprenda a abordagem do canal semicircular posterior para entrega de genes na orelha interna de ratos neonatais. Este método confiável permite perfusão completa e facilita pesquisas em terapia gênica.

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Este trabalho foi financiado por fundos do NIDCD divisão de Intramural Research /NIH (DC000082-02 para W.W.C.), bem como DC000081 para núcleo avançado de imagem. Agradecemos a equipe de instalação animal NIDCD por cuidar de nossos animais.

Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo Comitê de uso no Instituto Nacional de surdez e outros distúrbios de comunicação (NIDCD ASP1378-15) e cuidado Animal.
1. preparação e instalação do procedimento
<ol><li>Esterilize todos os instrumentos com óxido de etileno no início do experimento. Entre os animais, limpe instrumentos usando a esterilização do grânulo.</li>
	<li>Carrega a solução contendo terapia genética viral em uma micropipeta no micro-injector. O vector viral utilizado neste estudo foi AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genoma cópias por mililitro, consulte a tabela de materiais). Nota: Normalmente, o volume total de 1,1 µ l é carregado na micropipeta.</li>
</ol>2. anestesia
Nota: A tensão de rato utilizada neste estudo é o mouse whirler. Ambos homozigotos mutantes (quandowi/wi) e littermates heterozigotos (quando+ / wi) foram utilizados.
<ol><li>Coloca a mãe em uma gaiola separada (separar o lixo).</li>
	<li>Coloque a gaiola em casa contendo a ninhada (P0 - P5 filhotes) sobre uma almofada de calor recirculação (conjunto a 37,5 ° C) para aquecer os ratos.</li>
	<li>Cortar a parte de dedo de uma luva de látex e coloque um filhote nele.</li>
	<li>Coloque o filhote no polegar da luva de látex em um balde de gelo para ~ 2 min.</li>
	<li>Coloque o filhote anestesiado em um pacote grande praça comercial congelamento de plástico com uma gaze 4 "x 4" entre o filhote e superfície do pacote.</li>
	<li>Encha uma luva de látex resistente com gelo picado e coloque a luva de gelo ao redor o filhote.</li>
	<li>Verificar se o filhote é devidamente anestesiado pela completa falta de resposta a estímulos diversos (incluindo uma pitada de dedo firme). Deixe o filhote na calota de gelo para a duração da cirurgia (aproximadamente 5-10 min). Nota: Recomendamos deixar os filhotes na calota de gelo para não mais de 15 min durante a cirurgia.</li>
</ol>3. abordagem cirúrgica (Figura 1)
<ol><li>Limpe a pele atrás da orelha com uma compressa com iodo e uma compressa com álcool, uma vez que o animal é anestesiado.</li>
	<li>Faça uma incisão postauricular ~ 2 mm atrás da orelha usando microtesoura e dividir o músculo esternocleidomastoideo com microtesoura.</li>
	<li>Identifica o nervo facial e o bulla. O bulla é cartilaginoso e semi transparente nesta idade e situa-se medial ao nervo facial. A artéria estapédica pode ser vista através do bulla nesta idade, o que é um ponto de referência útil.</li>
	<li>Siga o nervo facial, superiormente e posteriormente para localizar o canal semicircular posterior (PSCC). Retire as fibras musculares e tecidos moles sobrejacentes o canal semicircular posterior usando microtesoura. Nota: O PSCC é cartilaginoso nesta idade.</li>
	<li>Penetra o PSCC usando uma micropipeta de vidro (~ 10 μm de diâmetro) na micro-injector.</li>
	<li>Terapia do gene viral Injete no ouvido interno. Nota: Normalmente, um total de 20 injeções de 49 nL da terapia do gene são entregues para o canal semicircular posterior mais de 40 ~ s (volume total ~ 1 µ l). O título viral utilizado foi de 1 x 1013 genoma cópias / mL.</li>
	<li>Feche a incisão de pele usando uma sutura de Poliglactina 5-0.</li>
</ol>4. pós-operatório cuidados
<ol><li>Coloque o filhote em uma almofada de aquecimento para restaurar uma temperatura normal do corpo durante a recuperação da anestesia com constante manual estimulação/rolamento com luvas dedos humanos.</li>
	<li>Uma vez que o filhote está acordado, colocá-lo volta para sua gaiola em casa.</li>
	<li>Acaricie cada filhote com um cotonete de algodão que tem sido exposto para a roupa de cama de gaiola em casa. Nota: O propósito disto é ter os ratos cheirar como fizeram antes da cirurgia, o que aumenta a probabilidade da mãe re-aceitando seu pós-operatório de maca. Se possível, urina da mãe pode ser coletada e esfregada sobre os filhotes usando um cotonete para diminuir ainda mais a probabilidade de rejeição.</li>
	<li>Aplicar óleo mineral para o nariz da mãe para dessensibilizar a8e reintroduzir a gaiola em casa com a mãe.</li>
</ol>

<ol><li>Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for sensorineural hearing loss.</a> Ear Hear. 36, 1-7 (2015).</li>
<li>Askew, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmc+gene+therapy+restores+auditory+function+in+deaf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice.</a> Sci Transl Med. 7, 295(2015).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75, 283-293 (2012).</li>
<li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+restores+auditory+and+vestibular+function+in+a+mouse+model+of+Usher+syndrome+type+1c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c.</a> Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).</li>
<li>Isgrig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Balance+and+Auditory+Functions+in+a+Mouse+Model+of+Usher+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome.</a> Mol Ther. 25, 780-791 (2017).</li>
<li>Lentz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+hearing+and+vestibular+function+by+antisense+oligonucleotides+in+a+mouse+model+of+human+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness.</a> Nat Med. 19, 345-350 (2013).</li>
<li>Shibata, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+Prevents+Autosomal-Dominant+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss.</a> Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).</li>
<li>Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+care+and+use+of+mammals+in+neuroscience+and+behavioral+research%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research.</a> Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).</li>
<li>Chien, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Hair+Cell+Stereocilia+Morphology+in+Inner+Ears+of+Deaf+Whirler+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice.</a> Mol Ther. 24, 17-25 (2016).</li>
<li>Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lipopolysaccharide+compromises+the+blood-labyrinth+barrier+and+increases+entry+of+serum+fluorescein+into+the+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).</li>
<li>Okada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+targeting+mouse+vestibule+using+adenovirus+and+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors.</a> Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).</li>
<li>Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy+with+ancestral+AAV+in+adult+mice%3A+complete+transduction+of+inner+hair+cells+without+cochlear+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction.</a> Sci Rep. 7, 45524(2017).</li>
</ol>

Os autores têm sem divulgações relevantes para fazer.

Várias abordagens cirúrgicas têm sido descritas para acessar roedor ouvido interno. Cochleostomy e janela redonda abordagens são mais comumente usadas para acessar a cóclea, Considerando que o canal semicircular posterior e saco endolinfático abordagens são normalmente usadas para acessar os órgãos vestibulares1. Em um estudo recente, nós mostramos aquele canal semicircular posterior injeções da terapia do gene viral resultaram em alta eficiência de transdução celular cabelo em ambos os órgãos ves...

Terapia de gene do ouvido interno é um campo de rápido desenvolvimento de investigação. Aplicação em vários modelos animais para combate ototoxicidade, trauma de ruído e de perda de audição hereditária1. Vários estudos recentes têm mostrado recuperação funcional da audição e funções de equilíbrio em camundongos mutantes após ouvido interno gene terapia entrega2,3,4,5,6, 7. um dos principais fatores na determinação do sucesso da terapia do gene de orelha interna é a abordagem cirúrgica utilizada para acessar o ouvido interno. Idealmente, a abordagem cirúrgica seria fácil de executar, os marcos anatômicos seria consistente e fácil de identificar e a transdução resultante de tipos de células alvo seria alta.
Em um estudo recente, mostramos que, quando a terapia do gene viral foi injectada através do canal semicircular posterior do rato mutante whirler (um modelo de perda auditiva e disfunção vestibular), transdução eficiente de células sensoriais do cabelo foi vista nos vestibulares órgãos, assim como a cóclea5. A alta eficiência de transdução sensorial cabelo célula resultou em melhora das funções auditivas e vestibulares nestes ratos mutantes.
Neste artigo, descrevemos em detalhe a abordagem de canal semicircular posterior para acessar o ouvido interno do rato neonatal.

<table><tbody><tr><td>Microscópio cirúrgico</td><td>Zeiss</td><td></td><td>OPMI Pico Microscópio otorrinolaringológico. Outros microscópios de dissecção também funcionariam.</td></tr><tr><td>Micro-forcepts</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10, 11295-51</td><td>#5 e #55 Dumont</td></tr><tr><td>Micro-tesoura</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor Nanoliter2000</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Mastex</td><td>Modelo 500/600</td><td></td></tr><tr><td>5-0 suturas de vicryl</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV8-whirlin</td><td>Vector Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipeta de vidro</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td>Vidro de borosilicato</td></tr></tbody></table>

abordagem do canal semicircular posterior para a orelha interna gene entrega no rato neonatal

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Terapia de gene do ouvido interno uma grande promessa como um potencial tratamento para perda de audição e tontura. Um dos determinantes essenciais do sucesso da terapia de gene do ouvido interno é encontrar um método de entrega que resulta em eficiência de transdução consistente dos tipos de célula alvo, minimizando a perda de audição. Neste estudo, descrevemos a abordagem de canal semicircular posterior como um método viável para a entrega de gene do ouvido interno em camundongos neonatais. Mostramos que a entrega do gene através do canal semicircular posterior é capaz de perfundir toda orelha interna. A fácil identificação anatômica do canal semicircular posterior, bem como, manipulação mínima do osso temporal exigido, fazer neste cirúrgico aproximar-se uma opção atraente para entrega de gene do ouvido interno.

Injeção de AAV8-whirlin de terapia gênica em camundongos whirler neonatal através do canal semicircular posterior resultou em whirlin expressão (verde) em células ciliadas utricular (Figura 2), com a eficiência global de infecção de 53,1% (SD 38,1, n = 28)5 . Células de cabelo transduzidas tinha alongado Estereocílio (vermelho) em comparação com células ciliadas de orelhas não injectada contralaterais (5,35 ± 2.11 µm vs 3,20 ± 0,34 µm,...

Neste estudo, descrevemos a abordagem de canal semicircular posterior como um método confiável para a entrega de gene do ouvido interno em camundongos neonatais. Mostramos que a entrega do gene através do canal semicircular posterior é capaz de perfundir toda orelha interna.

Abordagem do Canal Semicircular posterior para a orelha interna Gene entrega no rato Neonatal

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

O objetivo geral deste procedimento é acessar o ouvido interno do camundongo para entrega de genes. Este método pode ajudar a fornecer terapia genética ao ouvido interno do camundongo de maneira eficiente. As principais vantagens dessa técnica é que ela é confiável e fácil de aprender.Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao pequeno tamanho do ouvido interno do camundongo. No entanto, com a prática, a maioria das pessoas pode concluir uma dissecção cirúrgica em dez minutos. Comece o procedimento com instrumentos estéreis e ligue o esterilizador de esferas para limpar os instrumentos entre os animais.Carregue o vírus terapêutico em uma micropipeta de dez mícrons de diâmetro conectada a um microinjetor. O vetor viral usado em nossos experimentos é o redemoinho AAV28 com um título de um vezes dez elevado a 13 cópias do genoma por mililitro. Para este vídeo, o corante azul de metileno foi usado para facilitar a visualização.Limpe a pele atrás da orelha com três esfoliantes betadine seguidos de lenço umedecido com álcool. Em seguida, use uma microtesoura para fazer um pós-auricular aproximadamente dois milímetros atrás da orelha e dividir o tecido mole subjacente. Identifique o nervo facial e a bolha.O músculo esternocleidomastóideo fica perpendicular ao nervo facial. A artéria estapedial pode ser vista através da bula, que é um marco útil. Siga o nervo facial superior e posteriormente para localizar o canal semicircular posterior.Use a microtesoura para remover as fibras musculares e os tecidos moles que recobrem o canal semicircular posterior. Em seguida, penetre no canal semicircular posterior com a micropipeta de vidro carregada no microinjetor e injete o corante no ouvido interno. Normalmente, um total de 20 injeções de 49 nanolitros são administradas no canal semicircular posterior durante 40 segundos para um volume total de aproximadamente um microlitro.Retire a pipeta imediatamente após a administração do último volume. Em seguida, feche a incisão na pele usando uma sutura de poliglactina 5-0. A injeção de AAV8-whirlin em camundongos whirler neonatais, como mostrado neste vídeo, resultou na expressão de whirlin mostrada em verde nas células ciliadas utriculares.As células ciliadas transduzidas tinham estereocílios alongados mostrados em vermelho em comparação com as células ciliadas de orelhas contralaterais não injetadas. A injeção de canal semicircular posterior de AAV8-whirlin também resultou na transdução de células ciliadas cocleares nos camundongos whirler. As células ciliadas transduzidas expressaram turbilhão nas pontas dos estereocílios e tiveram estereocílios alongados em comparação com as células ciliadas de orelhas contralaterais não injetadas.Após este procedimento, outros métodos como o ABI e o teste estéreo podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se a entrega do gene do ouvido interno tem efeito nas funções auditivas e vestibulares. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da entrega de genes do ouvido interno explorarem defeitos de entrega de genes no ouvido interno de camundongos.

posterior-semicircular-canal-approach-for-inner-ear-gene-delivery

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A orelha interna do rato é um órgão sensorial placode derivado cujo programa é elaborado de desenvolvimento durante a gestação. Nós definimos...

Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por<em&gt; In Vivo</em&gt; Eletroporação

Fonte: Kozin, E. D., et.al. Visualização direta do núcleo coclear dorsal murino para estimulação optogenética da via auditiva. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra a transferência de genes mediada por vírus para o núcleo coclear dorsal (DCN) de camundongos para permitir a estimulação auditiva induzida por luz. Um vetor viral que codifica opsina, um canal iônico sensível à luz, é injetado no DCN após uma craniotomia e aspiração cerebelar para acesso direto. As opsinas expressas permitem que...

Transferência gênica mediada por vírus para o núcleo coclear dorsal do camundongo para estimulação auditiva induzida por luz

Este vídeo mostra a canalostomia, um procedimento que permite a administração local de drogas no ouvido interno de um camundongo através do canal semicircular com danos mínimos à audição e à função vestibular. Este método permite a inoculação de vetores virais, produtos farmacêuticos e pequenas moléculas no ouvido interno do camundongo.

Canalostomia para administração local de medicamentos no ouvido interno de um camundongo adulto

Fonte: Akil, O., et al., Método cirúrgico para entrega de genes mediada por vírus ao ouvido interno de camundongos através da membrana da janela redonda. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o procedimento de entrega de um gene terapêutico no ouvido interno de um filhote de camundongo com perda auditiva geneticamente induzida. Usando um vetor viral adeno-associado (AAV), o gene é injetado através da membrana da janela redonda, permitindo que as partículas virais entrem nas células ciliadas,...

Terapia gênica baseada em vetores virais para restauração auditiva em um modelo de camundongo

A abordagem cirúrgica pós-auricular descrita permite a entrega rápida e direta na escala timpânica coclear do camundongo, minimizando a perda de sangue e a mortalidade animal. Este método pode ser usado para terapia coclear usando entrega molecular, farmacológica e viral a camundongos pós-natais através da membrana da janela redonda.

Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane

Apresentamos um método que descreve o isolamento e a cultura de explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos.  Também demonstramos um método para transferência de genes em explantes cocleares por meio de eletroporação de onda quadrada. A cultura de explantes in vitro, juntamente com a técnica de transferência de genes, permite que os pesquisadores estudem os efeitos da alteração da expressão gênica durante o desenvolvimento.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

O objetivo deste protocolo é delinear uma abordagem cirúrgica para fornecer acesso direto ao núcleo coclear dorsal em um modelo murino.

Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva

Duas abordagens de microcirurgia para administração local de medicamentos no ouvido interno são descritas aqui e comparadas em termos de impacto nos parâmetros auditivos, citoarquitetura coclear e expressão de marcadores inflamatórios.

Um Estudo Comparativo de drogas métodos de entrega direcionados à orelha de rato Inner: Bullostomy Versus Injeção transtimpânica

O objetivo deste protocolo é demonstrar a preparação, cultura, tratamento e imunocoloração de explantes cocleares murinos neonatais. A técnica pode ser utilizada como ferramenta de seleção in vitro na pesquisa auditiva.

Técnica Explosiva Cochlear Murina Neonatal como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ferramenta de seleção na pesquisa auditiva

Nós relatamos um método cirúrgico para administrar medicamentos para o ouvido interno de um primata não-humano, o sagui comum (Callithrix jacchus), através da membrana da janela redonda.

Um procedimento cirúrgico para a administração de drogas para o ouvido interno em um Non-Human primatas Sagui (Callithrix jacchus)

Aqui descrevemos o procedimento canalostomy, que permite a entrega de drogas local para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatais através do canal semicircular com danos mínimos para a função auditiva e vestibular. Esse método pode ser usado para inocular vetores virais, fármacos e moléculas pequenas para o ouvido interno do rato.

Canalostomy como uma abordagem cirúrgica para entrega de drogas para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatal

Aprenda a abordagem do canal semicircular posterior para entrega de genes na orelha interna de ratos neonatais. Este método confiável permite perfusão completa e facilita pesquisas em terapia gênica.

Abordagem do Canal Semicircular posterior para a orelha interna Gene entrega no rato Neonatal

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