Pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina aumenta a eficiência da enxertia de célula de câncer pulmão ortotópico
28 de junho de 2018
Nós descrevemos um método para melhorar significativamente a enxertia ortotópico de células de câncer de pulmão aos pulmões murino pelo pré-condicionamento das vias aéreas com lesão. Esta abordagem também pode ser aplicada para estudar interações do estroma dentro do microambiente pulmonar, disseminação metastática, co-morbidades do câncer pulmonar, e gerar mais eficiência paciente derivada xenografts.
O objetivo geral deste procedimento é aumentar a eficiência do transplante de células de câncer de pulmão que iniciam tumores nas vias aéreas de camundongos. Este método pode ajudar a estabelecer novos modelos pré-clínicos para responder a questões-chave na biologia do câncer, incluindo as causas da resistência aos medicamentos e a relação entre fibrose e câncer de pulmão. A principal vantagem dessa técnica é que ela aumenta a eficiência do transplante de células iniciadoras de tumores nos pulmões de uma variedade de linhagens de camundongos.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia, porque nos permite modelar uma variedade maior de subtipos de câncer de pulmão humano, conhecidos por terem diferentes respostas clínicas ao tratamento. Para este protocolo, os camundongos devem primeiro ser injetados com bleomicina. Então, após 14 dias, as células tumorais são injetadas.
O procedimento para ambas as injeções é muito semelhante e descrito aqui. Duas horas antes da injeção, descongele o estoque de bleomicina no gelo e dilua-o até a concentração de trabalho. Mantenha-o no gelo.
Para um bolo celular, prepare uma suspensão celular conforme descrito no protocolo de texto. O tempo de procedimento para cada mouse é de cerca de 10 minutos juntos. Certifique-se de confirmar a anestesia adequada usando uma pitada no dedo do pé e aplique pomada veterinária nos olhos.
Neste momento, se o rato tiver cabelos escuros, raspe toda a área das costelas, tanto ventral quanto dorsalmente, para que possa ser visualizada corretamente. Em seguida, coloque o mouse na plataforma de intubação, prendendo-o pelos dentes da frente com as costas contra a plataforma. Se um bolus celular for injetado, ressuspenda-o agora com uma trituração suave.
Agora ilumine a região superior do tórax, abra a boca e puxe suavemente a língua para fora usando uma pinça plana. Prepare um cateter intravenoso para a traqueia removendo a agulha e posicione-o sobre a abertura traqueal. Em seguida, insira o cateter na traqueia até que a parte superior do cateter esteja perto dos dentes da frente e ilumine o interior do cateter para confirmar sua colocação.
Em seguida, dispense os 50 microlitros de bleomicina recém-feita, ou suspensão celular, diretamente no cateter. Aguarde alguns segundos para que todo o volume desça pelo cateter. Em seguida, remova o cateter e descarte-o em alvejante a 10%.
Se o mouse não estiver inalando o líquido, monitore cuidadosamente sua respiração e ajuste a posição do cateter. Se o mouse parar de respirar, remova imediatamente o cateter e deixe-o respirar antes de reinserir o cateter. Depois de remover o cateter, continue realizando o procedimento para ter cinco camundongos tratados, ainda anestesiados e prontos para a imagem.
Para recuperação, coloque o rato em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento aprovada pela IACUC em uma gaiola de recuperação e monitore-o até que esteja totalmente recuperado. Dois ou três minutos após a injeção das células, injetar 100 microlitros de luciferina retroorbitalmente, usando uma agulha de insulina. Alterne o olho usado para injeção a cada sessão de imagem.
Depois de esperar pelo menos dois minutos, posicione até cinco camundongos em um gerador de imagens de bioluminescência animal, na posição de decúbito esternal e adquira uma imagem dorsal usando configurações de luminescência. No painel de controle, ajuste as configurações de resolução e sensibilidade para medir a luminescência das células. Para a maioria dos aplicativos, comece com três minutos, defina o binning como médio, defina f/stop como um, defina o campo de view para d e defina a altura do assunto para 1,5.
Se a injeção for bem-sucedida, um sinal é detectado na área superior do tórax em um pulmão ou em ambos os pulmões. Se as células estiverem agrupadas na entrada da traqueia, a injeção não foi bem-sucedida. Depois de tirar a imagem dorsal, vire os ratos e adquira uma imagem ventral e ajuste a configuração conforme necessário.
Após a imagem, prossiga com os cuidados pós-operatórios conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, repita este protocolo de imagem três dias após o enxerto e semanalmente a partir de então. Para analisar as imagens, use um software de análise de bioluminescência.
Primeiro, carregue todas as imagens apropriadas na série. Esta seção é detalhada em um pacote de software. Em seguida, para cada camundongo, na primeira imagem da série, crie uma região quadrada de interesse e posicione-a sobre a área superior do tórax, cobrindo toda a região pulmonar.
Em seguida, clicando com o botão direito, acesse a função copiar todas as regiões de interesse e use essa ferramenta para aplicar as mesmas regiões de interesse a cada imagem do grupo. Em seguida, dentro de cada imagem, ajuste as posições dos quadrados para cobrir a parte superior do tórax de cada mouse. Faça isso para as vistas ventral e dorsal.
Agora, no canto superior esquerdo da janela da imagem, selecione a função de fótons. Em seguida, selecione a opção de medida. Os dados das regiões de interesse são então exibidos em uma tabela de saída como fluxo total.
Analise esses dados conforme necessário. Quando imunocomprometidos, os camundongos atímicos foram tratados com bleomicina. Antes do enxerto de bolus celular, fibrose transitória foi observada no dia 14 em camundongos tratados com bleomicina, mas não em camundongos tratados com veículo.
Em seguida, as células da linha celular de câncer de pulmão humano estabelecida, H2030, foram entregues por via intratraqueal nos pulmões desses camundongos. Após 35 dias, os camundongos tratados com bleomicina apresentaram uma alta carga de tumor de pulmão. No entanto, nos animais tratados com veículo, nenhum tumor foi detectado.
A carga tumoral de pulmão foi confirmada por histologia. Os pulmões pré-tratados com veículo não tinham evidência de nódulos tumorais, enquanto os pulmões pré-tratados com bleomicina tinham grandes nódulos tumorais. Após o transplante de uma linhagem celular metastática H2030 BrM 3, por 39 a 57 dias, a bioluminescência foi muito intensa para a imagem, então a metástase foi analisada em órgãos distantes ex vivo.
Pequenas lesões podem ser detectadas em vários tecidos, sugerindo que este método é promissor para estudar doenças disseminadas espontaneamente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 10 minutos por gaiola de cinco camundongos sem imagem e 20 minutos por gaiola ao também obter imagens dos camundongos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir a inserção adequada do cateter e monitorar a respiração do animal.
Após esse procedimento, outros métodos, como estudos farmacológicos ou química aminoacética do tecido colhido, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como os tumores enxertados respondem a drogas ou caracterizam interações estromais tumorais específicas dos pulmões. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode ser aplicada a diferentes cepas de camundongos e modelos de tumores, incluindo xenoenxertos derivados de pacientes em um ambiente fisiologicamente relevante. Não se esqueça de que trabalhar com bleomicina pode ser extremamente perigoso e precauções como manipulação em capuz de risco biológico e descarte adequado devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo descreve um método para melhorar o enxerto de células de câncer de pulmão em pulmões murinos por pré-condicionamento das vias aéreas através de lesão. Esta técnica pode facilitar o estudo de interações estromais, disseminação metastática e comorbidades do câncer de pulmão.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Oncologia
- Pesquisa Translacional
- Modelos Pré-Clínicos
Fundo
- Transplantar células de câncer de pulmão iniciais em camundongos é crucial para estudar a biologia do câncer.
- Entender a resistência a medicamentos e a relação entre fibrose e câncer de pulmão é essencial.
- Diferentes subtipos humanos de câncer de pulmão respondem variavelmente aos tratamentos.
- Modelos atuais podem não representar adequadamente essas variações.
Objetivo do Estudo
- Melhorar a eficiência do transplante de células de câncer de pulmão em camundongos.
- Estabelecer modelos pré-clínicos que possam responder a questões-chave na biologia do câncer.
- Modelar uma gama mais ampla de subtipos de câncer de pulmão humano.
Métodos Utilizados
- Camundongos são injetados com bleomicina para induzir lesão nas vias aéreas.
- Após 14 dias, células tumorais são injetadas nas vias aéreas.
- A eficiência do enxerto é avaliada em várias linhagens de camundongos.
- A análise das interações estromais e do comportamento metastático é conduzida.
Principais Resultados
- O método aumenta significativamente a eficiência de transplante de células iniciais tumorais.
- Permite a modelagem de diversos subtipos de câncer de pulmão.
- Insights sobre a relação entre câncer de pulmão e fibrose são obtidos.
- Possíveis implicações para terapia e compreensão da resistência a medicamentos são destacadas.
Conclusões
- Esta técnica melhora o estudo da biologia do câncer de pulmão em modelos pré-clínicos.
- Fornece uma plataforma para investigar respostas terapêuticas em vários subtipos de câncer de pulmão.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para explorar novas estratégias de tratamento.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Establishing physiologically relevant orthotopic lung cancer models remains a bottleneck in preclinical oncology due to low engraftment efficiency. This method addresses a critical discovery-stage challenge by enhancing tumor cell take rates through airway preconditioning, enabling more reliable assessment of tumorigenic capacity. Improved model fidelity supports better go/no-go decisions in target validation and lead identification by reducing biological noise and increasing predictive confidence in downstream therapeutic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in physiologically relevant lung microenvironment.
- Operational Value: Increases engraftment efficiency from 0-17% to 71-100%, reducing animal use and experimental variability.
- Strategic Value: Supports target de-risking by allowing consistent tumorigenic capacity assessment across mouse strains and tumor origins.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable bioluminescent readouts for longitudinal tumor burden monitoring.
- Operational Value: Standardizes orthotopic engraftment procedure across diverse murine models and cell sources.
- Strategic Value: Facilitates scalable screening of therapeutic agents in models that recapitulate lung-specific stromal interactions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models metastatic dissemination to distant organs, enabling study of clinically relevant disease progression.
- Operational Value: Works with limiting cell numbers, supporting preclinical testing of patient-derived xenografts and rare biospecimens.
- Strategic Value: Enhances preclinical continuity by linking fibrosis modulation to lung cancer outgrowth and therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for lung cancer programs where stromal context influences drug response.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on fibrosis-cancer interactions and stromal-mediated tumorigenicity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tumor take metrics essential for assay validation and compound prioritization.
- Analytics: Provides longitudinal bioluminescence and histological endpoints for comparative analysis of treatment effects.
- Translational Research: Models lung-to-organ metastasis, enabling evaluation of anti-metastatic strategies in vivo.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for engrafting diverse lung cancer subtypes across strains, reducing model development time.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tumorigenicity assays by reducing false-negative engraftment rates.
- Operational Value: Requires only 10-20 minutes per cage of five mice, supporting high-throughput model generation.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement by improving model reliability in preclinical efficacy studies.
- Portfolio Impact: Supports prioritization of lung cancer targets with enhanced preclinical validation in orthotopic settings.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine intubation and intratracheal injection techniques.
- Necessitates biosafety precautions for bleomycin handling, including use of a biohazard hood and proper waste disposal.
- Depends on access to bioluminescence imaging infrastructure for longitudinal engraftment monitoring.
- Requires standardization of bleomycin dosing and 14-day injury-to-engraftment interval across sites.
- Limited to immunocompromised or syngeneic models where engraftment is measurable; not applicable to immunocompetent syngeneic models without adaptation.
