Name: Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprenda a síntese manual de oligo-peptoides e análise de sequência por espectrometria de massa. Este método acessível permite caracterizar peptoides com resíduos especiais em laboratório padrão de química analítica.

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Os autores gostaria de agradecer o Sr. Michael Connolly e Dr. Ronald Zuckermann (The Foundry Molecular, Lawrence Berkeley National Laboratory) técnica apoio na síntese de peptoid. Reconhecemos o apoio da Fundação Nacional de ciência (-1301505). Todos os experimentos de espectrometria de massa foram realizados na instalação de espectrometria de massa de química na Universidade do Pacífico.

1. síntese de Peptoid
Nota: A síntese começa com a ativação da resina inchaço da resina e removendo o grupo protegendo. Isto é seguido pelo crescimento da cadeia de peptoid para a resina através de ciclos de adição do monômero de repetição. O primeiro monómero acoplado à resina é o resíduo do C-terminal. O peptoid é alongada do C-terminal para o extremidade N-terminal. Uma vez que a sequência de peptoid desejada é alcançada, a resina é clivada fora e o produto peptoid é purificado.
<ol><li>Preparação dos reagentes Nota: Os reagentes líquidos são medidos através de uma micropipeta e os reagentes sólidos são medidos através de uma balança analítica.<ol>
<li>Misturar 6,2 mL de N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) e 43,8 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) para preparar um 0,8 M de solução DIC/DMF.</li>
		<li>Dissolva 5,56 g da BMA em 50,0 mL de DMF para preparar uma solução de 0,8 M. o BMA/DMF.</li>
		<li>Misture 2 mL de piperidina (Pip) e 8 mL de DMF para atingir 20% solução de Pip/DMF.</li>
		<li>Dissolver 1,9 mL de Npe em 13,1 mL de DMF para atingir 1,0 M Npe/DMF.</li>
		<li>Dissolver a 1,3 mL de Nme em 13,7 mL DMF para atingir 1,0 M Nme/DMF.</li>
		<li>Dissolver 0,32 mL de Nae em 2 mL de DMF para atingir 1,0 M Nae/DMF. Cuidado: A maioria dos produtos químicos usados na síntese é perigosa. Ácido trifluoroacético (TFA), DIC, Pip e BMA são perigosos para a pele, olhos e vias respiratórias. DMF e diclorometano (DCM) são suspeitos de serem agentes cancerígenos. Todas as reações devem ser executadas em uma coifa e equipamento de protecção adequado deve ser usado. Por favor, verifique a folha de dados de segurança do material (MSDS) de todos os produtos químicos usados na síntese.</li>
	</ol></li>
	<li>Ativação de resina
	<ol>
<li>Meça 84 mg de resina de amida de Rink (resina, 0.047 mmol, carregando 0,56 mmol/g) e adicioná-lo para um recipiente de reação de fase sólida polipropileno de 10 mL. Insira o êmbolo na embarcação.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de CPO para o recipiente de reação e tampar o recipiente com uma tampa de pressão. Coloque o recipiente em um shaker e agitar o recipiente à temperatura ambiente em um ângulo de movimento de aproximadamente 12 graus e 385 oscilações/min para 30 min. Escorra a solução para um contentor de resíduos removendo a tampa e empurrar o êmbolo da embarcação da reação.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de solução de Pip/DMF de 20% para o navio e capitão do navio. Agite-o agitador por 2 min e drenar a solução para o recipiente de resíduos.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de solução de Pip/DMF de 20% para o navio, capitão do navio e agite-o em temperatura ambiente por 12 min. remover a tampa e esvazie a solução para o recipiente de resíduos.</li>
		<li>Lave a resina, adicionando 1 mL de DMF, tampando o recipiente e agitando o recipiente para 1 min. Retire a tampa e escorra a solução, empurrando o êmbolo. Lave a resina com DMF para 4 vezes adicionais.</li>
	</ol></li>
	<li>Adição do monômero e Acetilação N-terminal Nota: Cada ciclo de adição do monômero que envolve o deslocamento, bromoacetylation e reação de duas etapas.<ol>
<li>Realizar o primeiro ciclo de adição de monômero para formar o Nme-resina.</li>
		<li>Execute uma reação bromoacetylation. Misture 1 mL da solução de 0,8 M. o BMA/DMF e 1 mL de solução de 0,8 M DIC/DMF num copo. Transfira a mistura para um recipiente de reação contendo resina e capitão do navio. Coloque o recipiente no agitador e agite-o à temperatura ambiente por 20 min. remover a tampa e drenar a solução para o recipiente de resíduos.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1 mL de DMF, tampando o recipiente, agitando-lo por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Lave a resina adicionando 1 mL de DCM, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução. Lave a resina com DCM, mais uma vez e depois lave-o com DMF duas vezes.</li>
		<li>Realize uma reação de deslocamento. Adicione 1 mL de solução de 1,0 M Nme/DMF, capitão do navio, agitar o recipiente à temperatura de 60 min. remover a tampa e esvazie a solução empurrando o êmbolo.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1ml DMF, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Lave a resina por desenho em 1 mL DCM, agitando durante 1 min e drenar a solução. Lave o DCM mais uma vez, seguido por lavagem com DMF duas vezes.</li>
		<li>Repetir ciclos de adição do monômero de passos 1.3.2 a 1.3.5 para formar Nae-(Npe-Nme)4-resina. Quando repetir a etapa de reação de deslocamento (1.3.4), use uma solução de amina específicas de acordo com a sequência de peptoid. Nota: A cadeia de peptoid é alongada do C-terminal para o extremidade N-terminal com o resíduo do C-terminal ligado à resina.</li>
		<li>Executar a Acetilação N-terminal para formar Ac-Nae-(Npe-Nme)4-resina.</li>
		<li>Anidrido acético Mix 92 µ l dos, 43,5 µ l de N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) e 2 mL de DMF num copo para fazer cerca de 2 mL de acetilação cocktail.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de acetilação cocktail para o recipiente que contém resina, tampar o recipiente e agite-o à temperatura ambiente por 60 min. Retire a tampa e escorra a solução, empurrando o êmbolo.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1 mL de DMF, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Lave a resina adicionando 1 mL de DCM, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução. Repeti a lavagem da resina com DCM mais uma vez e, em seguida, lave-a com DMF mais duas vezes.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1 mL de DCM, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Repita a lavagem com DCM duas vezes. Retire a tampa e deixe a resina secar ao ar livre na embarcação da reação por 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Clivagem e purificação
	<ol>
<li>Misture 3,8 mL de TFA, 100 µ l de triisopropylsilane (dicas) e 100 µ l de HPLC-classe H2O em um copo para fazer 4 mL de clivagem cocktail.</li>
		<li>Adicionar 4 mL de acabadas clivagem cocktail para o recipiente que contém resina, tampar o recipiente e agite-o em temperatura ambiente por 2 h.</li>
		<li>Retire a tampa e recolher a filtrado solução para um tubo de centrifugação de polipropileno de 50 mL. Adicionar 1 mL de TFA para o navio, tampá-lo e agitar durante 1 min. recolher a filtrado solução no tubo de centrífuga mesmo.</li>
		<li>Evapore o TFA soprando em um fluxo de gás nitrogênio suavemente até que cerca de 1 mL solução viscosa.</li>
		<li>Adicionar 15 mL de éter dietílico para o restante da solução tampão tubo de centrífuga e incube-lo em um congelador-20 ° C durante 2 h durante a noite. O peptoid bruto precipita como sólido branco.</li>
		<li>Sedimento sólido utilizando uma centrífuga a 4.427 x g durante 10 min. remover a tampa do tubo e decantar éter etílico em um béquer cuidadosamente sem perder o sólido. Atenção: o éter etílico é um solvente orgânico inflamável. Por favor, use uma centrífuga seguro de éter dietílico.</li>
		<li>Lavar o sólido adicionando 10 mL de éter dietílico gelado em centrífuga tubo contendo o sólido, tampando o tubo e colocá-lo na centrífuga. Realize a centrifugação a 4.427 x g durante 10 min. Retire o centrifugador do tubo de centrífuga e decantar éter etílico em um béquer cuidadosamente sem perder o sólido.</li>
		<li>Seca o sólido soprando suavemente em um fluxo de gás nitrogênio.</li>
		<li>Adicione 10 mL de HPLC-classe H2O para dissolver o sólido seco. Passar a solução através de um filtro de seringa de nylon com tamanho de poros de 0,45 µm e recolher o filtrado para um tubo de centrifugação polipropileno de 50ml previamente ponderada.</li>
		<li>Escudo congelar a solução colocando e girando o tubo de centrífuga contendo a solução de peptoid em um 12 onças, double-Stack expandido poliestireno copo 1/3 cheio de nitrogênio líquido. Lyophilize a solução congelada durante a noite para render peptoid sólido.</li>
		<li>Repita mais uma vez de liofilização dissolvendo o sólido peptoid em 10 mL de HPLC-classe H2O, shell congelamento em nitrogênio líquido e liofilização durante a noite. A peptoid resultante é suficientemente puro para análise de sequências por espectrometria de massa.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS medições e análise de sequência
Nota: O experimento de MS/MS é realizado em um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo, acoplado a uma fonte de ionização (ESI) electrospray. Coleta de dados é controlada usando o software de aquisição de dados acompanhado com o instrumento. O procedimento geral inclui 1) executa a experiência de espectrometria de massa de varredura completa e gravando o espectro de massa, 2) realizando a CID MS/MS experimentar e gravação do espectro de MS/MS e 3) comparando os dados espectrais de MS/MS com teórica esquema de fragmentação previu baseia a característica estrutural da peptoid.
<ol><li>Preparação da solução de amostra
	<ol>
<li>Pese 1,0-2,0 mg peptoid sólido em um frasco de vidro de 3 a 5 mL. Adicione 1 mL de mistura solvente acetonitrila e água (ACN/H2O, 1:1, v/v) para dissolver o peptoid. Isto dá a solução estoque da amostra com uma concentração de cerca de 10-3 M.</li>
		<li>Transferência de 20 µ l de solução para um tubo de centrifugação de 1,5 mL e adicionar 1 mL de mistura solvente de ACN/H2O para produzir uma solução diluída de amostra de cerca de 10-5 M.</li>
		<li>Remover quaisquer possíveis partículas insolúveis na solução de amostra diluída, realizando a centrifugação a 4.427 x g por 3 min. transferir cerca de 700 µ l da parte superior da solução para outra centrífuga 1,5 mL tubo para fazer o peptoid MS solução de trabalho com concentração de cerca de 10-5 M.</li>
		<li>Ajuste a concentração da solução de trabalho de MS com base na intensidade do sinal observado durante as medições de espectrometria de massa.</li>
		<li>Uma maneira alternativa para remover quaisquer possíveis partículas insolúveis na solução de amostra diluída é passar a solução de amostra através de um filtro de seringa 0,20 µm e recolher o filtrado para um tubo de centrifugação de 1,5 mL para fazer o peptoid MS solução de trabalho de cerca de 10-5 M.</li>
	</ol></li>
	<li>Gravação de espectros de massa
	<ol>
<li>Executar a mistura de solventes de ACN/H2O (1:1, v/v) com a fonte de ionização (ESI) electrospray e configurar o instrumento em um íon positivo padrão, o modo de varredura completa espectrometria de massa com uma gama de relação massa-de-carga (m/z) de 100-1500. Nota: Parâmetros de funcionamento típicos: Tensão de agulha ESI, 5 kV Tensão capilar, 40 V Secagem a temperatura do gás (gás nitrogênio), 200 ° C.</li>
		<li>Adicionar aproximadamente 300 µ l de solução de trabalho de peptoid MS (cerca de 10-5 M) em um 500 µ l ou uma seringa de 1 mL e conecte a seringa de entrada do ESI usar capilar poliéter éter cetona (PEEK) produto. Coloque a seringa para a bomba de seringa e definir a taxa de fluxo em 10 µ l/min para infundir a solução de amostra na entrada do ESI.</li>
		<li>Ligue a tensão de agulha ESI para ativar o processo ESI e em seguida, ligue o detector. Configurar a visualização no modo de perfil e na faixa de 100-1.500 m/z. Exibir um perfil de espectro de massa mostrado na janela de perfil. O pico m/z 1.265 (exibido como m/z de 1,264.6) corresponde a peptoid peptoid de íon ou protonados.</li>
		<li>Grave o espectro de MS por 2 min. Em "Método janela", usar 2 min como o "tempo de execução". Abra a janela de gravação e preencha um nome de arquivo apropriado e começar a gravar o espectro. Nota: O espectro de massa resultante é mostrado na Figura 3.</li>
		<li>Otimize a intensidade do pico m/z de 1.265. Definir o intervalo de m/z para 1.150-1.350 e ajustar a tensão capilar enquanto visualiza o pico de intensidade em mV mostrada na janela de perfil. Por exemplo, aumentar a tensão capilar para 50 V ou superior e visualizar a mudança do pico de intensidade. A intensidade de pico ideal é em torno de 150-200 mV. Nota: Ajuste a tensão capilar pode alterar significativamente a abundância de certos íons. Aumentando a tensão capilar pode aumentar a intensidade do íon peptoid. No entanto, uma alta tensão capilar também pode induzir a dissociação do íon peptoid na fonte de íons e diminuir a intensidade observada. Ajustar a temperatura do gás de secagem pode aumentar a intensidade do pico m/z 1.265, mas é menos eficaz que o ajuste da tensão capilar. Se o pico m/z 1.265 não atingir a intensidade ideal, ajuste a concentração de amostra (ou exemplo, dobro a concentração da solução de trabalho de MS).</li>
		<li>Alterne o aparelho para o modo de MS/MS. Definir o íon precursor em m/z 1.265 e as MS/MS massa gama em m/z de 100-1.400. Em "Método janela," usar m/z 1.265 como a "primeira missa Q1" e deixe a "última missa Q1" em branco. Use m/z 100 como o "Q3 primeira missa" e m/z 1.400 como o "Q3 última missa." Nota: No modo de MS/MS, o primeiro quadrupolo unidade (Q1) funciona como um filtro em massa para isolar o íon peptoid como o íon precursor, a segunda unidade de quadrupolo (Q2) é uma célula de colisão e as funções de unidade (Q3) quadrupolo terceiros como um analisador de massa.</li>
		<li>Conjunto de pressão a energia de colisão em 40 eV e o gás de colisão (árgon, neste caso) em 1,5 mTorr.</li>
		<li>Exibir um perfil de espectro de massa exibido na janela de perfil. O pico m/z de 1.265 corresponde ao íon peptoid, e os picos com valores mais baixos de m/z representam os fragmentos do íon peptoid.</li>
		<li>Ajuste a energia de colisão para otimizar a exibição do espectro de fragmentação. Por exemplo, aumentar a energia de colisão de 45 eV... e ver a mudança do perfil do espectro. Nota: em geral, aumentando a energia de colisão irá aumentar a abundância de íons de fragmento e reduzir a abundância do íon peptoid. Aumentando a pressão do gás de colisão também aumentará a abundância dos íons fragmento. ADVERTÊNCIA: Não aumente a pressão de gás de colisão além 2 mTorr.</li>
		<li>Registro do espectro de MS/MS, por 2 min. Em "Método janela," usar 2 min como o "tempo de execução". Abra a janela de gravação e preencha um nome de arquivo apropriado e começar a gravar o espectro.</li>
		<li>Repeti a gravação 1 - 2 vezes.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de sequência de Peptoid Nota: Sob a condição de CID, o íon peptoid iria fragmentar nas ligações Amida ao longo da espinha de peptoid para produzir uma série de fragmentos de N-terminal chamado B-íons e uma série de fragmentos C-terminal chamado Y-íons<ol>
<li>Retire a estrutura química da peptoid acetificado, colocando o N-terminal do lado esquerdo e o C-terminal do lado direito e desenhar uma linha tracejada em cada ligação Amida para gerar um esquema de fragmentação, como mostrado na Figura 2a. Desenhe um próton com um círculo tracejado para indicar a transportadora de carga. A partir do lado esquerdo da estrutura, Coloque etiquetas em linhas tracejadas para indicar os fragmentos do N-terminal como B1, B2, B8. A partir do lado direito, Coloque etiquetas em linhas tracejadas para indicar os fragmentos C-terminais como Y1, Y2, Y8. Nota: Um software de desenho químico pode ser utilizado para desenhar a estrutura de peptoid.</li>
		<li>Imagine a fragmentação no laço de Amida 4th do lado esquerdo e desenhar as estruturas do fragmento N-terminal e o fragmento do C-terminal com adequada acusações formais, como mostrado na Figura 2b. Colocar a etiqueta de B4 o fragmento N-terminal e colocar a etiqueta de Y5 o fragmento C-terminal. Calcular o valor de B4 m/z somando as massas nominais dos elementos na estrutura para produzir um valor de 580 e coloque o fragmento N-terminal m/z 580. Calcular o valor de Y5 m/z e coloque o fragmento C-terminal m/z 685.</li>
		<li>Calcular os valores de m/z para todos os oito íons de B e todos os oito íons de Y e reuni-los em uma tabela, conforme mostrado na tabela 1. Nota: Os valores de m/z dos fragmentos podem ser calculados usando uma software de desenho de química.</li>
		<li>Abra o espectro de MS/MS gravado da peptoid usando o software de análise de dados acompanhado com o instrumento. Defina as preferências de rotulagem para "Mostrar rótulos de Ion" e limiar de rótulo para 3%. Isso gera um espectro de MS/MS com m/z valores rotulados nos picos.</li>
		<li>Exporte a MS/MS espectrais dados como um arquivo de texto CSV a formatar e reconstruir o espectro usando software de processamento de dados. Coloque valores m/z nos picos. O espectro de MS/MS resultante é mostrado na Figura 4. Nota: Alguns espectrómetros de massa estão equipados com software de processamento de dados capaz para gerar o espectro de MS/MS. Neste caso, exportando os dados espectrais de MS/MS não é necessário.</li>
		<li>Atribua os valores de m/z mostrados o espectro de MS/MS àqueles mostrados na tabela 1 para identificar os correspondentes B - e Y-íons. Por exemplo, o pico m/z 580 é identificado como o B-4-íon e m/z 685 é identificado como o Y5-íon. Rotule os picos com símbolos correspondentes de B e Y no espectro, como mostrado na Figura 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed100202f">Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory.</a> J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).</li>
<li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+submonomer+synthesis+of+peptoid+Polymers+and+their+self-assembly+into+highly-ordered+nanosheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Visualized+Exp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets.</a> J. Visualized Exp. (57), e3373(2011).</li>
<li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type%2FArginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1387380611003071">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li>
<li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li>
<li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Um peptoid nonamer, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, tem sido sintetizado usando o protocolo apresentado. O aparelho de síntese envolve uma embarcação da reação de fase sólida polipropileno como seringa e um agitador mecânico. Os vasos de reação são comercialmente disponíveis e de baixo custo. Um agitador mecânico é um aparelho comum em laboratórios de química. Com o uso de uma embarcação da reação como seringa, soluções podem ser sugadas e empurradas para fora do navio, manualmente, movendo o êmbolo. Esta té...

Peptoids são uma classe de polímeros sequência controlada com estruturas de espinha dorsal, imitando a estrutura de peptídeos. Peptoids pode ser sintetizado a partir diversas aminas, que permite peptoids a expor propriedades altamente sintonizável1,2. Peptoids têm sido utilizados como modelos moleculares para pesquisas biofísicas, considerados como agentes terapêuticos e concebido como ligantes para proteínas3,4,5,6. Peptoids foram desenvolvidos em uma variedade de compostos biologicamente ativos, tais como materiais anti-incrustantes e anticorpo-mimética, agentes antimicrobianos e inibidores de enzima7,8,9. Com uma natureza altamente ordenada e ajustável, peptoids têm também sido pensado como um tipo de armazenamento de informação molecular10. A descoberta dessas chamadas de diversas aplicações para o desenvolvimento de métodos analíticos eficientes para caracterizar a sequência e estrutura de peptoids. Técnicas de espectrometria de massa em tandem-baseado mostraram a promessa como o método de escolha para analisar as propriedades de sequência de polímeros sequência controlada, incluindo peptoids11,12,13, 14,15. No entanto, estudos sistemáticos, correlacionando os padrões de fragmentação do íon peptoid resultantes de estudos de espectrometria de massa e as informações estruturais de peptoids são muito limitados.
Peptoids podem ser facilmente sintetizados usando um método de fase sólida. O método desenvolvido envolve uma iteração de um monômero do Two-Step adição ciclo16,17. Em cada ciclo de adição, uma amina ligados a resina é acetilada por um haloacetic ácido (normalmente bromoacético BMA), e este é seguido por uma reação de deslocamento com uma amina primária. Embora a síntese automatizado protocolos foram rotineiramente aplicados para a síntese de peptoid, peptoids podem ser sintetizados manualmente com excelente rendimento em um padrão química laboratório16,18,19, 20.
Nosso laboratório tem adotado o método da síntese de peptoid manual e simplificado o aparelho utilizado nos métodos existentes. Estudamos, anteriormente, os padrões de fragmentação de uma série de peptoids, usando técnicas de MS/MS21,22,23. Nossos resultados mostram que peptoids produzir fragmentações características quando eles estão sujeitos a dissociação induzida por colisão (CID)21,23 ou captura eletrônica-experiências de dissociação (ECD)22 . Neste artigo, demonstramos como oligo-peptoids pode ser sintetizado em um laboratório de química padrão, como a realizar os experimentos de CID usando um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo e como analisar os dados espectrais. O peptoid a ser sintetizado e caracterizado é um nonamer com Acetilação N-terminal e C-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. A estrutura da peptoid é mostrada na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Espectrômetro de massa quadrupolo triplo ESI, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>O espectrômetro de massa foi adquirido da Varian, Inc.</td></tr><tr><td>Varian MS Workstation, Versão 6.9.2, um software de aquisição e análise de dados</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>O software faz parte do pacote Varian 320L</td></tr><tr><td>Shaker de ação de pulso Burrell Scientific, Modelo 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Hermle, Modelo Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaso de reação em fase sólida, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Capacitores de pressão para vasos de reação</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa, tamanho de poros 0,2 e mu; m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa, tamanho dos poros 0,45 e mu; m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Remolcadores de centrífuga de polipropileno, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Remolcadores de centrífuga de polipropileno, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, Versão 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>A CambridgeSoft agora faz parte da PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Copo de isopor, 12 oz</td><td>Supermercado Comum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina amida de pista</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidina</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>N, N'-diisopropilcarbodimimida</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>Ácido bromoacético</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>2-Feniletilamina</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Metioxietilamina</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-etilendiamina</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido acético</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimetilformamida</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Destilação adicional antes do uso</td></tr><tr><td>N, N-diisopropiletilamina</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropilsilanano</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>Sistema Acadêmico de Purificação de Água Millipore MILLI-Q</td><td>Millipore Corporation</td><td>ZMQP60001</td><td>Para gerar água de grau HPLC</td></tr><tr><td>Água de grau HPLC</td><td></td><td></td><td>Produzido pela Millipore MILLI-Q&reg; Sistema Acadêmico de Purificação de Água</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>Grau HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>Grau HPLC</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Destilação adicional antes do uso</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Destilação adicional antes do uso</td></tr><tr><td>Gás nitrogênio</td><td>Fresno Oxigênio/Suprimento Barnes</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Ultra alta pureza, 99,9995%</td></tr><tr><td>Gás argônio</td><td>Fresno Oxigênio/Suprimento Barnes</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Ultra alta pureza, 99,9995%</td></tr></tbody></table>

síntese e análise de espectrometria de massa de oligo-peptoids

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids são oligômeros peptídeo-imitando sequência controlada constituído por unidades de N-alquilados de glicina. Entre muitas aplicações potenciais, peptoids ter sido pensado como um tipo de armazenamento de informação molecular. Análise de espectrometria de massa tem sido considerada o método de escolha para peptoids de sequenciamento. Peptoids podem ser sintetizados via química de fase sólida usando um repetição ciclo de reação em duas fases. Aqui nós apresentamos um método para sintetizar manualmente oligo-peptoids e analisar a sequência do peptoids usando técnicas de espectrometria de massa (MS/MS) em tandem. A amostra peptoid é um nonamer consistindo de alternadas de N-(2-methyloxyethyl) glicina (Nme) e N-(2-feniletílico) glicina (Npe), bem como uma N-(2-aminoetil) glicina (Nae) no N-terminal. A fórmula de sequência do peptoid é Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, onde Ac é o grupo acetila. A síntese ocorre em uma embarcação da reação de fase sólida comercialmente disponível. A resina de Amida rinque é usada como o sólido apoio para produzir o peptoid com um grupo de amido no C-terminal. O produto resultante do peptoid é submetido a análise de sequência usando um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo, acoplado a uma fonte de ionização electrospray. A medição de MS/MS produz um espectro de íons fragmento resultante da dissociação do peptoid carregado. Os íons de fragmento são classificados com base nos valores de sua relação massa-de-carga (m/z). Os valores de m/z dos íons fragmento são comparados com as massas nominais de íons do fragmento teoricamente previsto, de acordo com o esquema de peptoid de fragmentação. A análise gera um padrão de fragmentação do peptoid carregado. O padrão de fragmentação é correlacionado com a sequência de monômero do peptoid neutro. A este respeito, MS análise lê as informações de sequência do peptoids.

A estrutura de um peptoid 9-mer com Acetilação N-terminal, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, é mostrada na Figura 1. O peptoid foi sintetizado manualmente em uma embarcação da reação de polipropileno fritado através de abordagem de fase sólida. Resina de amida de pista (0,047 mmol, 84 mg com carregamento 0,56 mmol/g) é usada como o sólido apoio para produzir o peptoid com um amidated C-terminal. A cadeia de peptoid é construída por vários ciclos de...

Um protocolo é descrito para a síntese manual de oligo-peptoids seguido por análise de sequência por espectrometria de massa.

Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

O objetivo geral desse procedimento é demonstrar como sintetizar manualmente oligo-peptoides e como analisar sua sequência de monômeros utilizando técnicas de espectrometria de massa. O método pode ajudar iniciantes a responder perguntas-chave em um campo peptoide, como como criar peptoides e como caracterizar sua sequência de monômeros. A principal vantagem dessa técnica é que peptoides com resíduos especiais de monômero podem ser sintetizados e analisados no laboratório padrão de química analítica.Embora esse método foque em oligo-peptoides, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como peptídeos e oligonucleotídeos. Geralmente, pessoas novas nessa técnica terão dificuldades porque alcançar condições ótimas de espectrometria de massa é difícil sem demonstração visual. Tivemos a ideia desse método quando queríamos caracterizar as características estruturais dos peptoides por meio de métodos de espectrometria de massa em tandem.Primeiro, pese 84 miligramas de resina amida de Rink e adicione a um vaso de reação de 10 mililitros de polipropileno em fase sólida. Depois, insira um desentupidor no recipiente. Em seguida, adicione dois mililitros de TMF ao recipiente de reação e t

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Uma maneira rápida é descrito para obter insights sobre a estrutura de polissacarídeos em uma matriz extracelular. O método aproveita a especificidade do glycosylhydrolases ea sensibilidade da espectrometria de massa permitindo que pequenas quantidades de materiais a serem analisados. Esta técnica é adaptável para ser usada diretamente sobre o tecido em si.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

Padrões de Isótopos estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide (SISCAPA) casais enriquecimento afinidade de peptídeos com isótopos estáveis ​​de diluição espectrometria de massa (MRM-MS) para fornecer a medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. Aqui nós descrevemos o protocolo usando partículas magnéticas em um formato parcialmente automatizados.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

Um simples e gerais método de síntese manual de peptoid envolvendo equipamentos básicos e reagentes disponíveis comercialmente é delineado, permitindo Peptóides para ser facilmente sintetizado na maioria dos laboratórios. A síntese, purificação e caracterização de um 36mer peptoid anfifílicos é descrito, bem como a sua auto-montagem em altamente ordenado nanofolhas.

Síntese em fase sólida Submonomer de Polímeros Peptoid e seus Automontagem em altamente ordenada nanofolhas

Peptídeo amidas terciárias (PTA) são uma super família de peptidomiméticos que incluem mas não estão limitados a péptidos, peptóides e peptídeos N-metilados. Aqui nós descrevemos um método sintético que combina split-and-piscina e estratégias sub-monômero para sintetizar um talão biblioteca de um composto de PTAs.

Split-and-piscina Síntese e Caracterização de Peptídeos Terciário Amide Biblioteca

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Triphosforilação química de Oligonucleotídeos

Aprenda a síntese manual de oligo-peptoides e análise de sequência por espectrometria de massa. Este método acessível permite caracterizar peptoides com resíduos especiais em laboratório padrão de química analítica.

Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids

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