Estimulação elétrica transcraniana crônica e gravação Intracortical em ratos

O objetivo geral deste procedimento é mostrar um protocolo passo a passo para fabricar e implantar eletrodos de estimulação transcraniana crônica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroestimulação, como os efeitos a longo prazo da estimulação elétrica transcraniana difusa direcionada temporalmente. A principal vantagem desta técnica é que o pequeno tamanho do implante torna este método adequado para ser combinado com técnicas eletrofisiológicas optogenéticas e de imagem regulares em animais em movimento livre.

As implicações desta técnica estão centradas na terapia da epilepsia, depressão e outros distúrbios neuropsicológicos, pois é capaz de influenciar prontamente as redes cerebrais em grande escala. Para fazer um eletrodo de estimulação, corte seis pedaços de 10 centímetros de comprimento de fios de conexão em miniatura. Remova dois centímetros do revestimento em uma extremidade e um centímetro na outra extremidade.

Em seguida, torça dois cabos juntos e solde-os com o lado descascado mais curto. Depois, adquira uma tira de três embalagens de fita de qualquer circuito integrado com caixa SOT-353. Costure os fios trançados nos três orifícios da embalagem.

O segmento descascado mais longo dos fios deve estar nas cavidades da embalagem. Posicione o cabo de forma que a extremidade do isolamento fique alinhada com a borda dos orifícios. Em seguida, aplique cimento dental nos furos para fixar os fios.

Assim que o cimento estiver solidificado, vire a embalagem para inserir uma fina camada de super cola no orifício para formar uma vedação do tipo água em direção ao cimento poroso. Evite colar os fios descascados. Depois disso, torça os cabos juntos no lado descascado mais curto e solde-os.

Pegue o segmento mais longo e descascado dos fios com a ponta de uma pinça fina. Enrole-os e envolva-os nas cavidades. Corte o excesso de cabo, se necessário.

Para fazer um eletrodo tripleto de gravação, corte um pedaço de tubo de aço inoxidável de um centímetro de comprimento usando uma serra rotativa de alta velocidade. Remova a aleta das extremidades do tubo com uma agulha afiada e certifique-se de que o tubo esteja livre de detritos e completamente permeável. Dobre o pino espaçador da placa banhado a ouro com o comprimento mínimo de três centímetros para formar um suporte em forma de J.

Corte a perna mais longa da forma de J e solde-a para obter de volta a forma original para fazer uma junta destacável entre a parte linear longa, que será mantida pelo dispositivo estereotáxico, e a forma de U, que segurará o eletrodo e servirá como ponto de ancoragem. Em seguida, cole o tubo e a perna mais curta do suporte em J. Cole algumas barras adicionais de um centímetro de comprimento, se necessário, para estabilidade.

Em seguida, corte três pedaços de fios de eletrodo de 2,5 centímetros de comprimento com uma tesoura ultrafina de aço inoxidável. Certifique-se de que seja um corte claro e nítido e que o isolamento esteja intacto na superfície circular do fio do eletrodo. Além disso, certifique-se de que a ponta cortada não esteja dobrada devido à força aplicada.

Dobre um ou dois milímetros em uma extremidade de cada um dos fios em ângulos diferentes para torná-los distinguíveis. Em seguida, preencha o tubo com os fios e escolha um espaçamento adequado dos eletrodos para o experimento. Observe qual fio corresponde a qual profundidade para manter uma ordem de canal adequada.

Uma vez que os fios se alinham um ao lado do outro e estão paralelos ao tubo, fixe os fios do eletrodo colocando uma única gota de super cola líquida em ambas as extremidades do tubo com uma agulha afiada. Certifique-se de que a cola esteja fluindo para dentro do tubo devido ao efeito capilar, mas não em direção aos locais de gravação nas extremidades salientes. Prepare uma placa de interface de eletrodo com um microconector adequado compatível com um sistema de registro a ser usado.

Em seguida, introduza as extremidades dobradas dos fios nos orifícios da placa de interface do eletrodo correspondentes ao canal de gravação desejado. Quando todos os fios estiverem na posição, empurre os pinos dourados nos orifícios com uma pinça. Neste procedimento, remova a maior parte do cabelo do couro cabeludo do animal com uma máquina de cortar cabelo.

Em seguida, aplique creme depilatório no couro cabeludo. Espalhe uniformemente na superfície e aguarde alguns minutos. Use uma espátula para remover suavemente o creme e o cabelo restante.

Enxágue a pele com desinfetante. Injete 1 a 2% de lidocaína por via subcutânea para anestesiar a pele. Em seguida, aplique uma única gota de pomada veterinária em cada olho.

Faça uma incisão sagital completa e longa ao longo da linha média com um bisturi da testa ao pescoço. Em seguida, disseque os tecidos, incluindo o periósteo do crânio. Em seguida, usando um cinzel ou pinça de dente, limpe a área entre as cristas dos dois ossos temporais.

Mantenha o crânio exposto retraindo a pele dissecada usando quatro buldogues. Coloque delicadamente as pinças finas entre a borda íngreme do osso temporal e os músculos e separe-os. Faça movimentos de agitação para expor o máximo possível da grande superfície do osso temporal, de preferência da borda do osso occipital até o plano das suturas coronais sem danificar os músculos.

Em seguida, coloque os afastadores bitemporalmente para manter os ossos temporais expostos. Enxágue a superfície do crânio com um a dois mililitros de peróxido de hidrogênio a 3%. Em seguida, lave-o com um a dois mililitros de água com muito cuidado e deixe a superfície dos ossos temporais limpar a umidade com bastões oculares.

Em seguida, teste se os eletrodos de estimulação se encaixam na superfície vertical limpa do crânio. A borda superior do eletrodo de estimulação deve estar alinhada com a borda da crista do osso temporal. Reajuste os buldogues e os afastadores, ou molde os eletrodos de estimulação com tesoura, se necessário.

Em seguida, preencha as cavidades dos eletrodos de estimulação com gel eletrocondutor. E coloque uma fina camada de cola na borda dos eletrodos. Coloque o eletrodo de estimulação na superfície seca do osso temporal com um movimento preciso e segure-o firmemente no lugar por um minuto com uma pinça fina.

Certifique-se de que não há umidade em contato com a cola e limpe com bastões oculares, se necessário. Certifique-se de que o eletrodo de estimulação esteja uniformemente colado ao osso temporal seco. Limpe a umidade com frequência e retraia os tecidos circundantes com cuidado.

Peça ajuda, se necessário. Depois disso, aplique cimento dental nas bordas do eletrodo de estimulação enquanto a umidade vazada dos tecidos é continuamente seca com bastões oculares. Cubra todo o eletrodo de estimulação com cimento.

Depois que o cimento estiver completamente endurecido, repita essas etapas no lado contralateral. Posteriormente, usando uma cabeça de broca de diâmetro 10% menor em comparação com o diâmetro do parafuso, faça alguns furos em todo o crânio para ancorar os parafusos. Insira parafusos em miniatura nos orifícios e aplique cimento dental sobre eles.

Em seguida, continue com a implantação dos eletrodos de registro. Solde os conectores e prenda-os à construção no final. Em seguida, lave abundantemente os tecidos expostos com desinfetante.

Injete 1 a 2% de lidocaína por via subcutânea. Em seguida, para criar bordas enroladas, envolva-as com suturas simples interrompidas ao redor do implante do conector. Em seguida, desinfete a ferida com iodopovidona.

Aqui, mostramos os resultados representativos de um sistema de detecção e intervenção de crises epilépticas de circuito fechado, aplicado em ratos Long-Evans, expressando convulsões espontâneas. Este trem é conhecido por mostrar os sintomas comportamentais em padrões eletrográficos de epilepsia de ausência, chamados de pico e descarga de onda. Aqui são mostrados os traços LFP da intervenção convulsiva, demonstrando o desempenho estável dos estímulos temporalmente direcionados na interrupção das convulsões por 16 semanas.

Isso demonstra a robustez e confiabilidade dos eletrodos de estimulação implantados. Para contextualizar esses resultados, aqui está a gravação de um experimento abortado em que o tecido secundário cresceu entre o osso temporal e a superfície do eletrodo, devido à vedação e cimentação inadequadas dos eletrodos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como implantar eletrodos de estimulação transcraniana.

Após este procedimento, outros métodos, como implantação de eletrodos de registro ou janelas cranianas, podem ser realizados para registrar diferentes modalidades durante a estimulação.