Coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos

O objetivo deste estudo é determinar como coletar sêmen pós-acasalamento do trato reprodutivo feminino e como medir a liquefação do sêmen em camundongos. Os animais utilizados neste estudo foram manejados de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Washington e em conformidade com os protocolos de animais aprovados pela WSU 4702 e 4735. Em humanos, o sêmen ejaculado é depositado na parede anterior da vagina adjacente à ectocérvix.

Em camundongos, no entanto, o sêmen é varrido para o útero minutos após o acasalamento. O sêmen contém gel seminal que se solidifica segundos após a ejaculação, fazendo com que o esperma seja imobilizado. O processo de liquefação muda o sêmen de gelatinoso para uma consistência aquosa.

Este processo é essencial para a motilidade espermática e a reprodução dos mamíferos. A atividade enzimática do Antígeno Prostático Específico ou PSA é o principal contribuinte para a liquefação por meio da hidrólise do gel seminal ou proteína formadora de gel presente no sêmen. A degradação da proteína formadora de gel libera o esperma do coágulo seminal, aumentando a mobilidade dos espermatozoides para que os espermatozoides nadem em direção ao trato reprodutivo feminino superior para fertilizar o óvulo na trompa de Falópio.

O método de coleta de sêmen do trato reprodutivo feminino e a medição do tempo de liquefação presentes neste estudo fornecerão aos pesquisadores uma nova ferramenta diagnóstica para determinar se a liquefação pode ser uma das causas de infertilidade no organismo modelo de interesse. Em seguida, estão os procedimentos em que os camundongos são acasalados e o tampão vaginal é determinado. Podem ser utilizados ratinhos machos adultos C57BL/6 padrão ou outras estirpes de interesse.

Foram utilizadas apenas fêmeas na fase de estro do ciclo. Para obter detalhes sobre o método de esfregaço vaginal e análise citológica, consulte os procedimentos publicados anteriormente. Às quatro da tarde.

No dia do estro, a fêmea foi alojada na gaiola do macho. Na manhã seguinte, às oito horas, a fêmea é separada da gaiola do macho. Usando um palito de dente estéril, a presença ou ausência de deposição de um tampão vaginal ou copulatório foi avaliada como uma indicação de acasalamento usando um procedimento adaptado de um método publicado anteriormente.

Em seguida, é o procedimento de preparação antes da coleta de tecido. Prepare 10 mililitros de meio L-15 de Leibovitz suplementado com 1% de soro fetal bovino ou meio L-15 mais 1% de FBS em um tubo de 15 mililitros. Aqueça a mídia a 37 graus Celsius por 15 minutos.

A fim de preservar a viabilidade do tecido e do esperma para aplicações a jusante, alíquota de dois mililitros de meio em um tubo de dois mililitros para coleta de tecido. Aqueça o estágio do microscópio estéreo a 37 graus Celsius. Defina o bloco de calor para 37 graus Celsius.

Coloque um tubo vazio no bloco de calor. Aqueça também a lâmina de vidro a 37 graus Celsius se a aplicação a jusante exigir imagens da motilidade dos espermatozoides. A seguir estão os procedimentos para coleta de tecidos.

Aqui estão as ferramentas que serão usadas para a coleta de tecidos. Eutanasiar a fêmea imediatamente após verificar o plugue usando asfixia com dióxido de carbono seguida de luxação cervical. Coloque o animal em decúbito dorsal para expor a região abdominal.

Pulverize 70% de etanol no abdômen. Faça um pequeno corte de aproximadamente um centímetro na pele na parte inferior do abdômen. Puxe a cauda e a pele em direções opostas para expor o músculo abdominal.

Corte o músculo abdominal em forma de V na base do abdômen. Mova os intestinos e a gordura abdominal para o lado para expor o trato reprodutivo. Apare a bexiga e outros tecidos acima da área vaginal.

Corte a sínfise púbica para obter acesso aos tecidos vaginais. Puxe a parte ligada à sínfise púbica usando uma pinça de tubo para expor o canal vaginal. Levante o tecido vaginal na abertura vaginal e use uma tesoura para separar o canal vaginal do tecido retal abaixo.

Corte cuidadosamente a gordura mesentérica de ambos os lados do útero usando uma tesoura de mola. O útero é muito frágil com o sêmen dentro. Portanto, o investigador deve ter cuidado para não perfurar o útero ou o sêmen será perdido.

Corte a almofada de gordura ovariana de ambos os lados dos ovários. Transfira todo o trato reprodutivo para o tubo de meio pré-aquecido. Em seguida, é o método para medição da liquefação do sêmen.

Aqui estão as ferramentas para coleta de sêmen. Transfira três mililitros do meio quente para um prato de 3,5 centímetros. Transfira o lenço para o prato.

Lave o lenço várias vezes agarrando a almofada de gordura. Nesse ponto, o sêmen ainda deve estar intacto dentro do útero. Seque o tecido em Kimwipes para se livrar do excesso de mídia.

Segure o tecido na extremidade vaginal e coloque o tecido na trompa pré-aquecida, levantando as extremidades do ovário dentro de uma trompa vazia. Corte os dois chifres uterinos entre a vagina e o útero. Deixe o sêmen fluir dos chifres uterinos para a trompa.

Use uma pinça desdentada para espremer e expelir suavemente o sêmen restante nos chifres uterinos. Gire brevemente o sêmen de um a dois segundos. Coloque o tubo paralelo ao aquecido stage.

Insira um tubo capilar de 25 microlitros na amostra de sêmen em um ângulo de 180 graus. Isso é para minimizar a variabilidade entre cada examinador de segurar o tubo capilar em diferentes ângulos. Registre o tempo que leva para o sêmen atingir a linha de 25 microlitros.

O tempo de liquefação é quantificado pelo tempo necessário para encher o tubo capilar de 25 microlitros com sêmen. O sêmen coletado dos úteros de controle levou aproximadamente dois minutos para encher o tubo capilar. No entanto, o sêmen coletado do útero nocaute levou mais de 60 minutos de tempo experimental.

Esses dados sugerem que o sêmen é significativamente mais liquefeito no controle em comparação com os úteros knockout. Aqui está um dos exemplos de aplicação downstream usando imagens de vídeo da motilidade espermática. Use uma ponta de pipeta para pipetar 25 microlitros do sêmen restante na lâmina de vidro pré-aquecida enquanto a lâmina de vidro é colocada no aquecedor stage.

Cubra a lâmina com uma lamínula de vidro. Transfira a lâmina para o microscópio colocando a lamínula para baixo. Use lentes objetivas de 20X para encontrar o esperma.

Em seguida, mude para lente objetiva 100X para imagens de vídeo. Grave o vídeo a 12 quadros por segundo por 30 segundos. O sêmen coletado dos úteros de controle mostra espermatozóides nadando livremente dentro do campo microscópico.

No entanto, o sêmen coletado dos úteros knockout mostrou que a maioria dos espermatozoides estava agrupada com mobilidade mínima. Esses achados sugerem que o sêmen coletado do trato reprodutivo feminino oito horas após o acasalamento pode ser usado para análises posteriores. Além dessas aplicações a jusante, os investigadores também podem avaliar o efeito dos inibidores ou compostos de interesse que interferem em diferentes processos do transporte de espermatozoides, processos como liquefação de espermatozoides, número de espermatozoides no trato, motilidade espermática ou migração de espermatozoides em diferentes áreas do trato reprodutivo feminino.

Os compostos podem ser aplicados no trato reprodutivo feminino antes do acasalamento. Em seguida, o impacto desses inibidores ou compostos pode ser avaliado a partir de uma amostra de sêmen pós-acasalamento. Esses métodos podem ser úteis para testar a praticidade de drogas anticoncepcionais que inibem o transporte de espermatozoides.