Name: Coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprenda a coletar sêmen pós-acasalamento do trato reprodutivo feminino e medir o tempo de liquefação em camundongos. Este método permite avaliar a mobilidade espermática e mecanismos de liberação celular.

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Este trabalho é apoiado pelo fundo de start-up de faculdade de medicina veterinária (WSU) para WW. Os autores agradecer Sierra Olsen (WSU) para leitura crítica deste manuscrito.

Todos os animais e os procedimentos utilizados neste estudo foram tratados de acordo com orientações do Comité de uso e cuidado do Animal de Washington State University (WSU) de acordo com protocolos animais aprovados WSU 4702 # e #4735.
1. ratos
<ol><li>
Use padrão C57BL/6J ratos machos adultos ou outras cepas de interesse. Manter os animais sob um ambiente de temperatura e umidade controlada, com acesso ad libitum de água e comida.
	<ol>
<li>Use reprodutores machos variando de 8 semanas de idade de 10 meses de idade. Use apenas os criadores comprovados nos experimentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Usar ratos fêmeas adultos com uma exclusão seletiva de tecido do trato reprodutivo estrogênio receptor α (codificada pelo gene Esr1 ) no10 células epiteliais (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, chamado nocaute ou "KO") e controlar littermates (Esr1f/f, chamado "CTRL") neste estudo.
	<ol>
<li>Use 8 semanas de fêmeas. As idades das fêmeas variaram dependendo do experimento de interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine as fases do ciclo estral às 08:00 h da manhã. Use somente as fêmeas na fase de estro do ciclo. Para métodos detalhados de mancha vaginal e análise citológica, consulte os procedimentos publicados anteriormente11.</li>
</ol>2. acasalamento e avaliar copuladores plugues
<ol><li>O dia do estro (16:00 h), na casa a fêmea na gaiola de um macho.</li>
	<li>Na manhã seguinte (08:00 h), separe a fêmea do rato masculino.</li>
	<li>Use uma adaptação de um método previamente publicado12 para acessar a presença ou ausência de um plug vaginal ou imperatividade como uma indicação de acasalamento.</li>
	<li>Segure o mouse feminino da base da cauda para brevemente levantar as patas.</li>
	<li>Encontre a ficha copulador pela presença de um coágulo seminal off-White na abertura vaginal usando um palito de dente. Se o plugue imperatividade está presente, o palito não será capaz de ser inserido no canal vaginal.</li>
</ol>3. preparação antes da coleta de tecido
<ol><li>Prepare-se 10 mL de mídia de L-15 do Leibovitz, suplementada com 1% de soro fetal bovino (chamado L15 media + 1% FBS) em um tubo de 15 mL. Incube a mídia a 37 ° C por 15 min em banho-maria.</li>
	<li>A fim de preservar a viabilidade do tecido e esperma para aplicações a jusante, alíquota 2 mL de pré-aquecido L15 media + 1% FBS numa microcentrifuga 2 mL tubo para coleta de tecido.</li>
	<li>Aquecer a fase do microscópio estereoscópico para 37 ° C. Definir o calor-bloco 37 ° c e colocar um tubo de microcentrifugadora de vazio 1,5 mL no bloco.</li>
	<li>Se as aplicações a jusante requerem imagiologia da motilidade espermática, aquecer a lâmina de vidro para 37 ° C.</li>
</ol>4. tecido coleção
<ol><li>Trazer pré-aquecido L15 mídia + alíquota de 1% FBS para a área de coleção de tecidos.</li>
	<li>Abater a fêmea (~ 08: 30h) usar o dióxido de carbono asfixia seguido por deslocamento cervical. Nota: Este é aproximadamente 8 h após o acasalamento, supondo que o acasalamento ocorre à meia-noite.</li>
	<li>Coloque o animal em posição supina para expor a área abdominal.</li>
	<li>Borrife o álcool a 70% no abdômen perto membros posteriores.</li>
	<li>Use a tesoura de dissecação para fazer um pequeno corte (~ 1 cm) na pele do abdômen inferior.</li>
	<li>Use a mão dominante para puxar o rabo (e membros posteriores se necessário) enquanto a mão não dominante puxa a pele na direção oposta (em direção a cabeça) para expor os músculos abdominais. Este método é usado para minimizar a quantidade de contaminação de cabelo para os órgãos viscerais.</li>
	<li>Corte o músculo abdominal em uma forma de V na base do abdômen, adjacente à vagina, para expor os órgãos viscerais.</li>
	<li>Mova os intestinos e gordura abdominal para o lado para expor o trato reprodutivo.</li>
	<li>Retire a bexiga e outros tecidos acima a área vaginal.</li>
	<li>Cortadas sínfise púbica para obter acesso ao tecido vaginal.</li>
	<li>Levante o tecido vaginal na abertura vaginal e usando tesouras para separar o canal vaginal do tecido retal.</li>
	<li>Cuidadosamente retire a gordura mesentérica de ambos os lados do útero usando uma tesoura de mola. Atenção: O útero é muito frágil com o sêmen para dentro. Tenha cuidado para não perfurar o útero, ou então o sêmen será perdido.</li>
	<li>Levante o trato reprodutivo mais baixo e cortar do tecido ovariano fora de ambos os lados.</li>
	<li>Tracto reprodutivo de transferência para o tubo do Leibovitz previamente aquecido media L-15 + 1% FBS.</li>
</ol>5. medição de liquefação do sêmen (viscosidade) de coleção de conteúdo uterina
<ol><li>Na fase aquecida do microscópio estereoscópico, os tecidos em um prato de cultura de tecido estéril de 35mm preenchidos com 3,5 mL de transferência pré aquecido L-15 media + 1% FBS para limpar tecidos do sangue e outros contaminantes. Atenção: Durante a lavagem, pegue os tecidos pela gordura, não o útero. Neste ponto, o sémen é esperado estar intacto dentro do útero.</li>
	<li>Borre os tecidos do excesso mídia usando toalhetes de laboratório.</li>
	<li>Mantenha o tecido na extremidade vaginal enquanto colocando as extremidades dos ovários no tubo microcentrifuga pré-aquecido. Mantendo o fim vaginal, corte os cornos uterinos na base do útero, permitindo que os cornos uterinos a cair dentro do tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Deixe o sémen fluxo fora os cornos uterinos no tubo. Use fórceps desdentado para apertar suavemente os cornos uterinos da extremidade ovariana à extremidade vaginal, expulsar o sêmen de sobra.</li>
	<li>Descarte os tecidos em saco de risco biológico e incinerar.</li>
	<li>Brevemente spin para baixo o sêmen em uma minicentrifuge (~ 1-2 s).</li>
	<li>Colocar o tubo, paralelo à fase aquecida - sémen não vai derramar para fora.</li>
	<li>Tem o temporizador pronto e definido para 'contar'.</li>
	<li>Inserir um tubo capilar de 25 µ l da amostra de sêmen em um ângulo de 180° (paralela à parede do tubo). Isto é para minimizar a variabilidade entre cada investigador de segurando o tubo capilar em ângulos diferentes.</li>
	<li>Pressione o cronômetro assim que o tubo capilar faz contato com o sêmen.</li>
	<li>Registro do (s) de tempo que leva para o sémen alcançar a linha de 25 µ l.</li>
	<li>Quando a medição estiver concluída, coloque imediatamente o tubo contendo o sêmen volta no bloco de calor seco para posterior análise funcional, tais como a imagem latente de motilidade espermática.</li>
	<li>Desinfectar o tubo capilar contendo sêmen imergindo o tubo em solução 10% por 20 min e descartar o tubo capilar no recipiente de objectos cortantes.</li>
</ol>6. a imagem da motilidade espermática
<ol><li>Liga o microscópio e o software de imagem de vídeo.</li>
	<li>Pipete 20 µ l de sêmen restante a lâmina de vidro previamente aquecido, enquanto a lâmina de vidro é colocada no palco aquecido.</li>
	<li>Cobrir com uma lamela de vidro.</li>
	<li>Coloque o lado de lamela de slide para baixo no microscópio.</li>
	<li>Use 20 X objectiva para encontrar a área de interesse.</li>
	<li>Alterar para 100 lente objetiva de X para a imagem latente.</li>
	<li>Gravar o vídeo em 12 quadros/s (fps) para 30 s.</li>
	<li>Aleatoriamente, grave os vídeos em pelo menos 3 diferentes áreas por animal.</li>
	<li>Executar a imagem rapidamente e minimizar a exposição à luz para o slide a fim de preservar a viabilidade e motilidade espermática. Nota: Este procedimento de imagens deve ser feito dentro de 2-3 min.</li>
	<li>Realizar a análise de dados utilizando o software ImageJ como descrito anteriormente8.</li>
</ol>

<ol><li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li>
<li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li>
<li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+semenogelin%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li>
<li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semenogelin%2C+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li>
<li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer%3A+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li>
<li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li>
<li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility%2C+capillary+tube+test%2C+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Androl%22%5BJournal%5D)">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li>
<li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743(2017).</li>
<li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+semen+hyperviscosity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li>
<li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li>
<li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+vaginal+lavage%2C+crystal+violet+staining%2C+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389(2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/10293">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li>
<li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Coleta de sêmen de úteros de rato pode fornecer vantagens sobre sêmen análise em vitro , como o antigo pode ilustrar as interações fisiológicas entre o esperma e as secreções do tracto reprodutivo feminino. As técnicas apresentadas neste estudo permitem aos investigadores determinar a qualidade do sêmen, bem como a viabilidade do esperma e a mobilidade em condições fisiológicas ideais. Além disso, existem várias análises a jusante que podem ser executadas usando o sêmen coletado o útero, por exemplo, o ...

Aparelho reprodutor feminino é composto pelo trato superior e inferior. O trato reprodutivo superior inclui trompas de Falópio, o útero e o endocérvice. O trato reprodutivo inferior inclui o ectocérvice e a vagina. Em humanos, ejaculou sêmen é depositado na parede anterior da vagina, adjacente à ectocérvice1. Em camundongos, entretanto, o sémen é arrastado para o útero dentro de minutos após o acasalamento de2.
Sêmen contém gel seminal que é solidificado em segundos da ejaculação, fazendo com que o esperma a ser aprisionado e imobilizada3. Liquefação libera o esperma imobilizado, alterando o sêmen de um gel-like para uma consistência aquosa. Este processo é essencial para a mobilidade do esperma e a reprodução dos mamíferos. Conhecimento de liquefação do sêmen baseia-se principalmente em vitro estudos onde o sêmen torna-se liquefeito em um prato de cultura. Em humanos, a atividade enzimática de antígeno prostático específico ou PSA (também conhecido como calicreína-relacionados peptidase 3 ou KLK3) é o principal contribuinte para liquefação por hidrólise de semenogelins (formação de gel de proteínas presentes no sêmen)4 ,5,6. Degradação de semenogelins libera o esperma da hemostase seminal, aumentando a mobilidade do esperma. Libertou o esperma nadar em direção de Falópio para fecundar o óvulo. Liquefação (ou viscosidade do sêmen) testes são uma das sessões iniciais padrão para análise de sêmen em clínicas de fertilidade para avaliar a fertilidade masculina7.
Um artigo recentemente publicado mostra que a análise do fluido seminal coletado do rato fêmea trato reprodutivo pós acasalamento pode ser usada para ilustrar uma deficiência na liquefação que posteriormente pode causar defeitos de fertilidade8. Liquefação defeituosa como sémen hiperviscosidade contribui para 11,8-32,3% dos casos inférteis em homens9, sugerindo que a liquefação normal é indispensável para a reprodução dos mamíferos. No entanto, estudos e tratamento de defeitos de liquefação têm-se centrado exclusivamente no masculino7. Não tem sido explorada a possibilidade de que o trato reprodutivo feminino desempenha um papel na liquefação do sêmen. Portanto, os métodos de colheita de sémen e medir o tempo de liquefação fornecerá pesquisadores uma nova ferramenta de diagnóstica para determinar se a liquefação pode ser uma das causas de infertilidade no organismo modelo de interesse.

<table><tbody><tr><td>Palito</td><td>Diamond</td><td>750-Flat</td><td>Autoclavado estéril, use palito embotado. Não use</td></tr><tr><td>tesoura de dissecação</td> pontiaguda <td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>25-&mu; L tubo capilar de vidro</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s Mídia L-15</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td>Suplemento com 1% de FBS</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-A</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor digital de bloco seco</td><td>VWR</td><td>13259-052</td><td>Para aquecer o tubo de microcentrífuga antes da colheita de sémen</td></tr><tr><td>Minicentrífuga</td><td>Corning</td><td>LSE 6765</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 35 mm</td><td>VWR</td><td>10861-656</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mL</td><td>VWR</td><td>10025-686</td><td></td></tr><tr><td>Precisão em banho-maria</td><td></td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio de palco aquecido</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ10F</td><td>Para manter o tecido quente antes de Microscópio</td></tr><tr><td>de campo claro</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td>Opcional. Para imagens de vídeo da motilidade do esperma</td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC2900</td><td>Opcional. Para imagens de vídeo da motilidade do esperma</td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Opcional. Para imagens de vídeo da motilidade espermática</td></tr><tr><td>Lamínula</td><td>VWR</td><td>48393-059</td><td>Opcional. Para imagens de vídeo da motilidade espermática</td></tr><tr><td>Alvejante</td><td></td><td></td><td>Diluir em dH2O até 10% de concentração</td></tr></tbody></table>

coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Em camundongos, ejaculou esperma é depositada no útero. Após a ejaculação, o sémen altera a consistência de gel-like para aguado, um processo chamado de liquefação. Neste estudo, mostramos como coletar o sêmen pós-ejaculou do tracto reprodutivo feminino em um modelo do rato. Primeiros, adultos ratos fêmeas na fase de estro foram alojados em jaula de um macho durante a noite. Na manhã seguinte, cópula foi confirmada pela presença de imperatividade plug na abertura vaginal. Camundongos fêmeas com plugues copulativo foram sacrificados, e cada trato reprodutivo foi coletado como um todo (vagina, útero, ovidutos, ovários), assegurando um sistema fechado para conter o sêmen. O trato reprodutivo foi colocado em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, e a vagina foi cortada para liberar o sêmen para dentro do tubo. Para garantir o volume de sêmen máxima para análise, pinças desdentadas foram usadas para espremer os cornos uterinos de extremidade ovariana vaginal fim expelir sémen restante. Tracto reprodutivo então foi Descartado. O tubo contendo sêmen brevemente foi girado para baixo. Uma pipeta capilar 25 μL foi colocada dentro do tubo em um ângulo de 180° (paralela à parede do tubo). A quantidade de tempo usado para encher o tubo capilar à linha 25 μL foi gravada. Sêmen de um reprodutor masculino comprovado normalmente leva cerca de 60-180 s para encher um tubo capilar de 25 μL. Esta técnica de coleta de sêmen também pode ser usada em outras aplicações a jusante, tais como análise de imagens e motilidade do esperma.

Sêmen foi colhido em CTRL e KO fêmeas aproximadamente 8 h após o acasalamento com machos férteis do CTRL. Liquefação (ou viscosidade do sêmen) é quantificada pelo tempo necessário para encher o tubo capilar de 25 μL com sêmen. Sêmen coletado do útero CTRL levou 2,06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) para encher o tubo capilar (Figura 1). No entanto, o sêmen coletado do útero KO demorou mais de 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) do tempo experimental. Estes dados sugerem que ...

Liquefação do sêmen é necessária para que o esperma ser libertado do gel seminal. Este estudo fornece os procedimentos para a recolha de sémen de coito de pós o trato reprodutivo feminino e medir o tempo de liquefação do sêmen.

Coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

O objetivo deste estudo é determinar como coletar sêmen pós-acasalamento do trato reprodutivo feminino e como medir a liquefação do sêmen em camundongos. Os animais utilizados neste estudo foram manejados de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Washington e em conformidade com os protocolos de animais aprovados pela WSU 4702 e 4735. Em humanos, o sêmen ejaculado é depositado na parede anterior da vagina adjacente à ectocérvix.Em camundongos, no entanto, o sêmen é varrido para o útero minutos após o acasalamento. O sêmen contém gel seminal que se solidifica segundos após a ejaculação, fazendo com que o esperma seja imobilizado. O processo de liquefação muda o sêmen de gelatinoso para uma consistência aquosa.Este processo é essencial para a motilidade espermática e a reprodução dos mamíferos. A atividade enzimática do Antígeno Prostático Específico ou PSA é o principal contribuinte para a liquefação por meio da hidrólise do gel seminal ou proteína formadora de gel presente no sêmen. A degradação da proteína formadora de gel libera o esperma do coágulo seminal, aumentando a mobilidade dos espermatozoides para que os espermatozoides nadem em direção ao trato reprodutivo feminino superior para fertilizar o óvulo na trompa de Falópio.O método de coleta de sêmen do trato reprodutivo feminino e a medição do tempo de liquefação presentes neste estudo fornecerão aos pesquisadores uma nova ferramenta diagnóstica para determinar se a liquefação pode ser uma das causas de infertilidade no organismo modelo de interesse. Em seguida, estão os procedimentos em que os camundongos são acasalados e o tampão vaginal é determinado. Podem ser utilizados ratinhos machos adultos C57BL/6 padrão ou outras estirpes de interesse.Foram utilizadas apenas fêmeas na fase de estro do ciclo. Para obter detalhes sobre o método de esfregaço vaginal e análise citológica, consulte os procedimentos publicados anteriormente. Às quatro da tarde.No dia do estro, a fêmea foi alojada na gaiola do macho. Na manhã seguinte, às oito horas, a fêmea é separada da gaiola do macho. Usando um palito de dente estéril, a presença ou ausência de deposição de um tampão vaginal ou copulatório foi avaliada como uma indicação de acasalamento usando um procedimento adaptado de um método publicado anteriormente.Em seguida, é o procedimento de preparação antes da coleta de tecido. Prepare 10 mililitros de meio L-15 de Leibovitz suplementado com 1% de soro fetal bovino ou meio L-15 mais 1% de FBS em um tubo de 15 mililitros. Aqueça a mídia a 37 graus Celsius por 15 minutos.A fim de preservar a viabilidade do tecido e do esperma para aplicações a jusante, alíquota de dois mililitros de meio em um tubo de dois mililitros para coleta de tecido. Aqueça o estágio do microscópio estéreo a 37 graus Celsius. Defina o bloco de calor para 37 graus Celsius.Coloque um tubo vazio no bloco de calor. Aqueça também a lâmina de vidro a 37 graus Celsius se a aplicação a jusante exigir imagens da motilidade dos espermatozoides. A seguir estão os procedimentos para coleta de tecidos.Aqui estão as ferramentas que serão usadas para a coleta de tecidos. Eutanasiar a fêmea imediatamente após verificar o plugue usando asfixia com dióxido de carbono seguida de luxação cervical. Coloque o animal em decúbito dorsal para expor a região abdominal.Pulverize 70% de etanol no abdômen. Faça um pequeno corte de aproximadamente um centímetro na pele na parte inferior do abdômen. Puxe a cauda e a pele em direções opostas para expor o músculo abdominal.Corte o músculo abdominal em forma de V na base do abdômen. Mova os intestinos e a gordura abdominal para o lado para expor o trato reprodutivo. Apare a bexiga e outros tecidos acima da área vaginal.Corte a sínfise púbica para obter acesso aos tecidos vaginais. Puxe a parte ligada à sínfise púbica usando uma pinça de tubo para expor o canal vaginal. Levante o tecido vaginal na abertura vaginal e use uma tesoura para separar o canal vaginal do tecido retal abaixo.Corte cuidadosamente a gordura mesentérica de ambos os lados do útero usando uma tesoura de mola. O útero é muito frágil com o sêmen dentro. Portanto, o investigador deve ter cuidado para não perfurar o útero ou o sêmen será perdido.Corte a almofada de gordura ovariana de ambos os lados dos ovários. Transfira todo o trato reprodutivo para o tubo de meio pré-aquecido. Em seguida, é o método para medição da liquefação do sêmen.Aqui estão as ferramentas para coleta de sêmen. Transfira três mililitros do meio quente para um prato de 3,5 centímetros. Transfira o lenço para o prato.Lave o lenço várias vezes agarrando a almofada de gordura. Nesse ponto, o sêmen ainda deve estar intacto dentro do útero. Seque o tecido em Kimwipes para se livrar do excesso de mídia.Segure o tecido na extremidade vaginal e coloque o tecido na trompa pré-aquecida, levantando as extremidades do ovário dentro de uma trompa vazia. Corte os dois chifres uterinos entre a vagina e o útero. Deixe o sêmen fluir dos chifres uterinos para a trompa.Use uma pinça desdentada para espremer e expelir suavemente o sêmen restante nos chifres uterinos. Gire brevemente o sêmen de um a dois segundos. Coloque o tubo paralelo ao aquecido stage.Insira um tubo capilar de 25 microlitros na amostra de sêmen em um ângulo de 180 graus. Isso é para minimizar a variabilidade entre cada examinador de segurar o tubo capilar em diferentes ângulos. Registre o tempo que leva para o sêmen atingir a linha de 25 microlitros.O tempo de liquefação é quantificado pelo tempo necessário para encher o tubo capilar de 25 microlitros com sêmen. O sêmen coletado dos úteros de controle levou aproximadamente dois minutos para encher o tubo capilar. No entanto, o sêmen coletado do útero nocaute levou mais de 60 minutos de tempo experimental.Esses dados sugerem que o sêmen é significativamente mais liquefeito no controle em comparação com os úteros knockout. Aqui está um dos exemplos de aplicação downstream usando imagens de vídeo da motilidade espermática. Use uma ponta de pipeta para pipetar 25 microlitros do sêmen restante na lâmina de vidro pré-aquecida enquanto a lâmina de vidro é colocada no aquecedor stage.Cubra a lâmina com uma lamínula de vidro. Transfira a lâmina para o microscópio colocando a lamínula para baixo. Use lentes objetivas de 20X para encontrar o esperma.Em seguida, mude para lente objetiva 100X para imagens de vídeo. Grave o vídeo a 12 quadros por segundo por 30 segundos. O sêmen coletado dos úteros de controle mostra espermatozóides nadando livremente dentro do campo microscópico.No entanto, o sêmen coletado dos úteros knockout mostrou que a maioria dos espermatozoides estava agrupada com mobilidade mínima. Esses achados sugerem que o sêmen coletado do trato reprodutivo feminino oito horas após o acasalamento pode ser usado para análises posteriores. Além dessas aplicações a jusante, os investigadores também podem avaliar o efeito dos inibidores ou compostos de interesse que interferem em diferentes processos do transporte de espermatozoides, processos como liquefação de espermatozoides, número de espermatozoides no trato, motilidade espermática ou migração de espermatozoides em diferentes áreas do trato reprodutivo feminino.Os compostos podem ser aplicados no trato reprodutivo feminino antes do acasalamento. Em seguida, o impacto desses inibidores ou compostos pode ser avaliado a partir de uma amostra de sêmen pós-acasalamento. Esses métodos podem ser úteis para testar a praticidade de drogas anticoncepcionais que inibem o transporte de espermatozoides.

collection-post-mating-semen-from-female-reproductive-tract

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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