Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

O objetivo geral deste procedimento é gerar um mosaico genético no córtex cerebral de camundongos, induzindo a recombinação Cre-Lox por meio de eletroporação in utero. Este método de geração de mosaicos genéticos pode ajudar a responder a questões-chave em neurobiologia. Como determinar se um gene é necessário para um determinado fenótipo neuronal de maneira autônoma da célula.

A principal vantagem desta técnica é que o sistema de recombinação Cre-Lox eficaz é combinado com uma técnica de entrega de genes igualmente eficaz na eletroporação do útero. Embora esse método esteja focado em direcionar neurônios corticais da camada dois a três, ele pode ser usado para direcionar neurônios em outras profundidades das camadas corticais. Quando tentamos fazer mosaicos genéticos em nosso tecido cerebral, encontramos vários problemas para fazer com que nossos animais experimentais sobrevivessem após o nascimento, então introduzimos várias simplificações e refinamentos em nossa técnica.

Prepare uma pipeta com um cone muito longo e ponta muito fina, típica de pipetas para injeção de células-tronco embrionárias ou transferência nuclear, inserindo primeiro o capilar de vidro no extrator de pipetas. Após a fixação das braçadeiras, ative o programa para puxar o protocolo, criando um cone no capilar de vidro. Certifique-se de que o comprimento do cone esteja entre 10 e 15 mm usando um microscópio óptico composto.

Em seguida, para quebrar a ponta da pipeta, centralize uma tarefa de camada única, limpe um copo de 50 mL e estique-o com uma mão. Com a outra mão, empurre a pipeta puxada, com o lado cônico para baixo, perpendicularmente através do centro do lenço, causando uma quebra limpa no cone. Verifique o tamanho da abertura em um microscópio de luz composto.

Em seguida, calibre a pipeta aspirando 1 mcL de azul de tripano a 0,4% e PBS em uma pipeta parcialmente cheia e gradua a pipeta com marcações de 1 mcL com base na altura de 1 mcL na pipeta. Use a pipeta calibrada para graduar outras pipetas puxadas antes de descartá-las. Coloque as pipetas no porta-pipetas livres de poeira e outras partículas.

Depois de anestesiar profundamente uma rata grávida em E-15.5, teste o reflexo de endireitamento inclinando suavemente a câmara de indução e observando a resposta do camundongo. Se o reflexo de endireitamento estiver ausente, transfira o camundongo para a área de preparação cirúrgica e administre isoflurano inalado através de um cone nasal para manter um plano cirúrgico de anestesia. Use uma pinça para testar o reflexo pedal para verificar a anestesia.

Monitore a frequência respiratória em esforço, procurando respiração profunda e regular e que as membranas mucosas sejam de cor rosa e úmidas. Aplique pomada oftálmica veterinária suficiente sobre os olhos para cobri-los completamente para proteção contra o ressecamento. Massageie o creme depilatório na região abdominal com cotonetes até que o pelo abdominal se dissolva.

Em seguida, limpe o pelo abdominal. Limpe cuidadosamente qualquer resíduo restante e creme depilatório com etanol 70% e cotonetes. Aplique a solução esfoliante à base de iodo na área abdominal em movimentos circulares.

Em seguida, use um campo cirúrgico para isolar a área cirúrgica e manter as condições estéreis. Depois de fazer uma incisão na linha média ventral de 2 cm na pele, encontre a linha alba para visualizar a linha média do reto abdominal. Puxe o músculo para cima e para longe do abdômen e faça uma incisão na linha média de 2 cm para expor a cavidade abdominal usando técnicas assépticas.

Usando uma ponta de micropipeta estéril de 10 mcL, dispense carprofeno na cavidade abdominal para analgesia. Em seguida, prenda uma pinça de mosquito Hartmann na borda esquerda da incisão do reto abdominal. Descanse a pinça na placa de Petri virada à esquerda da incisão, mantendo o lado esquerdo da incisão aberto.

Depois de apertar o lado direito da incisão de maneira semelhante, coloque uma esponja de gaze ao redor da área da incisão. Usando uma pinça de anel sem um parafuso limitador anexado, puxe o útero entre quaisquer dois embriões vizinhos sem esmagar ou ferir nenhum tecido. Comece a retirar todos os embriões através da incisão, colocando-os em cima da esponja de gaze.

Conecte uma pipeta calibrada ao conjunto do tubo aspirador e injete exatamente 1 mcL de solução de DNA preparada através da parede uterina em um ventrículo lateral de cada embrião. Use o polegar e o indicador para manipular os embriões, permitindo que os embriões sejam empurrados suavemente contra a parede uterina durante a injeção. Os ventrículos laterais aparecem como duas manchas mais escuras no telencéfalo dorsal do embrião.

Confirme a injeção bem-sucedida observando o azul de tripano preenchendo o ventrículo lateral. Depois de injetar todos os embriões, coloque o cátodo de eletrodos do tipo pinça no útero, diretamente sobre o córtex medial e caudal para atingir o córtex visual. Coloque o ânodo logo abaixo e anterior à cabeça do embrião.

Com o pedal, acione a entrega de pulsos de 550 ms de 50 volts separados por um intervalo de 950 ms. Após eletroporar todos os embriões, retorne o útero à cavidade abdominal na mesma orientação em que foi encontrado. Use solução salina para lubrificar o útero enquanto o guia manualmente e com extrema suavidade, tomando cuidado para não deslocar os embriões de sua posição no útero.

Feche os músculos abdominais com suturas absorvíveis. Use um ponto simples interrompido, amarrando as pontas com um nó de cirurgião. Feche a camada da pele com suturas absorvíveis.

Aplique uma pequena quantidade de adesivo tecidual para selar a ferida. Aplique adesivo de tecido nos nós para evitar que se solte. Use uma micropipeta para remover qualquer adesivo tecidual ao redor da ferida que possa ser aspirado.

Assim que o adesivo tecidual estiver seco, remova o animal do isoflurano e permita que a fêmea se recupere sozinha em uma gaiola quente. Continue monitorando o mouse até que ele esteja totalmente recuperado e se comportando normalmente. Uma vez removido, coloque a fêmea de volta na gaiola com o macho.

Coloque o crânio em uma superfície plana com lenços umedecidos com 1-x PBS. Usando uma pinça, primeiro remova o osso occipital. Em seguida, remova cuidadosamente os ossos parietais, removendo as pinças para fora e para longe da superfície do cérebro.

Remova cuidadosamente todas as meninges para evitar danos ao córtex. Coloque a parte de trás da pinça sob o cérebro ao longo do crânio para cortar todos os nervos cranianos e remover o cérebro. Use uma lâmina de barbear de ponta única para fazer um corte coronal de aproximadamente 0,5 mm rostral à bregma e outro corte coronal de aproximadamente 0,5 mm caudal ao tecido de interesse.

O bloco de tecido agora está pronto para seccionamento. A injeção de 1 mcL de 2 mg / mL de GFP Cre resulta em uma distribuição esparsa de células marcadas, algumas das quais podem ser brilhantes. Como o tecido é seccionado a 100 mícrons, a maioria dos mandris dendríticos é preservada.

Quando a eletroporação in utero é realizada no dia embrionário 15.5, a marcação ocorre nas camadas corticais dois e três. Espinhos dendríticos podem ser observados em altas ampliações. A injeção de 1,5 mcL de 2 mg/mL de GFP Cre resulta em uma marcação muito densa, que pode ser abaixo do ideal, pois é difícil rastrear a origem de neuritos e espinhas dendríticas.

No entanto, ao selecionar uma célula brilhante na periferia da área marcada, ainda é possível obter imagens de um neurônio e seus processos. Alternativamente, a injeção de construções SuperNova resulta em uma distribuição esparsa de neurônios da camada dois a três que são rotulados de forma muito brilhante. Uma vez dominada, a cirurgia de eletroporação in utero levará menos de 30 minutos se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento com outras construções de DNA, é importante lembrar de tentar diferentes concentrações e volumes, isso ajudará a alcançar a esparsidade desejada de marcação necessária para a análise do mosaico. Nossos resultados representativos usaram uma única construção ou uma construção SuperNova recentemente inventada. Neste último, descobrimos que poderíamos obter uma excelente rotulagem esparsa, maximizando o brilho dos neurônios.

Essa técnica pode ser adaptada para criar tecido cerebral em mosaico de outras maneiras. Por exemplo, a edição de genes CRISPR e Cas9 pode ser combinada com eletroporação in utero, ou a recombinação Cre-Lox pode ser combinada com injeção intraventricular de vetores virais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de várias técnicas simplificadas e refinadas usadas para obter um mosaico genético esparso, para que você possa combinar a recombinação Cre-Lox e a eletroporação in utero.

Desejamos-lhe boa sorte.