Name: Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprenda a induzir recombinação Cre-Lox no córtex cerebral de camundongos por eletroporação in utero. Este método permite estudar funções celulares autônomas de genes em neurônios corticais.

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Os autores graças ao apoio generoso da James Madison University departamento de biologia e da facilidade de Imaging e James Madison University microscopia de luz. Dr. Mark L. Gabriele para conselhos úteis sobre preparação de jovens pós-natal tecido, e DRS Justin W. Brown e Corey L. Cleland para coordenação generoso de espaço e materiais cirúrgicos. Esta pesquisa foi financiada em parte por uma concessão de pesquisa colaborativa por 4-VA, uma parceria de colaboração para fazer avançar a Commonwealth da Virgínia (G.S.V.) e por uma Virginia Academia de ciência pequeno projeto bolsa de investigação (G.S.V.). Suporte foi generosamente fornecido por uma doação de Betty Jo amoroso Butler 58 para bolsa de pesquisa de graduação (para K.M.B.), uma bolsa de pesquisa do verão de Farrell (para K.M.B.), um James Madison University segundo século Scholarship (para K.M.B.), um James Universidade de Madison do centenário uma bolsa (C.J.H.), uma Universidade de James Madison Lucy Robinson busca 30 bolsa de Memorial (para Z.L.H.) e um James Madison Universidade faculdade de Ciências e matemática da faculdade assistência Grant (para G.S.V.).

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<li>Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+Electroporation+Approaches+to+Study+the+Excitability+of+Neuronal+Subpopulations+and+Single-cell+Connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
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<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
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<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047(2010).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Aqui, apresentamos a combinação de eletroporação no utero com Cre recombinase em camundongos floxed para gerar o tecido cerebral de mosaico. Uma vantagem dessa abordagem é que uma nova linha de rato não precisa ser gerado cada vez um diferente subtipo de celular está a ser alvo: eletroporação no utero pode ser usada para direcionar os neurônios excitatórios, neurônios inibitórios ou glia dependendo do tempo e localização do electroporation15,16<...

Gerar um mosaico genético é um paradigma clássico experimental para a compreensão da função de um gene de interesse. Para determinar se um gene é necessário para um fenótipo celular, a abordagem mais simples é causar uma perda de função do gene em todo o organismo (por exemplo, nocaute). No entanto, para determinar se um gene é necessário especificamente em um determinado tipo de célula, nocaute do gene em todo o organismo não é uma abordagem válida. Em vez disso, um método é necessário que causará a perda da função de um gene em uma determinada célula enquanto está rodeado por tecido de sua (ou seja, geneticamente imperturbável) — em outras palavras, criando tecidos de mosaico. Se a célula mutante mostra um fenótipo mutante, mas células circundantes de sua não, fazem as funções de gene de forma autónoma a célula. Análise do tecido do mosaico, no qual as células mutantes estão rodeadas por tecido de sua, é ideal para compreender a célula autónomos funções dos genes, especialmente no cérebro onde os neurônios e glia formam uma vasta rede interligada de tecido.
Várias formas de tecido cerebral de mosaico forneceram modelos poderosos para investigar a célula autónomos funções dos genes. Estudos focados em transplante neuronal1, mosaicismo feminino ligado ao X2,3,4, e mosaicismo somático endógena5,6 ter desenhado suas conclusões com base em mosaico tecido cerebral. Exclusão condicional de um gene através do sistema de recombinação de Cre-lox é um método que tira proveito da grande disponibilidade de linhas de rato transgénico. Neste método, os dois sites loxP são introduzidos em ambos os lados de uma sequência necessária de um gene (tais como um exon), deixando ladeado por loxP sites que ambos enfrentam na mesma direção ("floxed"). CRE recombinase excises a sequência entre os sites de loxP7. Mediada por CRE recombinação pode ser conseguida cruzando ratos de floxed para outra linha de rato que expressam a recombinase Cre junto com um marcador fluorescente em um subconjunto de células ("linha de repórter de Cre"). Isto foi demonstrado em uma variedade de maneiras para descobrir as funções de um gene em subconjuntos de células, como neurônios excitatórios ou astrócitos8. Linhas de repórter CRE podem expressar CreERT2 para permitir a recombinação mediada por Cre ser droga-inducible (single-neurônio etiquetando com nocaute inducible Cre-mediada, ou SLICK)9. Em outra estratégia chamada análise de mosaico com dobro de marcadores (MADM)10,11, mediada por Cre interchromosomal recombinação permite um mutante homozigoto ser criado ao lado de tecido heterozigoto. Essas abordagens, uma nova linha de mouses precisa ser produzido cada vez para cada gene candidato ou subtipo de celular que é testado. Alternativamente, Cre recombinase pode ser introduzido pós-natal a iontoforese12 ou por meio de vetores virais (por exemplo, vírus adeno-associado13 ou lentivírus14 carregando celular subtipo específico promotores). Essa estratégia cria forte e pós-natal de rotulagem. Para direcionar o desenvolvimento de neurônios corticais cerebrais escassamente e pré-natal, uma estratégia ideal é no utero electroporation da Cre recombinase com um marcador fluorescente.
Além de combinar recombinação Cre-lox através no utero electroporation para produzir mosaico tecido na vivo, nós introduzimos várias adaptações aos procedimentos de outros protocolos publicados15,16, 17,18,19,20,21. Nós fornecemos informações para melhorar o sucesso em grávidas cronometrado fêmeas reprodutoras. Também descrevem nossas duas estratégias para introduzir esparsas e brilhantes rotulagem dos neurônios no tecido cortical: uma estratégia é titula-se os níveis de um único construto codifica para Cre recombinase e um marcador fluorescente22. Outra estratégia é usar o sistema de "Supernova", projetado especificamente com esses parâmetros em mente23,24. Além disso, oferecemos melhorias na produção de pipetas de microinjeção consistente e simplificações para a cirurgia de eletroporação no útero . Finalmente, nós esboçamos passos críticos em uma preparação histológica simplificado que permite a análise de espinhas dendríticas e mandris dendríticas e axonal, sem coloração adicional ou imuno-histoquímica.

<table><tbody><tr><td>Camundongos C57BL / 6J</td><td>O Laboratório Jackson</td> <td># 000664</td><td>Veja "1. Configuração do mouse" (etapa 1.1, "camundongos selvagens")</td></tr><tr><td>GFP. Cre vetor vazio</td><td>AddGene</td><td>#20781</td><td>Veja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.1 "construção de DNA único que codifica a Cre recombinase, bem como um marcador fluorescente"). GFP. Cre vetor vazio foi um presente de Tyler Jacks.</td></tr><tr><td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69138</td><td>Veja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.1 Sistema "Supernova") e http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) foi um presente de Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69136</td><td>Veja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.1 Sistema "Supernova") e http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) foi um presente de Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#85006</td><td>Veja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.1 Sistema "Supernova") e http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) foi um presente de Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>Kit Maxi de Plasmídeo EndoFree (10)</td><td>Qiagen</td><td>#12362</td><td>Veja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.3 "kit de purificação de plasmídeo livre de endotoxinas")</td></tr><tr><td>Pó de azul de tripano, grau BioReagent</td><td>Sigma</td><td>T6146-5G</td><td>Consulte "2. Configuração de ADN" (passo 2.5 "azul de tripano")</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, ACS, 2,5 kg</td><td>VWR</td><td>BDH9286-2,5 kg</td><td>Ver "2. Configuração de ADN" (passo 2.5 "NaCl")</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio, ACS, 500 g</td><td>VWR</td><td>#97061-566</td><td>Ver "2. Configuração de DNA" (etapa 2.5 "KCl")</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-100G</td><td>Veja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.5 "Na2HPO4")</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100G</td><td>Consulte "2. Configuração de DNA" (etapa 2.5 "KH2PO4")</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico, reagente ACS, 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Ver "2. Configuração de DNA" (etapa 2.5 "HCl")</td></tr><tr><td>P-97 Extrator de micropipeta</td><td>Instrumento Sutter</td><td>P-97</td><td>Consulte "3. Configuração da pipeta" (passo 3.1 "extrator capilar de vidro")Filamento</td></tr> <tr><td>de calha de 3,0 mm de largura</td><td>Sutter Instrument</td><td>FT330B</td><td>Consulte "3. Configuração da pipeta" (passo 3.1 "extrator de capilares de vidro")</td></tr><tr><td>Capilares de vidro de parede fina, 4", 1 / 0.75 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>Consulte "3. Configuração da pipeta" (passo 3.1.1 "capilar de vidro")</td></tr><tr><td>Toalhetes Soft-Tech de camada única, 4.5"</td><td>Phenix</td><td>LW-8148</td><td>Consulte "3. Configuração da pipeta" (etapa 3.2.1 "limpeza de tarefa de camada única"); outros lenços umedecidos (por exemplo, Kimwipes) podem ser usados.</td></tr><tr><td>Pinça Graefe, 7 cm, Reta, 0.7 mm 1x2 Dentes</td><td>World Precision Instruments</td><td>#14140</td><td>Veja "4. Eletroporação no útero" (passo 4.1 "Pinça Graefe")</td></tr><tr><td>Tesoura de íris, 11,5 cm, reta, pacote de 12</td> World <td>Precision Instruments</td><td>#503708-12</td><td>Veja "4. Eletroporação no útero" (passo 4.1 "tesoura de íris")</td></tr><tr><td>Pinça Mosquito Hartman, 9 cm, Reta, pacote com 12</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503728-12</td><td>Veja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.1 "Pinça de mosquito Hartman")</td></tr><tr><td>Esponjas não tecidas de uso geral, 2" x 2", 4 camadas</td><td>Medrepexpress</td><td>#2204-c</td><td>Veja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.1 "esponjas de gaze não tecidas")</td></tr><tr><td>Pinça com ponta de anel, 10 cm, reta, 2,2 mm ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503203</td><td>Veja "4. Eletroporação in utero" (etapa 4.1 "pinça com ponta de anel")</td></tr><tr><td>Placas de Petri Pyrex completas, OD &vezes; H 100 mm &vezes; 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160102-12EA</td><td>Veja "4. Eletroporação no útero" (passo 4.1 "Placas de Petri")</td></tr><tr><td>Bandeja de instrumentos tipo plano, aço inoxidável, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"</td><td>Amazon</td><td>B007SHGAHA</td><td>Veja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.1 "bandeja de aço inoxidável")</td></tr><tr><td>Pinça de platina, 5 mm</td><td>BTX</td><td>#45-0489</td><td>Consulte "4. Eletroporação no útero" (passo 4.3 e 4.16 "eletrodos do tipo pinça")</td></tr><tr><td>ECM 830 Pedal</td><td>BTX</td><td>#45-0211</td><td>Consulte "4. Eletroporação in utero" (passo 4.3 e 4.17 "pedal")</td></tr><tr><td>ECM 830 Gerador</td><td>BTX</td><td>#45-0052</td><td>Consulte "4. Eletroporação in utero" (etapa 4.3 "gerador")</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia com isoflurano de animal único com caixa de indução pequena</td><td>Aparelho de Harvard</td><td>#72-6468</td><td>Veja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.4 e 4.6 "cone nasal", passo 4.4 "câmara de indução")</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co</td><td>#0536108691</td><td>Ver "4. Eletroporação in utero" (passo 4.7 "pomada oftálmica veterinária")</td></tr><tr><td>Space Gel (AIMS)</td><td>VWR</td><td>#95059-640</td><td>Ver "4. Eletroporação in utero" (passo 4.8 "bolsa selada cheia de solução salina supersaturada")</td></tr><tr><td>Gel Creme Removedor de Pêlos, Fórmula Sensível</td><td>Veet</td><td>#062200809951</td><td>Veja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.9 "creme depilatório")</td></tr><tr><td>10ul Low Retention Tip Starter (960 pontas/pk)</td><td>Phenix Research Products</td><td>TSP-10LKIT</td><td>Consulte "4. Eletroporação in utero" (passo 4.12 "estéril 10 &micro; L ponta de micropipeta")</td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td>Consulte "4. Eletroporação in utero" (passo 4.15 "montagem do tubo aspirador")</td></tr><tr><td>Sutura Absorvível Trançada, 4-0, Agulha NFS-2(FS-2), 27"</td><td>Medrepexpress</td><td>MV-J397</td><td>Ver "4. Eletroporação in utero" (etapa 4.19 "suturas absorvíveis")</td></tr><tr><td>" LiquiVet Rápido" Adesivo de tecido</td><td>Medrepexpress</td><td>VG3</td><td>Veja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.20 "adesivo tecidual")</td></tr><tr><td>Seringas hipodérmicas, polipropileno, ponta Luer lock, capacidade 1,0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>Ver "4. Eletroporação no útero" (passo 4.21 "seringa de 1 mL")</td></tr><tr><td>BD Precisionglide agulhas de seringa calibre 26, L 1/2 pol.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192392-100EA</td><td>Veja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.21 "26G, &frac12; &rdquo; agulha")</td></tr><tr><td>Nestlets Material de nidificação</td><td>Ancare</td><td>NES3600</td><td>Veja "4. Eletroporação in utero" (etapa 4.24 "materiais de nidificação")</td></tr><tr><td>Sementes de girassol, óleo preto,</td><td>bio-serv</td> estéril <td>S5137</td><td>Consulte "4. Eletroporação in utero" (passo 4.24 "sementes de girassol")</td></tr><tr><td>Paraformaldeído, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td>Ver "5. Histologia" (passo 5.1.1 "PFA")</td></tr><tr><td>Pinças Econômicas #3, 11 cm, pontas de 0,2 x 0,4 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>#501976</td><td>Consulte "5. Histologia" (passo 5.5 "pinças")</td></tr><tr><td>Ágar pó</td><td>Alfa Aesar</td><td>#10752</td><td>Ver "5. Histologia" (passo 5.8.1 "ágar")</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear de gume único, lâmina #9</td><td>Ferramentas Stanley</td><td>#11-515</td><td>Consulte "5. Histologia" (passo 5.9 "lâmina de barbear de um gume")</td></tr><tr><td>Disco de amostra S D 50 mm</td><td>Leica</td><td>#14046327404</td><td>Ver "5. Histologia" (passo 5.9 "disco de amostra de micrótomo vibratório")</td></tr><tr><td>Bandeja tampão S montagem</td><td>Leica</td><td>#1404630132</td><td>Consulte "5. Histologia" (passo 5.10 "bandeja tampão")</td></tr><tr><td>VT1000 S Vibratome</td><td>Leica</td><td>#14047235612</td><td>Consulte "5. Histologia" (passo 5.10 "micrótomo vibratório")</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear de lâmina dupla</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td>Veja "5. Histologia" (passo 5.10 "lâmina")</td></tr><tr><td>Porta-faca S</td><td>Leica</td><td>#14046230131</td><td>Consulte "5. Histologia" (passo 5.10 "porta-faca")</td></tr><tr><td>Conjunto de pincéis redondos de cabo curto dourado Studio Elements</td><td>Amazon</td><td>B0089KU6XE</td><td>Veja "5. Histologia" (passo 5.12.1 "pincel de ponta fina")</td></tr><tr>Serviços de <td>microscopia eletrônica</td> <td>Superfrost Plus Slides</td><td>#71869-11</td><td>Veja "5. Histologia" (passo 5.12.1 "lâmina de microscópio")</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml</td><td>Thermofisher</td><td>P36970</td><td>Veja "5. Histologia" (passo 5.12.3-5.12.4 "mountant")</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura, 24 x 50 mm, nº 1</td><td>Produtos de pesquisa Phenix</td><td>MS1415-10</td><td>Consulte "5. Histologia" (etapa 5.12.4 "lamínula")</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Dicloridrato de diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Ver "5. Histologia" (passo 5.13.1 "DAPI")</td></tr><tr><td>Microscópio vertical de platina fixa</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>Consulte "5. Histologia" (passo 5.15 "microscópio de luz")</td></tr><tr><td>Microscópio Confocal de Varredura a Laser</td><td>Nikon</td><td>TE2000/C2si</td><td>Consulte "5. Histologia" (passo 5.15 "microscópio confocal")</td></tr><tr><td>4x objetiva, NA = 0.20</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 4X</td><td>Consulte "5. Histologia" (passo 5.15 "objetiva de baixa potência")</td></tr><tr><td>Objetiva de 20x, NA = 0.75</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 20X</td><td>Consulte "5. Histologia" (passo 5.15 "objetiva de média potência")</td></tr><tr><td>Objetiva de 60x, NA = 1.40</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo VC 60X Óleo</td><td>Consulte "5. Histologia" (etapa 5.15 "objetiva de alta potência")</td></tr></tbody></table>

induzindo a recombinação de cre-lox no córtex cerebral de rato através da eletroporação no utero

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Autónoma-célula neuronais funções dos genes podem ser reveladas, causando perda ou ganham de função de um gene em uma população pequena e esparsa de neurônios. Para fazer isso requer gerando um mosaico em que neurônios com perda ou ganho de função de um gene são rodeados por tecido geneticamente imperturbável. Aqui, nós combinamos o sistema de recombinação de Cre-lox com eletroporação no utero para gerar tecido de cérebro de mosaico que pode ser usado para estudar a função celular autónomos de genes nos neurônios. DNA construções (disponível através de repositórios), que codifica para uma etiqueta fluorescente e Cre recombinase, são introduzidos em desenvolver os neurônios corticais que contém genes ladeados com loxP sites nos cérebros de embriões de rato usando utero em eletroporação. Além disso, descrevemos várias adaptações para o método de eletroporação no utero que aumentam a capacidade de sobrevivência e reprodução. Esse método também envolve o estabelecimento de um título para recombinação mediada por Cre em uma população esparsa ou densa de neurônios. Preparações histológicas do tecido cerebral rotulado não exigem (mas pode ser adaptadas para) imuno-histoquímica. As construções utilizadas garantem que fluorescente etiquetado neurônios carreg o gene recombinase Cre. Preparações histológicas permitem a análise morfológica dos neurônios através da imagem latente confocal de mandris dendríticas e axonal e espinhas dendríticas. Porque a perda ou ganho de função pode é feito de tecido mosaico esparsas, esse método permite que o estudo da célula autónomos necessidade e suficiência do gene produtos na vivo.

A única construção GFP. CRE (ver lista de materiais) foi electroporated no E15.5 e visualizado no P14. Dependendo da concentração da construção e do volume de injeção, um resultado esparso ou denso pode ser obtido22,26. Por exemplo, a injeção de 1 µ l de 2 mg/mL GFP. CRE resulta em uma distribuição esparsa de pilhas etiquetadas, alguns dos quais podem ser brilhante (figura 1A) e localizadas na camada ...

Funções celulares autónomos de genes no cérebro podem ser estudadas através da indução de perda ou ganham de função em esparsas populações de células. Aqui, descrevemos no utero electroporation para entregar recombinase Cre em populações esparsas de desenvolver os neurônios corticais com genes de floxed para causar a perda da função em vivo.

Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar um mosaico genético no córtex cerebral de camundongos, induzindo a recombinação Cre-Lox por meio de eletroporação in utero. Este método de geração de mosaicos genéticos pode ajudar a responder a questões-chave em neurobiologia. Como determinar se um gene é necessário para um determinado fenótipo neuronal de maneira autônoma da célula.A principal vantagem desta técnica é que o sistema de recombinação Cre-Lox eficaz é combinado com uma técnica de entrega de genes igualmente eficaz na eletroporação do útero. Embora esse método esteja focado em direcionar neurônios corticais da camada dois a três, ele pode ser usado para direcionar neurônios em outras profundidades das camadas corticais. Quando tentamos fazer mosaicos genéticos em nosso tecido cerebral, encontramos vários problemas para fazer com que nossos animais experimentais sobrevivessem após o nascimento, então introduzimos várias simplificações e refinamentos em nossa técnica.Prepare uma pipeta com um cone muito longo e ponta muito fina, típica de pipetas para injeção de células-tronco embrionárias ou transferência nuclear, inserindo primeiro o capilar de vidro no extrator de pipetas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

Um método de transferência de genes no cérebro do rato em desenvolvimento é descrito usando um único método cirúrgico ea forma especial de eletrodos. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmídeo temporal e espacialmente, o que ajudará muitos neurocientistas em estudar o desenvolvimento do cérebro.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

Este artigo descreve em pormenor um protocolo para electroporate no útero do córtex cerebral eo hipocampo em E14.5 em ratinhos. Mostramos também que este é um método valioso para estudar dendritos e espinhas nessas duas regiões cerebrais.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Neste vídeo, um filhote de camundongo geneticamente modificado carregando o gene Ccm2 ladeado por locais loxP e Cre recombinase fundidos a um receptor de estrogênio é usado para induzir malformações cavernosas cerebrais (CCMs). A administração de 4-hidroxitamoxifeno ativa o Cre nas células endoteliais, levando à deleção de Ccm2 e à formação de CCMs no cérebro.

Indução mediada por Cre-LoxP de malformações cavernosas cerebrais em um modelo de camundongo

Fonte: Denaxa, M., el al., Transplante de progenitores de interneurônios corticais quimiogeneticamente modificados em cérebros de camundongos pós-natais precoces. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para injetar um vetor de plasmídeo carregando o gene de interesse em progenitores interneurônios em uma fatia de cérebro embrionário, seguido de eletroporação para entrada de plasmídeo e expressão gênica. Esses progenitores modificados podem ser usados posteriormente para o...

Transferência de genes assistida por eletroporação incorporada em agarose em progenitores de interneurônios corticais de camundongos

A migração de neurônios é regulada por vários fatores autônomos e não celulares autônomos.  Este protocolo mostra como a eletroporação in utero pode ser usada para determinar se um fenótipo em um camundongo transgênico é devido à interrupção de um mecanismo intrínseco celular ou comprometimento da interação entre o neurônio e seu ambiente.

Indução da Eliminação Proteína Através In Utero Eletroporação para definir défices de Migração Neuronal em modelos transgênicos

Capitalizando uma estratégia genética binária, fornecemos um protocolo detalhado para rastreamento de circuitos neurais em camundongos que expressam traçadores transsinápticos complementares após a recombinação mediada por Cre. Como a produção de traçadores específicos da célula é codificada geneticamente, nossa abordagem experimental é adequada para estudar a formação e maturação de circuitos neurais durante o desenvolvimento do cérebro embrionário murino em uma única resolução celular.

Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato

Este protocolo descreve em detalhes como transfectar especificamente diferentes regiões do sistema nervoso central C57BL/6 por meio de eletroporação in utero. Incluídas neste protocolo estão instruções detalhadas para transfecções de regiões que se desenvolvem no córtex, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo septal lateral e estriado.

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Os astrócitos ladrilho o córtex cerebral uniformemente, tornando a análise de sua morfologia complexa desafiadora a nível celular. O protocolo aqui fornecido usa rotulagem multicolorida baseada na eletroporação uterónica para destacar os astrócitos corticais e analisar seu volume e morfologia com um pipeline de análise de imagem fácil de usar.

Em Utero Eletroporation de Marcadores de Cor Multiaddressable (MAGIC) para Individualizar Astrócitos de Ratos Cortical

Aprenda a induzir recombinação Cre-Lox no córtex cerebral de camundongos por eletroporação in utero. Este método permite estudar funções celulares autônomas de genes em neurônios corticais.

Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

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