Teste de tolerância à glicose intraperitoneal, medição da função pulmonar e a fixação do pulmão para estudar o impacto da obesidade e metabolismo prejudicado em resultados pulmonares
March 15th, 2018
A incidência da obesidade está aumentando e aumenta o risco de doenças pulmonares crônicas. Estabelecer os mecanismos subjacentes e estratégias preventivas, animal bem definido modelos são necessários. Aqui, nós fornecemos três métodos (teste de tolerância à glicose, pletismografia de corpo e fixação do pulmão) para estudar o efeito da obesidade sobre os resultados pulmonares em camundongos.
O objetivo geral dos três métodos a seguir é estudar o impacto da obesidade e distúrbios metabólicos na estrutura e função pulmonar. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa respiratória sobre o impacto dos distúrbios metabólicos na estrutura e função pulmonar. A vantagem dessas técnicas é que elas podem ser combinadas para avaliar o papel funcional do metabolismo na patogênese de doenças pulmonares crônicas e testar diferentes abordagens terapêuticas.
As implicações dessas técnicas vão além da fenotipagem para o que está elucidando o papel funcional específico dos alvos metabólicos na patogênese das doenças pulmonares. Esses métodos também podem ser aplicados ao estudo da estrutura e função em animais saudáveis com modificações genéticas, mas também em modelos animais de DPOC e asma. Geralmente, os indivíduos novos nesses métodos terão dificuldades, pois a inserção do tubo traqueal, a insuflação do pulmão e a administração da anestesia profunda, todos eles requerem experiência e treinamento.
Tivemos a ideia desses métodos pela primeira vez quando descobrimos que a obesidade de início precoce em camundongos, mas também em humanos, estava intimamente ligada ao metabolismo de impacto e a doenças pulmonares crônicas além da infância. Para medir a tolerância à glicose intraperitoneal, prenda suavemente um camundongo adulto em jejum de 12 horas pela cauda e use uma tesoura estéril para incisar a ponta da cauda. Aplique imediatamente uma gota de sangue de fluxo livre na tira de teste do medidor de glicose no sangue para medir o nível de glicose no sangue em jejum.
O resultado do teste aparecerá na tela do glicosímetro após quatro segundos. Depois de medir a glicose para cada animal, rotule-os individualmente com marcadores coloridos e pese os animais. Em seguida, use uma agulha de calibre 27 presa a uma seringa de um mililitro para administrar 100 microlitros de glicose por tonelada de peso corporal a cada animal por meio de injeção intraperitoneal e meça os níveis de glicose no sangue 15, 30, 60 e 120 minutos depois com novas tiras de teste, conforme demonstrado.
Para avaliar a função pulmonar, coloque um camundongo adulto em decúbito dorsal em uma almofada e aplique pomada nos olhos do animal. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, molhe o pelo na região da tireoide com etanol a 70% e use uma pinça para levantar a pele na linha média entre a incisura jugular no esterno e a sínfise do tubérculo do mento. Usando uma tesoura romba, faça cuidadosamente uma incisão cutânea de um centímetro na pele em tenda para visualizar o tecido adiposo subcutâneo subjacente e a glândula tireoide e expor a traqueia com uma separação cuidadosa de ambos os lobos tireoidianos no istmo e dissecção dos músculos esternotireóideo e esternotireóideo.
Usando uma pinça afiada, passe uma sutura cirúrgica trançada 4-0 entre a traqueia e o esôfago e faça uma incisão cuidadosa na traqueia, feche a laringe entre as cartilagens traqueais com uma microtesoura. Intubar com um tubo traqueal prendendo o tubo com uma sutura cirúrgica e mover o animal para o leito aquecido de uma câmara corporal. Conecte o tubo traqueal à placa frontal e ligue o ventilador.
Confirme o movimento do tórax simultaneamente com a frequência de ventilação para confirmar o posicionamento adequado do tubo traqueal e observe o sinal de pressão na tela do computador. Para controlar as mudanças na pressão transpulmonar durante a ventilação, insira um tubo esofágico no nível dos pulmões observando a tela para facilitar a colocação do tubo onde a deflexão máxima da pressão e os artefatos cardíacos mínimos possam ser observados. Inicie a aquisição de dados de acordo com as instruções do fabricante e aplique 10 microlitros de PBS no nebulizador.
Inicie a nebulização após cinco minutos de aclamação, seguida por uma fase de resposta de três minutos, durante a qual a resistência das vias aéreas e a complacência do sistema respiratório são medidas. Deixe o animal se recuperar por três minutos antes de iniciar a próxima nebulização e siga as instruções do software para aplicação gradual de concentrações crescentes de 10 microlitros de metacolina no ventilador. Para análise histomorfométrica quantitativa do tecido pulmonar, use uma tesoura romba para fazer uma pequena incisão no diafragma de um camundongo adulto e use uma tesoura curva romba para fazer uma incisão periesternal ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para abrir suavemente o tórax.
Levante a caixa torácica para expor a cavidade pleural e remova o timo. Após a remoção do coração, use uma pinça afiada para preparar e expor a traqueia, a fim de passar uma sutura cirúrgica trançada 4-0 entre a traqueia e o esôfago, seguida de uma incisão cuidadosa da traqueia próxima à laringe entre as cartilagens traqueais. Intubar com uma cânula intravenosa de calibre 26 e usar um agente fixador para inflar os pulmões por fixação de pressão a uma pressão constante de 20 centímetros de água.
Após 30 minutos à temperatura ambiente, ligue a traqueia e remova a cânula ao mesmo tempo. Em seguida, excise cuidadosamente os pulmões sem danificar o tecido e armazene os pulmões em agente fixador fresco a quatro graus Celsius durante a noite. Camundongos obesos demonstram um aumento nos níveis séricos de glicose 15 e 30 minutos após a injeção intraperitoneal de glicose, indicando uma captação celular prejudicada de glicose em comparação com camundongos alimentados com dieta padrão.
A análise invasiva da função pulmonar mostra um aumento de até 1,5 vezes na resistência das vias aéreas em camundongos obesos alimentados com dieta rica em gordura após estimulação com metacolina em comparação com animais de controle. A coloração de hematoxilina e eosina de cortes de parênquima pulmonar após instalação intratraqueal revela múltiplas áreas não infladas, septos alveolares espessos e alvéolos de formato poligonal nos pulmões instilados com pouca pressão. Em contraste, muita pressão de instilação leva a áreas superinfladas com septos alveolares destruídos.
A aplicação da quantidade adequada de pressão durante a fixação pulmonar, no entanto, leva a um pulmão completamente inflado com alvéolos redondos. Uma vez dominados, os testes de tolerância à glicose intraperitoneal podem ser concluídos em duas horas e meia. Os testes de função pulmonar podem ser concluídos em uma hora e a insuflação pulmonar pode ser concluída em menos de uma hora.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que adaptar os camundongos, treinar o investigador e trabalhar em um ambiente silencioso e com estresse reduzido são recomendados para a aquisição ideal de dados. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de metabolismo e doenças respiratórias explorarem os mecanismos envolvidos e o potencial das estratégias de tratamento de doenças pulmonares crônicas usando modelos de pequenos animais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como investigar o impacto da obesidade e distúrbios metabólicos na estrutura e função pulmonar.
Não se esqueça de que trabalhar com animais ou instrumentos cirúrgicos pode causar lesões ou reações cutâneas e que precauções como usar o equipamento de proteção individual adequado devem sempre ser tomadas durante a realização desses procedimentos.
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Visão Geral
Este artigo discute métodos para estudar o impacto da obesidade na estrutura e função pulmonar usando modelos animais. Destaca a importância dessas técnicas na compreensão de doenças pulmonares crônicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa Respiratória
- Distúrbios Metabólicos
Contexto
- A obesidade está ligada a doenças pulmonares crônicas.
- Compreender os mecanismos requer modelos animais bem definidos.
- A pesquisa visa explorar o papel funcional do metabolismo na patogênese pulmonar.
- As técnicas podem ser aplicadas tanto em modelos saudáveis quanto em modelos com doenças.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o impacto da obesidade nos resultados pulmonares.
- Estabelecer estratégias preventivas para doenças pulmonares crônicas.
- Elucidar o papel funcional dos alvos metabólicos.
Métodos Utilizados
- Teste de tolerância à glicose
- Pletismografia corporal
- Fixação pulmonar
- Combinação de técnicas para avaliação abrangente
Principais Resultados
- Os métodos fornecem insights sobre a estrutura e função pulmonar.
- As técnicas podem ajudar a testar abordagens terapêuticas.
- Os resultados se estendem à compreensão da DPOC e asma.
- Experiência é necessária para a execução adequada da técnica.
Conclusões
- Esses métodos são cruciais para estudar os efeitos da obesidade na saúde pulmonar.
- Facilitam a exploração de distúrbios metabólicos em doenças respiratórias.
- O treinamento é essencial para a aplicação eficaz dessas técnicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Obesity-related metabolic dysfunction represents a growing risk factor for chronic lung diseases, creating a need for preclinical models that can mechanistically link systemic metabolism to pulmonary outcomes. The integrated assessment of glucose tolerance, lung function, and histological structure enables de-risking of therapeutic hypotheses by providing quantitative, reproducible readouts across metabolic and respiratory domains. This approach supports target validation and predictive confidence in early discovery by elucidating whether metabolic interventions modify lung pathology in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the functional role of metabolic targets in lung pathogenesis by measuring glucose intolerance as a biomarker of impaired cellular uptake.
- Operational Value: Enables pathway clarification through standardized ipGTT procedures that detect diet-induced metabolic dysregulation in obese models.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking metabolic impairment to functional lung outcomes via concurrent airway resistance and compliance measurements.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by fixing lungs at standardized pressure to ensure reproducible alveolar morphology for histomorphometric analysis.
- Operational Value: Addresses assay standardization through stepwise methacholine challenge protocols that quantify dose-dependent bronchoconstriction in obese versus control animals.
- Scalability: Highlights platform reuse across COPD and asthma models, enabling consistent lung structure-function assessment in genetically modified or diseased cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by connecting systemic inflammatory and metabolic dysregulation to lung structural changes such as thickened septa and polygonal alveoli.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by demonstrating how lung fixation at 20 cm H2O pressure yields round-shaped alveoli, enabling reliable quantitative endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by showing that appropriate insufflation pressure prevents overinflation or collapse, reducing artifact-driven variability in histological assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting iterative evaluation of metabolic interventions on lung structure and function in preclinical models.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by measuring serum glucose levels at 15 and 30 minutes post-injection to evaluate cellular glucose uptake in obesity models.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible airway resistance and compliance measurements following nebulization and methacholine challenge, enabling compound effect comparison.
- Analytics: Highlights quantitative dependent variable measurements such as increased airway resistance (up to 1.5-fold) and altered alveolar morphology that help teams compare metabolic and pulmonary phenotypes.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating lung preparation and fixation protocols that preserve tissue integrity for histological analysis across study groups.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable to both healthy animals with genetic modifications and disease models of COPD and asthma.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in obesity-lung disease linkages.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of metabolic and functional pulmonary assessments.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early metabolic phenotype stratification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on concordant glucose tolerance, lung function, and histological outcomes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in surgical procedures including tracheal intubation, lung insufflation, and glucose administration.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs such as glucometers, ventilators, pressure monitoring systems, and nebulizers for methacholine delivery.
- Cross-team standardization requirements for consistent animal fasting, injection dosing, and timing of metabolic and functional readouts.
- Adaptation considerations across model systems including healthy, genetically modified, and disease-induced obese mice.
- Practical limitations supported by source material: investigator training and stress-reduced environments are recommended for optimal data acquisition due to technical complexity of surgical steps.
