Teste de tolerância à glicose intraperitoneal, medição da função pulmonar e a fixação do pulmão para estudar o impacto da obesidade e metabolismo prejudicado em resultados pulmonares
15 de março de 2018
A incidência da obesidade está aumentando e aumenta o risco de doenças pulmonares crônicas. Estabelecer os mecanismos subjacentes e estratégias preventivas, animal bem definido modelos são necessários. Aqui, nós fornecemos três métodos (teste de tolerância à glicose, pletismografia de corpo e fixação do pulmão) para estudar o efeito da obesidade sobre os resultados pulmonares em camundongos.
O objetivo geral dos três métodos a seguir é estudar o impacto da obesidade e distúrbios metabólicos na estrutura e função pulmonar. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa respiratória sobre o impacto dos distúrbios metabólicos na estrutura e função pulmonar. A vantagem dessas técnicas é que elas podem ser combinadas para avaliar o papel funcional do metabolismo na patogênese de doenças pulmonares crônicas e testar diferentes abordagens terapêuticas.
As implicações dessas técnicas vão além da fenotipagem para o que está elucidando o papel funcional específico dos alvos metabólicos na patogênese das doenças pulmonares. Esses métodos também podem ser aplicados ao estudo da estrutura e função em animais saudáveis com modificações genéticas, mas também em modelos animais de DPOC e asma. Geralmente, os indivíduos novos nesses métodos terão dificuldades, pois a inserção do tubo traqueal, a insuflação do pulmão e a administração da anestesia profunda, todos eles requerem experiência e treinamento.
Tivemos a ideia desses métodos pela primeira vez quando descobrimos que a obesidade de início precoce em camundongos, mas também em humanos, estava intimamente ligada ao metabolismo de impacto e a doenças pulmonares crônicas além da infância. Para medir a tolerância à glicose intraperitoneal, prenda suavemente um camundongo adulto em jejum de 12 horas pela cauda e use uma tesoura estéril para incisar a ponta da cauda. Aplique imediatamente uma gota de sangue de fluxo livre na tira de teste do medidor de glicose no sangue para medir o nível de glicose no sangue em jejum.
O resultado do teste aparecerá na tela do glicosímetro após quatro segundos. Depois de medir a glicose para cada animal, rotule-os individualmente com marcadores coloridos e pese os animais. Em seguida, use uma agulha de calibre 27 presa a uma seringa de um mililitro para administrar 100 microlitros de glicose por tonelada de peso corporal a cada animal por meio de injeção intraperitoneal e meça os níveis de glicose no sangue 15, 30, 60 e 120 minutos depois com novas tiras de teste, conforme demonstrado.
Para avaliar a função pulmonar, coloque um camundongo adulto em decúbito dorsal em uma almofada e aplique pomada nos olhos do animal. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, molhe o pelo na região da tireoide com etanol a 70% e use uma pinça para levantar a pele na linha média entre a incisura jugular no esterno e a sínfise do tubérculo do mento. Usando uma tesoura romba, faça cuidadosamente uma incisão cutânea de um centímetro na pele em tenda para visualizar o tecido adiposo subcutâneo subjacente e a glândula tireoide e expor a traqueia com uma separação cuidadosa de ambos os lobos tireoidianos no istmo e dissecção dos músculos esternotireóideo e esternotireóideo.
Usando uma pinça afiada, passe uma sutura cirúrgica trançada 4-0 entre a traqueia e o esôfago e faça uma incisão cuidadosa na traqueia, feche a laringe entre as cartilagens traqueais com uma microtesoura. Intubar com um tubo traqueal prendendo o tubo com uma sutura cirúrgica e mover o animal para o leito aquecido de uma câmara corporal. Conecte o tubo traqueal à placa frontal e ligue o ventilador.
Confirme o movimento do tórax simultaneamente com a frequência de ventilação para confirmar o posicionamento adequado do tubo traqueal e observe o sinal de pressão na tela do computador. Para controlar as mudanças na pressão transpulmonar durante a ventilação, insira um tubo esofágico no nível dos pulmões observando a tela para facilitar a colocação do tubo onde a deflexão máxima da pressão e os artefatos cardíacos mínimos possam ser observados. Inicie a aquisição de dados de acordo com as instruções do fabricante e aplique 10 microlitros de PBS no nebulizador.
Inicie a nebulização após cinco minutos de aclamação, seguida por uma fase de resposta de três minutos, durante a qual a resistência das vias aéreas e a complacência do sistema respiratório são medidas. Deixe o animal se recuperar por três minutos antes de iniciar a próxima nebulização e siga as instruções do software para aplicação gradual de concentrações crescentes de 10 microlitros de metacolina no ventilador. Para análise histomorfométrica quantitativa do tecido pulmonar, use uma tesoura romba para fazer uma pequena incisão no diafragma de um camundongo adulto e use uma tesoura curva romba para fazer uma incisão periesternal ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para abrir suavemente o tórax.
Levante a caixa torácica para expor a cavidade pleural e remova o timo. Após a remoção do coração, use uma pinça afiada para preparar e expor a traqueia, a fim de passar uma sutura cirúrgica trançada 4-0 entre a traqueia e o esôfago, seguida de uma incisão cuidadosa da traqueia próxima à laringe entre as cartilagens traqueais. Intubar com uma cânula intravenosa de calibre 26 e usar um agente fixador para inflar os pulmões por fixação de pressão a uma pressão constante de 20 centímetros de água.
Após 30 minutos à temperatura ambiente, ligue a traqueia e remova a cânula ao mesmo tempo. Em seguida, excise cuidadosamente os pulmões sem danificar o tecido e armazene os pulmões em agente fixador fresco a quatro graus Celsius durante a noite. Camundongos obesos demonstram um aumento nos níveis séricos de glicose 15 e 30 minutos após a injeção intraperitoneal de glicose, indicando uma captação celular prejudicada de glicose em comparação com camundongos alimentados com dieta padrão.
A análise invasiva da função pulmonar mostra um aumento de até 1,5 vezes na resistência das vias aéreas em camundongos obesos alimentados com dieta rica em gordura após estimulação com metacolina em comparação com animais de controle. A coloração de hematoxilina e eosina de cortes de parênquima pulmonar após instalação intratraqueal revela múltiplas áreas não infladas, septos alveolares espessos e alvéolos de formato poligonal nos pulmões instilados com pouca pressão. Em contraste, muita pressão de instilação leva a áreas superinfladas com septos alveolares destruídos.
A aplicação da quantidade adequada de pressão durante a fixação pulmonar, no entanto, leva a um pulmão completamente inflado com alvéolos redondos. Uma vez dominados, os testes de tolerância à glicose intraperitoneal podem ser concluídos em duas horas e meia. Os testes de função pulmonar podem ser concluídos em uma hora e a insuflação pulmonar pode ser concluída em menos de uma hora.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que adaptar os camundongos, treinar o investigador e trabalhar em um ambiente silencioso e com estresse reduzido são recomendados para a aquisição ideal de dados. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de metabolismo e doenças respiratórias explorarem os mecanismos envolvidos e o potencial das estratégias de tratamento de doenças pulmonares crônicas usando modelos de pequenos animais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como investigar o impacto da obesidade e distúrbios metabólicos na estrutura e função pulmonar.
Não se esqueça de que trabalhar com animais ou instrumentos cirúrgicos pode causar lesões ou reações cutâneas e que precauções como usar o equipamento de proteção individual adequado devem sempre ser tomadas durante a realização desses procedimentos.
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Visão Geral
Este artigo discute métodos para estudar o impacto da obesidade na estrutura e função pulmonar utilizando modelos animais. Destaca a importância dessas técnicas para a compreensão de doenças pulmonares crônicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa Respiratória
- Distúrbios Metabólicos
Contexto
- A obesidade está associada a doenças pulmonares crônicas.
- O entendimento dos mecanismos exige modelos animais bem definidos.
- A pesquisa tem como objetivo explorar o papel funcional do metabolismo na patogênese pulmonar.
- As técnicas podem ser aplicadas a modelos saudáveis e doentes.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o impacto da obesidade nos resultados pulmonares.
- Estabelecer estratégias preventivas para doenças pulmonares crônicas.
- Elucidar o papel funcional de alvos metabólicos.
Métodos Utilizados
- Teste de tolerância à glicose
- Pletismografia corporal
- Fixação pulmonar
- Combinação de técnicas para avaliação abrangente
Resultados Principais
- Os métodos fornecem informações sobre a estrutura e função pulmonar.
- As técnicas podem auxiliar no teste de abordagens terapêuticas.
- Os resultados contribuem para a compreensão da DPOC e da asma.
- É necessária experiência para a execução adequada da técnica.
Conclusões
- Esses métodos são cruciais para estudar os efeitos da obesidade na saúde pulmonar.
- Eles facilitam a exploração de distúrbios metabólicos em doenças respiratórias.
- O treinamento é essencial para a aplicação eficaz dessas técnicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A disfunção metabólica relacionada à obesidade representa um fator de risco crescente para doenças pulmonares crônicas, criando a necessidade de modelos pré-clínicos capazes de vincular mecanicamente o metabolismo sistêmico aos desfechos pulmonares. A avaliação integrada da tolerância à glicose, da função pulmonar e da estrutura histológica permite reduzir riscos em hipóteses terapêuticas ao fornecer leituras quantitativas e reprodutíveis nos domínios metabólico e respiratório. Essa abordagem apoia a validação de alvos e a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, esclarecendo se intervenções metabólicas modificam a patologia pulmonar em sistemas relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar o papel funcional de alvos metabólicos na patogênese pulmonar mediante a medição da intolerância à glicose como biomarcador de captação celular prejudicada.
- Valor Operacional: Permite a elucidação de vias metabólicas por meio de procedimentos padronizados de TGIO que detectam disfunção metabólica induzida pela dieta em modelos obesos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao associar prejuízo metabólico a desfechos funcionais pulmonares por meio de medidas simultâneas de resistência das vias aéreas e complacência.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, fixando pulmões em pressão padronizada para garantir morfologia alveolar reprodutível para análise histomorfométrica.
- Valor Operacional: Aborda a padronização de ensaios por meio de protocolos escalonados de desafio com metacolina que quantificam broncoconstrição dependente da dose em animais obesos versus controles.
- Escalabilidade: Destaca a reutilização da plataforma em modelos de DPOC e asma, permitindo avaliação consistente da estrutura e função pulmonar em coortes geneticamente modificados ou doentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância da doença ao relacionar a desregulação inflamatória e metabólica sistêmica com alterações estruturais pulmonares, como septos espessados e alvéolos poligonais.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade do processo, desde a descoberta até a validação pré-clínica, demonstrando como a fixação pulmonar à pressão de 20 cm H2O produz alvéolos com formato arredondado, permitindo pontos finais quantitativos confiáveis.
- Avanço Ajustado ao Risco: Aborda a redução de riscos mecanicistas ao mostrar que a pressão adequada de insuflação evita superdistensão ou colapso, reduzindo a variabilidade nas avaliações histológicas causada por artefatos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta que vai do teste de hipóteses à identificação de compostos líderes, apoiando a avaliação iterativa de intervenções metabólicas na estrutura e função pulmonar em modelos pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia o teste de hipóteses mediante a medição dos níveis séricos de glicose aos 15 e 30 minutos após a injeção, para avaliar a captação celular de glicose em modelos de obesidade.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio por meio de medições reprodutíveis de resistência das vias aéreas e complacência após nebulização e desafio com metacolina, permitindo a comparação dos efeitos de compostos.
- Análises: Destaca medições quantitativas de variáveis dependentes, como o aumento da resistência das vias aéreas (até 1,5 vez) e alterações na morfologia alveolar, que ajudam as equipes a comparar fenótipos metabólicos e pulmonares.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica, demonstrando protocolos de preparo e fixação pulmonar que preservam a integridade tecidual para análise histológica entre grupos de estudo.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único, aplicável tanto a animais saudáveis com modificações genéticas quanto a modelos de doenças como DPOC e asma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista nas associações entre obesidade e doenças pulmonares.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade das avaliações metabólicas e funcionais pulmonares.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em fases avançadas por meio da estratificação precoce do fenótipo metabólico.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em resultados concordantes de tolerância à glicose, função pulmonar e achados histológicos.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em procedimentos cirúrgicos, incluindo intubação traqueal, insuflação pulmonar e administração de glicose.
- Necessidades de infraestrutura de instrumentação e análise, como glicosímetros, ventiladores, sistemas de monitoramento de pressão e nebulizadores para administração de metacolina.
- Requisitos de padronização entre equipes para jejum animal consistente, dosagem de injeções e cronometragem de leituras metabólicas e funcionais.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, incluindo camundongos saudáveis, geneticamente modificados e obesos induzidos por doença.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem: recomenda-se treinamento do pesquisador e ambientes com redução de estresse para aquisição ideal de dados devido à complexidade técnica das etapas cirúrgicas.
