Name: Construindo uma plataforma High-throughput Screening para avaliar a heterogeneidade da amplificação do Gene HER2 no câncer de mama (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Aprenda a quantificar a heterogeneidade da amplificação do gene HER2 em câncer de mama usando hibridização in situ por prata em alta vazão. Este método permite analisar amostras arquivadas de forma eficiente.

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Este estudo foi aprovado pelas placas de revisão institucional da IRCCS Ca' Granda Foundation, Hospital Policlínico, Milão, Itália.
1. seleção de pacientes e espécimes de tecido
<ol><li>Recuperar os slides arquivamento de todos os casos a serem analisados, incluindo todos os disponível hematoxilina e eosina (H & E) e slides de IHC do diagnóstico original e, se estiver presente, um H & E de correspondem tecido mamário não-neoplásicos (por exemplo, margem cirúrgica) .</li>
	<li>
Execute avaliações de caso. Nota: Para esta tarefa, pelo menos dois patologistas com experiência em patologia mamária devem discutir os diagnósticos slides e resolver as divergências colegiadamente. Use um microscópio convencional ou ferramentas de telepathology (este último em estudos multicêntrico a favor). Se for o caso, exclua todos os casos discordantes.<ol>
<li>Realize a reclassificação histológica de todos os casos de acordo com a edição mais recente da classificação da Organização Mundial de saúde (OMS) de tumores de mama18.</li>
		<li>Certifique-se de que o tecido normal para cada caso, se estiver presente nas amostras clínicas de arquivamento, é composto pelo menos uma unidade ductal lobular terminal não-neoplásicos.</li>
		<li>Identificar todas as áreas tumorais que mostram heterogêneas citológicos, arquitectónico, ou características IHC, usando um microscópio de campo claro (a ser realizada em conjunto por uma patologista e o technician(s) quem vai construir os TMAs).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Destaca as áreas topográficas discretas com um marcador sobre a lâmina de vidro ou com a ferramenta apropriada em um software de digital slide (figura 1A).</li>
	<li>Com base nos slides selecionados, recupere os blocos FFPE correspondentes a partir dos arquivos. Nota: Para otimizar a TMA construção, para evitar a depleção de tecido e para preservar o TMA socar integridade estrutural, casos com < 1 mm de espessura tecido residual deve ser excluído.</li>
</ol>2. projetar e construir TMAs baseadas na técnica Kononen
<ol><li>
Criar e abrir um novo arquivo de planilha, incorporando os registros das áreas distintas de cada caso. Incluir os seguintes dados em colunas separadas, como exemplificado na tabela 1: caso ID, ID de bloco, área ID, tipo de tecido (por exemplo, tecido normal, histotype componente invasivo, em situ histotype de componente), topografia (e.g., núcleo do tumor, parte dianteira invasiva), morfologia (por exemplo, grau nuclear, arquitetura, mitoses, características citológicas), status de biomarcadores (ou seja, receptor de estrógeno (ER), receptores de progesterona (PR), Ki67 e HER2) e todas as outras características IHC disponíveis.<ol>
<li>Salve o documento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crie um projeto TMA.
	<ol>
<li>Instalar e abrir o software de design de TMA.</li>
		<li>Definir o destinatário TMA bloco (s): acesso através do menu Arquivo > Novo > bloco ou usando CTRL + B.</li>
		<li>Clique no primeiro campo para preencher ou pressione a tecla Tab e digite em dimensões do bloco de parafina: 35 (mm), altura 20 (mm) de largura. Tipo "2" como o valor da "margem" (ou seja, distância da borda de parafina em mm) (figura 1B). Salve os dados clicando no botão apropriado. O novo modelo de destinatário bloco agora é salvo e pronto para ser usado em modelos de matriz de tecido novo.</li>
		<li>Criar um projeto de matriz de tecido: acesso ao menu Arquivo > Novo > matriz de tecido ou usando CTRL + T.</li>
		<li>Preencher em nome da matriz de tecido, comentários e autor e, em seguida, clique em "next". Clique no ícone de "importação", escolher o arquivo de modelo de bloco destinatário criado anteriormente e clique em "next".</li>
		<li>Escolha 1 mm como o tamanho de ponto, clicando o botão redondo. Escolha a 500 µm como espaçamento local, que é o espaço entre dois centros de manchas vizinhas. Clique no ícone da calculadora para calcular o número total de spots criados, que deve ser 231. Clique em "next".</li>
		<li>Defina o modo de numeração ponto clicando uma vez nele. Clique no botão "definir" para criar grades e redes de sub. Apagar a linha central (linha 6) e as colunas 8 e 15. Manter 3 pontos da linha 1 para orientação. O mapa final deverá abranger um número total de 183 pontos, conforme representado na Figura 2.</li>
		<li>Definir a lista de tipos de tecido: acesso através do menu Arquivo > Novo > lista de tipos de tecido ou usando CTRL + L.</li>
		<li>Inserir as descrições de tecido previamente definidas. Pressione a seta para baixo ou clique sobre o botão + para adicionar uma linha.</li>
		<li>Definir o projeto: acesso através do menu Arquivo > Novo > projeto de Booster ou usando CTRL + P.</li>
		<li>Preencher em nome da matriz de tecido, comentários e autor e, em seguida, clique em "next". Importe o arquivo de folha de cálculo, lista de tipos de tecido e o modelo de matriz de tecido previamente criado clicando os ícones adequados.</li>
		<li>Clique em "selecionar tudo" e definir o número de pontos para cada tipo de tecido; Clique no botão de "partida" para aplicar as configurações. Aparecerá uma tabela que lista o número total de núcleos que serão amostrados e transferido para o destinatários blocos neste projeto. Salve o projeto e fechar o programa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare os aceitador de blocos (figura 1B).
	<ol>
<li>Preencher os moldes de metal limpos com elasticized parafina a 65 ° C.</li>
		<li>Deixe os blocos de parafina arrefecer à temperatura ambiente durante a noite dentro dos moldes de metal.</li>
		<li>Extrai os blocos de parafina dos moldes de metal. Se ocorrerem rachaduras, descartar o bloco e repita etapas 2.3.1-2.3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Construa o TMA usando um arrayer automático ou semi-automático de19.
	<ol>
<li>Recupere blocos FFPE todos selecionados e as seções correspondentes a H & E com anotações.</li>
		<li>Ativar o arrayer e inserir o bloco (s) aceitador no carrossel arrayer.</li>
		<li>Abra o software de estação de controle de arrayer, clique em "Nova matriz de tecido" e carregar o projeto criado anteriormente (Figura 1).</li>
		<li>Clique em "Continuar" e selecione a posição dos blocos doador do menu.</li>
		<li>Definir a posição inicial para cada bloco de destinatário: use as teclas de seta para mover a luz do laser e alinhá-lo com a borda superior esquerda na parafina do bloco de destinatário.</li>
		<li>Clique em "next" e repita para o alinhamento vertical.</li>
		<li>Clique em "Avançar" para automaticamente criar um buraco no quadrante definido anteriormente do bloqueio de destinatários (aceitador).</li>
		<li>Esvazie o soco.</li>
		<li>Posicione o bloco de doador para amostragem e remover um núcleo de tecido da área anteriormente anotada de interesse.</li>
		<li>Inserir o núcleo do tecido doador no orifício de bloqueio de destinatários (aceitador).</li>
		<li>Remova o bloco de doador do arrayer.</li>
		<li>Repita etapas 2.4.5-2.4.11 até o TMA é concluído.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o lado do tecido do bloco recém-gerado TMA em um slide em branco estéril e colocá-los no forno laboratório a 45 ° C por 5 min.</li>
	<li>Pressione suavemente o bloco do slide para 5 s para achatar os núcleos de tecido. Repita uma vez (para um total de 2 vezes).</li>
	<li>Retire o bloco TMA juntamente com o slide do forno, lançá-los e delicadamente Retire o bloco a partir do slide.</li>
	<li>Cubra a superfície do tecido TMA com uma fina camada de parafina elasticized a 65 ° C.</li>
	<li>Deixe o bloco TMA em temperatura ambiente por 2 h.</li>
	<li>Transferência do bloco TMA a 4 ° C por 24 h. Nota: O bloco do TMA pode ser armazenado a 4 ° C até a exaustão.</li>
</ol>3. histochemical e análises imuno-histoquímica
<ol><li>
TMA seções de corte.
	<ol>
<li>Coloque o bloco (s) aceitador TMA com parafina-lado para baixo sobre uma superfície de-10 ° C por 10 min acalmar a parafina.</li>
		<li>Encher uma banheira de flutuação com água ultrapura e definir o calor de 38 ° C.</li>
		<li>Coloque uma lâmina nova em um micrótomo rotativo e insira o bloco no mandril micrótomo para que o bloco de cera enfrenta a lâmina e é alinhado no plano vertical.</li>
		<li>Aproximar o bloco cuidadosamente com a lâmina e cortar algumas secções finas para garantir que o posicionamento está correto; ajuste se necessário.</li>
		<li>3 µm de espessura seções de corte.</li>
		<li>Pegar as seções usando uma pinça e eles flutuam na superfície da água de banho.</li>
		<li>Escolha as seções fora o banho de água em lâminas de vidro regular e IHC/ISH.</li>
		<li>Coloque os slides em uma cremalheira e armazená-los no forno a 45 ° C durante a noite. Nota: Uma vez preparados, as seções TMA devem ser manchadas dentro de 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Executar a coloração histoquímicos (H & E) usando um autostainer.
	<ol>
<li>Insira os slides no rack autostainer e colocá-los a 60 ° C por 10 min.</li>
		<li>Abra a gaveta de carga do autostainer e insira que o cesto com o TMA desliza em uma das estações de carga com um clipe de H & E padrão voltado para fora.</li>
		<li>Uma vez que a gaveta está fechada, o clipe será automaticamente reconhecido pelo sistema e começará o seguinte protocolo: Estação de forno em 37 ° C (6 min), xileno (2 min), xileno (2 min), 100% de etanol (2 min), 100% de etanol (2 min), etanol 95% (2 min), etanol 95% (2 min) , destilada água (4 min), hematoxilina de Carazzi (9 min), água corrente de baixa pressão (2 min), eosina 1% (1 min), água corrente de baixa pressão (2 min), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), 100% de etanol (15 s), 100% de etanol (15 s) , xileno (30 s), xileno (30 s).</li>
		<li>Descarregue os cestos da gaveta e montar o slide com uma lamela.<ol>
<li>Coletar uma gota de montagem com uma pipeta e colocá-lo em uma borda exterior de deslizar a tampa.</li>
			<li>Coloque do lado molhado da lamínula no slide e deixe a montagem secar por 30 min.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realizar a coloração de IHC para ER, PR, Ki67 e HER2 usando um immunostainer automatizado. Nota: Antes de iniciar uma corrida de coloração, iniciar o sistema e verificar os frascos de reagente de consumíveis (Tabela de materiais) e contentor de lixo.<ol>
<li>Coloque os slides TMA para analisar a 60 ° C por 10 min.</li>
		<li>Começa o instrumento de immunostainer e software.</li>
		<li>Para o Vista Home, clique no botão de protocolos e clique em criar/editar protocolos.</li>
		<li>Selecione o padrão DAB (3, 3'-diaminobenzidine) procedimento IHC para modificar o modelo básico.</li>
		<li>Sinalizador "Deparaffinization" na lista da caixa e regule a temperatura do meio a 72 ° C.</li>
		<li>Bandeira de solução de desmascarar o cc1, definir a temperatura média em 95 ° C e o tempo de incubação a 36 min.</li>
		<li>Bandeira da caixa do anticorpo primário, inserir o ID do distribuidor ER inline (o software do instrumento reconhecerá o distribuidor no carrossel reagente) e definir o tempo de incubação em 16 min.</li>
		<li>Bandeira de caixa Counterstaining, selecione hematoxilina eu e definir o tempo de incubação em 12 min.</li>
		<li>Clique no botão "Salvar como" e o nome do protocolo.</li>
		<li>Repita as etapas 3.3.3-3.3.9 para os anticorpos restantes usando os seguintes tempos de incubação de anticorpos primários: PR 16 min, Ki67 16 min e HER2 12 min. usam anticorpos pré-diluídos ready-to-use (RTU).</li>
		<li>Para o Vista Home, clique no botão criar rótulo.</li>
		<li>Clique no botão de protocolos e adicione os protocolos de ER, PR, Ki67 e HER2 para cada um do TMA para analisar.</li>
		<li>Clique no botão fechar /Print.</li>
		<li>Como o modelo de rótulo aparece, digite as identificações de TMA para o rótulo.</li>
		<li>Clique no botão Imprimir para imprimir as etiquetas e aplique-os nas corrediças de TMA.</li>
		<li>Clique no ícone do instrumento e definir o modo de inicialização do instrumento como "Pronto".</li>
		<li>Abra o capô que cobre o carrossel de reagentes, coloque o sistema de detecção e anticorpos primários, em seguida, feche o capô.</li>
		<li>Clique no botão frontal em uma gaveta deslizante para abri-lo, carregar os slides TMA e fechar a gaveta, clicando no mesmo botão.</li>
		<li>Definir o modo de inicialização do instrumento como "funcionando" e siga as instruções.</li>
		<li>No final do executar, descarregar o TMA slides pressionando o aberto todas as gavetas com enxágue e botão concluído Slides sobre o instrumento de controlo de deslize-os em aquecer água e sabão para remover qualquer reagentes remanescentes.</li>
		<li>Lavar os slides sob água corrente fria de baixa pressão, desidratam corrediças de TMA e uma lamela de vidro para cada slide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realizar análise IHC da ER, PR e HER2 seguindo a sociedade americana de oncologia clínica (ASCO) / tampão diretrizes e de Ki67 de acordo com as recomendações do Ki67 internacional no grupo de trabalho de câncer de mama (tabela 2). Nota: Esta análise deve ser realizada separadamente nos pontos discretos de tecido por um patologista com experiência em patologia mamária.<ol>
<li>Avalie a expressão de ER como positivo se ≥ 1% dos núcleos de células do tumor são imunorreativas20,21,22,23.</li>
		<li>Avalie a expressão de PR como positivo se ≥ 1% dos núcleos de células do tumor são imunorreativas20,21,22,23.</li>
		<li>Avaliar a expressão de HER2 como: a) marcar 3 + membrana circunferencial coloração que é completa e intensa, b) marcar 2 + se a coloração de membrana circunferencial é incompleta e/ou fraco/moderado e dentro > 10% das células do tumor invasivo ou completa e coloração de membrana circunferencial é intensa e ≤ 10% das células do tumor invasivo, c) marcar 1 + coloração de membrana incompleta é fraco/quase imperceptível e dentro > 10% das células do tumor invasivo, d) negativo se nenhuma mancha está presente ou membrana a coloração é incompleto e fraco/quase imperceptível e dentro ≤ 10% do tumor invasivo células3,24.</li>
		<li>Avaliar o índice Ki67 como a percentagem de células com coloração nuclear pelo menos 1.000 células neoplásicas aleatoriamente selecionado mais de 10 campos de alta potência (ampliação, 400 X)25.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SISH análise de HER2
<ol><li>Seções TMA (repita o passo 3.1) de corte.</li>
	<li>
Execute SISH para HER2 usando um immunostainer automatizado.
	<ol>
<li>Coloque os slides TMA para analisar a 60 ° C por 10 min.</li>
		<li>Começa o instrumento de immunostainer e software.</li>
		<li>Para o Vista Home, clique no botão de protocolos e clique em criar/editar protocolos.</li>
		<li>Selecione o procedimento "U Dual ISH CKT" para modificar o modelo básico.</li>
		<li>Sinalizador "Secagem" na lista da caixa e definir a temperatura a 63 ° C por 20 min.</li>
		<li>Na lista da caixa, então "célula condicionado CC2", bandeira "Célula condicionado" e definir a temperatura em tempo de incubação e 86 ° C em 4 min.</li>
		<li>Bandeira CC2 suave (ciclo 1), norma (ciclo 2) e Extended (ciclo 3) por 8 min, 12 min e 8 min, respectivamente.</li>
		<li>Sinalizador "ISH-Protease 3" na lista da caixa e defina o tempo de incubação em 16 min.</li>
		<li>Selecione as sondas HER2DNP e CHR17DIG e defina o tempo de incubação em 6 h.</li>
		<li>Defina a lavagem a 76 ° C durante 8 min.</li>
		<li>Defina o tempo de incubação SISH multimer (SIL ISH DNP HRP) em 32 min.</li>
		<li>Defina o tempo de incubação de prata cromogénio (SIL ISH DNP CRHC) em 4 min.</li>
		<li>Defina o tempo de incubação multimer vermelho (vermelho ISH CAVAR AP) em 24 min.</li>
		<li>Defina o tempo de incubação de cromogénio vermelho (vermelho ISH CAVAR FR) em 8 min.</li>
		<li>Bandeira "Counterstaining" na lista da caixa, selecione "HEMATOXILINA II" e defina o tempo de incubação em 8 min.</li>
		<li>Bandeira "pós-Counterstaining" na lista da caixa, selecione "BLUING reagente" e defina o tempo de incubação em 4 min.</li>
		<li>Repita as etapas de 3.3.11-3.3.15 (modificado de selecionar protocolo U Dual ISH CKT).</li>
		<li>Abra o capô que cobre o carrossel de reagentes, coloque a roupa e os sistemas de detecção de ISH e, em seguida, feche o capô.</li>
		<li>Repita as etapas de 3.3.18-3.3.21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar análise SISH para HER2: avaliar a amplificação do gene HER2 positiva se a relação de /CEP17 do HER2é ≥ 2.0 com uma média HER2 cópia número ≥4.0 sinais por célula e negativo se a relação de /CEP17 do HER2é < 2.0 com uma média de HER2 copiar número < 4.0 sinais/célula3,24. Nota: Similar ao IHC, esta análise deve ser realizada separadamente nos pontos discretos de tecido por um patologista com experiência em patologia mamária.</li>
</ol>

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<li>Fusco, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+NAB2-STAT6+gene+fusions+and+oestrogen+receptor-%CE%B1+expression+in+pulmonary+adenofibromas%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas.</a> Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).</li>
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<li>Dekker, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+sensitivity+and+specificity+of+HER2+testing+in+breast+cancer+using+a+tissue+micro-array+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach.</a> Breast Cancer Res. 14 (3), R93(2012).</li>
<li>De Sio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MALDI-Mass+Spectrometry+Imaging+method+applicable+to+different+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues.</a> Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesses.

Aqui, temos as estratégias de laboratório para realizar análises SISH do gene HER2 e sua correspondente Centrómero em alto rendimento TMAs dos cancros da mama de forma heterogénea transformados detalhados. Este método é econômico e pode ser realizado na maioria dos laboratórios para o estudo da heterogeneidade de amplificação do gene HER2 em grandes coortes de mama câncer obtida forma patologia archives.
Devido a importância clínica do HER2 testes em câncer de mama e os desaf...

HER2 é um proto-oncogene que é overexpressed e amplificado em 15-30% de mama invasivo todos os cancros1,2. Superexpressão de HER2 é inferido pela presença de > 10% células com membrana forte imuno-histoquímica (IHC) coloração (3 +), enquanto a amplificação do gene pode ser avaliada quando a proporção de HER2/Centrómero é ≥2 ou o número de cópia do gene é ≥ 6, na contagem de pelo menos 20 células por em situ da hibridação (ISH)3.
Heterogeneidade genética intra-tumor tem sido amplamente descrita em cânceres de mama, sendo um contribuinte potencialmente adverso para avaliação de biomarcadores e tratamentos resposta4. De acordo com a faculdade de americana patologistas (CAP), HER2 heterogeneidade existe se HER2 é amplificado em > 5% e < 50% do tumor infiltrando-se células5. Lamentavelmente, a incidência real da heterogeneidade espacial HER2 no câncer de mama continua a ser um assunto de controvérsia entre os patologistas, com alguns autores de manutenção que é um evento extremamente raro e outros, sugerindo que até 40% dos casos são HER2-heterogêneos1,5,6,7,8,9,10. Apesar dos mecanismos biológicos subjacentes a esta condição não são ainda totalmente esclarecido, os impactos clínicos e prognósticos da heterogeneidade de HER2 intra-tumor são cruciais para a de pacientes de câncer de mama11.
Recentemente, técnicas moleculares brilhante-campo, tais como o cromogênico ISH (CISH) e prata ISH (SISH), têm emergido como métodos confiáveis para detectar heterogeneidade HER2 em tecidos FFPE, com algumas vantagens em comparação com fluorescente ISH (FISH)12. Lamentavelmente, a análise em massa dos casos simples continua a ser impraticável em estudos de coorte-grande investigação. Vários grupos têm sugerido que a combinação da histoquímica, IHC e ISH com tecnologias TMA poderia representar uma estratégia valiosa no estudo de câncer biologia13,14,15,16. Com este método amplamente adotado, amostras de tecido de diferentes pacientes analisáveis simultaneamente, minimizando o tecido e os reagentes empregados e, assim, fomentar a análise uniforme de uma grande série de casos14. No entanto, não há protocolos estão disponíveis para a caracterização molecular de elevado-produção simultânea de múltiplas amostras de tecido que foram submetidos a diferentes de processamento em termos de reagentes, tempos de fixação e métodos de conservação empregados, tais como arquivamento blocos.
Tendo em conta as implicações clínicas e prognósticos da heterogeneidade espacial HER2 no câncer de mama, desenvolvemos uma plataforma integrada de molecular para avaliá-la em grande série de casos de forma heterogénea transformados. Aqui, podemos retratar as estratégias de laboratório para gerar e analisar a heterogeneidade intra-tumor de amplificação do HER2 em alto rendimento TMAs do câncer de mama por meio de SISH. O protocolo a seguir foi desenvolvido para medir os tumores > 5 mm (> pT1b de acordo com o TNM 2017)17. Para lesões menores, recomendamos realizar a análise em seções seriais Full-face. Nosso processo permite a análise simultânea de IHC e SISH até 30 dos cancro da mama, englobando uma média de 6 áreas distintas (intervalo de 4-8) para cada caso. No total, 180 núcleos de tecido de 1 mm de diâmetro, com 500 µm entre os núcleos e 2 mm entre a grade e bordas serão gerados para cada bloco TMA.

<table><tbody><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha, UE</td><td>39601006</td><td>Meio de incorporação de tecidos, 56 &deg; C ponto de fusão</td></tr><tr><td>Eosin Y&nbsp; solução aquosa a 1%</td><td>Bio Optica, Milão, Itália, UE</td><td>510002</td><td>Eosin amarelado, solúvel em água</td></tr><tr><td>Carazzi' s hematoxilina</td><td>Bio Optica, Milão, Itália, UE</td><td>506012</td><td>Hematoxilina de alúmen amadurecida com iodato de potássio</td></tr><tr><td>Qualidade de diamante</td><td>Laboindustria, Arzergrande, Itália, UE</td><td>33533</td><td>Lâminas de microscópio de 26x76 mm</td></tr><tr><td>Leica CV Mount</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha, UE</td><td>14046430011</td><td>Meio de montagem, sem monômeros, à base de polímeros de butilmetacrilato em lâminas de microscópio de xileno</td></tr><tr><td>FLEX IHC</td><td>Agilent Technologies (Dako),&nbsp; Santa Clara, CA, EUA</td><td>K8020</td><td>Lâminas de microscópio revestidas para adesão de FFPE para uso no sistema médico IHC</td></tr><tr><td>BenchMark ULTRA</td><td>Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>N750-BMKU-FS</td><td>Sistema de coloração de lâminas</td></tr><tr><td>CONFIRMAR anti-Receptor de estrogênio (ER) (SP1) Anticorpo primário monoclonal de coelho</td><td>Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>790-4324</td><td>Anticorpo primário, pronto para uso</td></tr><tr><td>CONFIRMAR anti-Receptor de Progesterona (PR) (1E2) Anticorpo Primário Monoclonal de Coelho</td><td>Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>790-2223</td><td>Anticorpo primário, pronto para uso</td></tr><tr><td>CONFIRMAR anti-Ki-67 (30-9) Anticorpo Primário Monoclonal de Coelho</td><td>Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>790-4286</td><td>Anticorpo primário, pronto para uso</td></tr><tr><td>PATHWAY HER2 (4B5) Anticorpo Primário Monoclonal de Coelho</td><td>Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>790-4493</td><td>Anticorpo primário, pronto para uso</td></tr><tr><td>ultraView Universal DAB Detection Kit</td> Sistema <td>médico Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>760-500</td><td>Sistema indireto, livre de biotina, para detecção de IgG de camundongo, IgM de camundongo e anticorpos primários</td></tr><tr><td>de coelho INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>780-4422</td><td>INFORM HER2 Ensaio Dual ISH - Hibridização in situ de duas cores Ensaio automatizado aprovado pela FDA para determinar o status do gene HER2 em pacientes com câncer de mama&nbsp;</td></tr><tr><td>ultraView Silver ISH DNP Detection Kit</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>800-098</td><td></td></tr><tr><td>ultraView Red ISH DIG Detection</td><td>Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>800-505</td><td></td></tr><tr><td>ISH Protease 3</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>780-4149</td><td>Usado no processo ISH para remover a proteína que envolve as sequências de DNA alvo de interesse</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>760-2021</td><td>Reagente de contracoloração de hematoxilina de Gill modificado</td></tr><tr><td>Sistema médico Ventana de contracoloração</td> II<td>, Tucson, AZ, EUA</td><td>790-2208</td><td>Reagente de contracoloração de hematoxilina de Meyer modificado Reagente</td></tr><tr><td>de contracoloração de azulado</td><td>Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>760-2037</td><td>Solução aquosa de carbonato de lítio tamponado para seções coradas de hematoxilina azulada em lâminas de vidro</td></tr><tr><td>HybReady</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>780-4409</td><td>Tampão à base de formamida para ensaios</td></tr><tr><td>ISH EZ Prep (10x)</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>950-102</td><td>Solução concentrada para remoção de parafina de amostras de tecido durante reações IHC e ISH e para diluir 1:10.</td></tr><tr><td>Tampão SSC (10X)</td> <td>Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>950-110 Cloreto de</td><td>sódio A solução tampão de citrato de sódio é usada para lavagens rigorosas e para enxaguar lâminas entre as etapas de coloração e fornecer um ambiente aquoso estável para as reações de hibridização in situ. Diluir 1:5.</td></tr><tr><td>Sistema médico ULTRA LCS</td><td>Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>650-210</td><td>Solução de lamínula pré-diluída (pronta para uso) usada como barreira entre os reagentes aquosos e o ar para evitar a evaporação nas reações IHC e ISH</td></tr><tr><td>Tampão de reação (10x)</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, EUA</td><td>950-300</td><td>Solução tampão à base de Tris (pH 7,6 &plusmn; 0,2) para enxaguar as lâminas entre as etapas de coloração durante IHC e ISH. Diluir 1:10.</td></tr><tr><td>ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>950-223</td><td>Etapas de pré-tratamento no processamento de amostras de tecido durante IHC e ISH. Pronto para usar.</td></tr><tr><td>ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)</td><td>Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>950-224</td><td></td></tr><tr><td>ultraView Silver Wash II</td><td>Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA</td><td>780-003</td><td>Solução pronta para uso para enxaguar lâminas entre as etapas de coloração IHC e ISH</td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha, UE</td><td>RM 2255</td><td>Micrótomo rotativo automatizado</td></tr><tr><td>Multicorador</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha, UE</td><td>ST 5020</td><td>Estação de trabalho para coloração e lamínula automatizadas</td></tr><tr><td>Minicore 1</td><td>Alphelys, Plaisir, França, UE</td><td>00-MICO-1</td><td>Arrayer semiautomático para construção de TMA com software incorporado TMA Designer 2</td></tr><tr><td>Aperio ScanScope CS2</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha, UE</td><td>K080254</td><td>Dispositivo de captura de imagem - scanner de patologia digital</td></tr><tr><td>Tissue-Tek III Uni-</td><td>Sakura Finetek Europe BV</td><td>4135</td><td></td></tr><tr><td>Tecido-Tek Paraform Molde de Base Padrão</td><td>Sakura Finetek Europe BV</td><td>7055</td><td>Molde de metal base de aço inoxidável</td></tr></tbody></table>

construindo uma plataforma high-throughput screening para avaliar a heterogeneidade da amplificação do gene her2 no câncer de mama

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Terapias alvo contra o receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) de 2 mudaram radicalmente os resultados dos pacientes com câncer de Mama HER2-positivo. No entanto, uma minoria de casos exibe uma distribuição heterogênea de células HER2-positivo, que gera grandes desafios clínicos. Até à data, não há protocolos confiáveis e padronizados para a caracterização e quantificação de amplificação de gene HER2 heterogênea em grandes coortes têm sido propostos. Aqui, apresentamos uma metodologia de alta produtividade para avaliar simultaneamente o status HER2 em diferentes áreas topográficas de vários cancros da mama. Em particular, ilustramos o procedimento laboratorial para construir aprimorado os microarrays do tecido (TMAs) incorporando um mapeamento alvo dos tumores. Todos os parâmetros TMA foram otimizados especificamente para a prata em situ da hibridação (SISH) de formalina-parafina (FFPE) mama tecidos fixados. Análise imunohistoquímica de biomarcadores os prognósticos e preditivos (isto é, ER, PR, Ki67 e HER2) deve ser realizada utilizando procedimentos automatizados. Um protocolo personalizado de SISH foi implementado para permitir uma análise molecular de alta qualidade através de vários tecidos que passou por diferentes procedimentos de fixação, processamento e armazenamento. Neste estudo, nós fornecemos um prova de princípio que sequências específicas de DNA pode ser câncer de mama de forma heterogénea transformados e simultaneamente localizadas em áreas topográficas distintas de múltiplos usando um método eficiente e econômico.

Em geral, 444 mama invasivo cânceres foram incorporados em 15 TMAs especificamente otimizados para análises ISH. Entre os 2.664 pontos amostrados, 2.651 (99,5%) eram representativas das áreas previamente selecionadas e, portanto, considerado favorável para análises subsequentes. Heterogeneidade de intra-tumor foi determinada por meio de IHC e SIH, com particular ênfase para as distribuições heterogêneas de clones de HER2-positivo nas áreas topográficas distintas dos tumores. Tabel...

Distribuição heterogênea de células HER2-positivo pode ser observada em um subconjunto dos cancros da mama e gera dilemas clínicas. Aqui, apresentamos um protocolo confiável e econômico para definir, quantificar e comparar a heterogeneidade genética de HER2 intra-tumor em uma grande série de cancros da mama de forma heterogénea transformados.

Construindo uma plataforma High-throughput Screening para avaliar a heterogeneidade da amplificação do Gene HER2 no câncer de mama

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

O objetivo geral deste procedimento laboratorial é definir, quantificar e comparar simultaneamente a heterogeneidade genética intratumoral do HER2 em uma grande série de cânceres de mama processados heterogeneamente por meio de hibridização in situ de prata de alto rendimento. Este método pode ajudar a abordar a escolha chave da tradução e pesquisa do câncer de mama, como o estudo da heterogeneidade da amplificação do gene HER2, uma grande coorte de casos recuperados de arquivos de patologia. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a esquizoanálise de HER2 de alto rendimento em diferentes áreas topográficas de cânceres de mama múltiplos e heterogeneamente processados.Geralmente, os indivíduos novos na hibridização in situ terão dificuldades porque os estudos retrospectivos normalmente requerem a análise de amostras de arquivo que foram submetidas a diferentes procedimentos de fixação, processamento e armazenamento. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando decidimos reclassificar todos os cânceres de mama de nosso banco de dados institucional desde 2003. Demonstrando este procedimento estará Giulia Ercoli, técnica do nosso laboratório.Comece este protocolo

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui nós descrevemos um método para quantificar a heterogeneidade molecular em cortes histológicos de material do tumor através de imunofluorescência quantitativos, análise de imagem, e uma medida estatística de heterogeneidade. O método é destinado ao uso no desenvolvimento de biomarcadores e análises clínicas.

Mapeamento de heterogeneidade de expressão da proteína em tumores usando imunofluorescência Quantitative

Nós descrevemos uma metodologia que combina cultura de células automatizado com alto conteúdo de imagem para visualizar e quantificar vários processos celulares e estruturas, de uma forma de alto rendimento. Tais métodos podem auxiliar na anotação de genomas ainda mais funcional, bem como identificar redes de doença genética e alvos terapêuticos potenciais.

Screening alto teor em Doenças Neurodegenerativas

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Este manuscrito descreve protocolos clínicos para dois painéis de sequenciamento de próxima geração. Um painel interroga malignidades hematológicas, enquanto o outro painel tem como alvo genes comumente mutados em tumores sólidos. A classificação molecular de mutações condutoras em malignidades humanas oferece informações prognósticas e preditivas valiosas.

Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

Identificar novos alvos de medicamentos que fazem a transição de testes pré-clínicos para testes em humanos é uma prioridade científica. Para esse fim, descrevemos aqui uma abordagem genômica funcional para examinar o impacto da depleção de genes em esferóides de linhas de células cancerígenas, que modelam mais apropriadamente cânceres humanos in vivo.

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

Degradação do ácido nucleico em tecido arquivamento, heterogeneidade do tumor e a falta de amostras de tecido congelado fresco pode afetar negativamente o serviços de diagnóstico de câncer em laboratórios de patologia em todo o mundo. Este manuscrito descreve a otimização de um painel de biomarcadores usando um ensaio de multiplex do grânulo magnético para classificar os cancros da mama.

Otimização de um ensaio de expressão baseada em RNA Multiplex usando Material de arquivo de câncer de mama

Este artigo descreve um método para identificar alterações clonais e subclonais entre diferentes espécimes de um determinado paciente. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem em um tipo específico de tumor, a abordagem é amplamente aplicável a outros tumores sólidos.

Análise comparativa de lesões por meio de uma abordagem de sequenciamento direcionada

As células tumorais circulantes (CTCs) são críticas para o estudo da progressão e metástase do câncer. Este artigo apresenta um protocolo integrado de alto rendimento para enriquecimento de CTC e sequenciamento de CTC única, melhorando a eficiência de captura e a pureza da CTC, reduzindo os custos de contaminação e sequenciamento, avançando assim na pesquisa de oncologia de precisão e aplicações clínicas.

Tecnologia de Classificação de Células Tumorais Circulantes de Alto Rendimento e Tecnologia de Sequenciamento de Célula Única Baseada em Microfluídica

Aprenda a quantificar a heterogeneidade da amplificação do gene HER2 em câncer de mama usando hibridização in situ por prata em alta vazão. Este método permite analisar amostras arquivadas de forma eficiente.

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Construindo uma plataforma High-throughput Screening para avaliar a heterogeneidade da amplificação do Gene HER2 no câncer de mama

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