Construindo uma plataforma High-throughput Screening para avaliar a heterogeneidade da amplificação do Gene HER2 no câncer de mama
5 de dezembro de 2017
Distribuição heterogênea de células HER2-positivo pode ser observada em um subconjunto dos cancros da mama e gera dilemas clínicas. Aqui, apresentamos um protocolo confiável e econômico para definir, quantificar e comparar a heterogeneidade genética de HER2 intra-tumor em uma grande série de cancros da mama de forma heterogénea transformados.
O objetivo geral deste procedimento laboratorial é definir, quantificar e comparar simultaneamente a heterogeneidade genética intratumoral do HER2 em uma grande série de cânceres de mama processados heterogeneamente por meio de hibridização in situ de prata de alto rendimento. Este método pode ajudar a abordar a escolha chave da tradução e pesquisa do câncer de mama, como o estudo da heterogeneidade da amplificação do gene HER2, uma grande coorte de casos recuperados de arquivos de patologia. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a esquizoanálise de HER2 de alto rendimento em diferentes áreas topográficas de cânceres de mama múltiplos e heterogeneamente processados.
Geralmente, os indivíduos novos na hibridização in situ terão dificuldades porque os estudos retrospectivos normalmente requerem a análise de amostras de arquivo que foram submetidas a diferentes procedimentos de fixação, processamento e armazenamento. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando decidimos reclassificar todos os cânceres de mama de nosso banco de dados institucional desde 2003. Demonstrando este procedimento estará Giulia Ercoli, técnica do nosso laboratório.
Comece este protocolo com a seleção de pacientes e amostras de tecido, conforme descrito no protocolo de texto. Crie e abra um novo arquivo de planilha, incorporando os registros das distintas áreas de cada caso. Inclua colunas separadas para ID do caso, ID do bloco, ID da área, tipo de tecido, topografia, morfologia, status do biomarcador e todos os outros recursos imuno-histoquímicos disponíveis.
Crie um projeto TMA. Defina os blocos de destinatários do PMA navegando até o bloco file, new. Clique no primeiro campo para preencher e digite as dimensões do bloco de parafina.
Em seguida, crie um projeto de matriz de tecido navegando até arquivo, novo, matriz de tecido. Clique no ícone de importação e escolha o arquivo de modelo do bloco de destinatários criado anteriormente. Clique em Avançar.
Em seguida, escolha um milímetro como o tamanho do ponto clicando no botão redondo. Escolha 500 mícrons como espaçamento entre pontos, que é o espaço entre dois centros de pontos vizinhos. Em seguida, clique no ícone da calculadora para calcular o número total de vagas criadas, que deve ser 231.
Em seguida, clique no botão definir para criar grades e subgrades. Exclua as colunas oito e 15 e a linha central. Mantenha três pontos da linha um para orientação.
O mapa final deve abranger um número total de 183 vagas. Defina a lista de tipos de tecido navegando até arquivo, novo, lista de tipos de tecido. Em seguida, defina o projeto navegando até arquivo, novo, projeto de reforço.
Em seguida, prepare os blocos aceitadores. Encha os moldes de metal limpos com parafina elástica a 65 graus Celsius. Deixe os blocos de parafina esfriarem à temperatura do filme durante a noite dentro dos moldes de metal.
No dia seguinte, extraia os blocos de parafina dos moldes de metal. Construa o TMA usando um arrayer automatizado ou semiautomatizado ligando primeiro o arrayer e, em seguida, inserindo os blocos aceitadores no carrossel do arrayer. Defina a posição inicial em cada bloco receptor usando as teclas de seta para mover a luz do laser e alinhá-la com a borda superior esquerda na parafina do bloco receptor.
Clique em Avançar e repita para o alinhamento vertical. Clique em Avançar novamente para criar automaticamente um furo na coordenada definida anteriormente do bloco destinatário. Esvazie o soco.
Posicione o bloco doador para amostragem e remova um núcleo de tecido da área de interesse previamente anotada. Insira o núcleo de tecido doador no orifício do bloco receptor. Em seguida, remova o bloco doador do arrayer.
Repita essas etapas até que o TMA seja concluído. Coloque o lado do tecido do bloco de TMA recém-gerado em uma lâmina em branco estéril e coloque-os no forno de laboratório a 45 graus Celsius por cinco minutos. Pressione suavemente o bloco na lâmina por cinco segundos para achatar os núcleos de tecido.
Repita uma vez para um total de duas vezes. Em seguida, cubra a superfície do tecido TMA com uma fina camada de parafina elástica a 65 graus Celsius. Deixe o bloco TMA em temperatura ambiente por duas horas.
Por fim, transferir o bloqueio de TMA a quatro graus Celsius por 24 horas antes de realizar análises histoquímicas e imuno-histoquímicas, conforme descrito no protocolo de texto. Coloque as lâminas TMA para analisar a 60 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, inicie o instrumento e o software do imunocolorador.
Na exibição inicial, clique no botão protocolos e, em seguida, clique em criar/editar protocolos. Selecione o procedimento de coquetel ISH duplo para modificar o modelo básico. Sinalize o cozimento na lista de caixas e defina a temperatura em 63 graus Celsius por 20 minutos.
Em seguida, sinalize a desparafinização. Próximo condicionamento de célula de sinalizador na lista de caixas. Em seguida, sinalize o condicionamento da célula CC2 e defina a temperatura em 86 graus Celsius e o tempo de incubação em quatro minutos.
Sinalize CC2 leve por oito minutos, padrão por 12 minutos e estendido por oito minutos. Sinalize ISH-Protease três na lista de caixas e defina o tempo de incubação em 16 minutos. Selecione o HER2 dinitrofenil e o cromossomo 17 digoxigenina da sonda.
Incube por 16 minutos e, em seguida, defina a desnaturação por 20 minutos a 80 graus Celsius. Defina o tempo de incubação da sonda em seis horas. Em seguida, defina o tempo de incubação do multímero SISH em 32 minutos.
Defina o cromato de prata e o tempo de incubação em quatro minutos. Em seguida, defina o tempo de incubação do multímero vermelho em 24 minutos. Defina o cromato vermelho e o tempo de incubação em oito minutos.
Em seguida, sinalize a contracoloração na lista de caixas, selecione hematoxilina dois e defina o tempo de incubação em oito minutos. Sinalize a contracoloração pós-coloração na lista de caixas, selecione o reagente azulado e defina o tempo de incubação em quatro minutos. Por fim, realize a esquizoanálise para HER2.
Avalie a amplificação do gene HER2 como positiva se a proporção da sonda de enumeração do cromossomo HER2 17 for maior ou igual a 2,0 com um número médio de cópias de HER2 maior ou igual a 4,0 sinais por célula. Avalie como negativo se a razão da sonda de enumeração do cromossomo HER2 17 for menor que 2,0 com um número médio de cópias de HER2 menor que 4,0 sinais por célula. Aqui são mostradas micrografias representativas que mostram a análise de hibridização in situ de prata de um câncer de mama heterogêneo HER2.
Neste exemplo paradigmático, duas áreas distintas de câncer de mama invasivo de alto grau sem nenhum tipo especial mostram resultados diferentes em termos de amplificação do gene HER2, visualizado como pontos pretos, em comparação com a sonda de enumeração centromérica 17, visualizada como pontos vermelhos. Em particular, uma área pertencente ao núcleo do tumor e mostrando padrão de coloração irregular de citoqueratina sete foi amplificada por HER2, enquanto um único ponto na frente invasiva exibiu um padrão de HER2 do tipo selvagem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a esquizoanálise legível de matrizes marcadas de tecido que incorporam cânceres de mama múltiplos e heterogeneamente processados.
Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em dois dias úteis a partir da seleção do caso. Embora esse método seja otimizado para câncer de mama, ele pode ser traduzido para outros tipos de câncer nos quais a heterogeneidade do HER2 é criticamente relevante, como o câncer gástrico. As implicações dessa técnica se estendem para a avaliação simples do HER2 porque ela é projetada para o mapeamento abrangente de várias áreas topográficas em séries maiores de câncer de mama.
Ao participar deste procedimento, é importante evitar qualquer rachadura no bloco TMA. Mesmo uma rachadura mínima na parafina infere a qualidade, a reprodutibilidade e a clareza geral da hibridização in situ. Após este procedimento, a imagem de espectrometria de massa MALDI pode ser realizada para responder a perguntas adicionais sobre a proteômica do câncer de mama, particularmente em termos de heterogeneidade intra e intertumoral.
Não se esqueça de que trabalhar com punções TMA e cera de parafina quente pode ser perigoso e precauções como o uso de luvas de nitrilo descartáveis devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo confiável e de baixo custo para definir, quantificar e comparar a heterogeneidade genética intratumoral de HER2 em cânceres de mama. O método utiliza hibridização in situ de prata de alto rendimento para abordar dilemas clínicos decorrentes da distribuição heterogênea de células positivas para HER2.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa sobre Câncer de Mama
- Heterogeneidade Genética
- Técnicas de Hibridização In Situ
Contexto
- Células HER2-positivas exibem distribuição heterogênea em alguns cânceres de mama.
- Essa heterogeneidade representa desafios para a tomada de decisões clínicas.
- Os métodos existentes podem ter dificuldades com amostras arquivadas devido ao processamento variado.
- Técnicas de alto rendimento podem aprimorar a análise em múltiplas amostras.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para analisar a heterogeneidade da amplificação do gene HER2.
- Facilitar a pesquisa sobre câncer de mama utilizando uma grande coorte proveniente de arquivos de patologia.
- Melhorar a confiabilidade da análise de HER2 em ambientes clínicos.
Métodos Utilizados
- Hibridização in situ de prata de alto rendimento.
- Análise de uma grande série de casos de câncer de mama.
- Comparação da heterogeneidade genética do HER2 em diferentes áreas tumorais.
- Utilização de amostras arquivadas com diferentes métodos de fixação e processamento.
Resultados Principais
- O método permite a quantificação eficaz da heterogeneidade do HER2.
- A análise de alto rendimento revela variações significativas na expressão do HER2.
- Os resultados podem orientar decisões terapêuticas no manejo do câncer de mama.
- O protocolo é adaptável a diversas condições de processamento das amostras.
Conclusões
- Este protocolo aprimora a compreensão da heterogeneidade do HER2 no câncer de mama.
- Oferece uma ferramenta valiosa tanto para pesquisadores quanto para clínicos.
- Estudos futuros podem se basear neste método para investigar mais profundamente terapias relacionadas ao HER2.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A heterogeneidade do HER2 no câncer de mama complica as decisões terapêuticas e contribui para resultados clínicos variáveis, criando a necessidade de métodos padronizados e escaláveis de avaliação. Esta plataforma SISH de alto rendimento permite a quantificação simultânea da amplificação do gene HER2 em múltiplas topografias tumorais e amostras arquivadas, apoiando a validação pré-clínica de alvos e a estratificação de biomarcadores. Ao fornecer mapeamento reprodutível e quantitativo do status do HER2, o método aumenta a confiança preditiva nos fluxos de trabalho de descoberta inicial e pesquisa translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação dos padrões de amplificação do HER2 em diferentes regiões tumorais para esclarecer a validade do alvo e sua relevância biológica.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação funcional do alvo ao quantificar a variabilidade genética intra-tumoral em coortes arquivados de câncer de mama.
- Valor Preditivo: Gera razões entre os sinais HER2/cromossomo 17 e limiares de número de cópias para orientar decisões de avançar ou não na seleção de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do Ensaio: Produz formatos padronizados de TMA otimizados para SISH, permitindo triagem escalonável do status HER2 em amostras heterogêneas.
- Saída Quantitativa: Fornece a razão HER2/cromossomo 17 e o número médio de cópias de HER2 por célula como pontos finais mensuráveis para validação do ensaio.
- Reutilização da Plataforma: Adaptável a outros tipos de câncer (por exemplo, gástrico), onde a heterogeneidade do HER2 impacta a resposta terapêutica, apoiando a portabilidade do ensaio entre diferentes indicações.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mapeia o status do HER2 desde a descoberta até modelos pré-clínicos, preservando a heterogeneidade espacial em tecidos FFPE.
- Alinhamento de Biomarcadores: Integra-se à IHC para ER, PR, Ki67 e HER2, permitindo o perfilhamento multimodal de biomarcadores em coortes arquivados.
- Avanço Ajustado ao Risco: Identifica subpopulações HER2-negativas dentro de tumores aparentemente HER2-positivos, orientando estratégias de terapia combinada e mecanismos de resistência.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta à translação, permitindo a avaliação da heterogeneidade do HER2 após a identificação do alvo e antes dos testes de eficácia pré-clínica, particularmente na estratificação guiada por biomarcadores.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses sobre padrões de amplificação do HER2 e heterogeneidade de vias em amostras de tumores primários.
- Triagem: Garante a reprodutibilidade do ensaio por meio da construção padronizada de TMA e execução padronizada do protocolo SISH em espécimes com diferentes processamentos.
- Análises: Fornece razões quantitativas entre HER2/cromossomo 17 e limiares de número de cópias para permitir comparação objetiva da heterogeneidade genética.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade com estudos pré-clínicos ao associar padrões espaciais do HER2 a desfechos funcionais em sistemas modelo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalável e padronizada para avaliação do HER2 aplicável em múltiplas indicações de câncer e conjuntos de amostras arquivadas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista nas vias impulsionadas pelo HER2 ao resolver a heterogeneidade genética intra-tumoral.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio do arranjo automatizado de TMA e condições otimizadas de SISH.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência das decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer limiares quantitativos de HER2 para estratificação de pacientes em estudos pré-clínicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos direcionados ao HER2 mediante a identificação de tumores com perfis heterogêneos de amplificação.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na construção de microarranjos de tecidos, hibridização in situ e análise de patologia digital.
- Depende de coloridores automatizados, arranjadores de TMA e sistemas de imagem capazes de detectar sinais de SISH.
- Necessita padronização entre equipes de patologia, biologia molecular e bioinformática para interpretação consistente dos dados.
- Deve levar em conta variações na fixação, processamento e armazenamento ao comparar sinais de HER2 em amostras arquivadas.
- Limita-se à avaliação da amplificação de HER2 no nível de DNA; não detecta expressão proteica ou atividade de sinalização sem ensaios complementares de IHC ou ensaios funcionais.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
1:24
Design and Construct Tissue Microarrays (TMAs) Based on the Kononen Technique
6:20
Silver In Situ Hybridization (SISH) Analysis of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2)
9:11
Results: Analysis of Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers
10:00
Conclusion
