Name: Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 24 s
Description: Aprenda a técnica de injeção intramiocárdica percutânea guiada por ecocardiografia de contraste em corações de coelho. Este método permite a entrega precisa de injetáveis para pesquisa em medicina regenerativa cardíaca.

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Os autores agradecer Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz e Manuel Molina excelente apoio prestado durante a coleta de dados e Carlos Bueno para fornecer as células EGFP(+) HEK-293. Este trabalho foi financiado em parte por: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, região de Múrcia, Espanha (JT) (número de concessão: 11935/PI/09); Vermelho de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de eu + D + I 2008-2011 (conceder n. RD12/0019/0001) (JMM), co-financiado com fundos estruturais da União Europeia (FEDER) (GMC); e, a Universidade de Reading, Grã-Bretanha (AG, GB) (financiamento Central). Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de ética pesquisa da Universidade de Múrcia, Espanha e foram realizados em conformidade com a Directiva 2010/63/UE da Comissão Europeia. As etapas descritas foram realizadas sob protocolos operacionais padrão que faziam parte do plano de trabalho e não tem sido realizados exclusivamente com o propósito de filmar o vídeo que acompanha este livro.
1. preparação de células e o vetor de expressão dos mamíferos
Nota: Aqui, vamos descrever brevemente um protocolo para a preparação e a transfeccao de uma linha de celular (rim embrionário humano 293 (HEK-293)); no entanto, protocolos específicos de célula apropriada para o tipo de célula de interesse devem ser otimizada (por exemplo, as células-tronco).
<ol><li>Manter as células HEK-293 em alta glicose Dulbecco modificada do meio da águia (DMEM) suplementado com soro fetal bezerro de 10% (FCS), piruvato de sódio 1%, 2 mM de glutamina e 1% penicilina/estreptomicina e incubadas a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% umidificada CO2 . Uma vez que as células são sub confluentes, dividido na proporção de 1:3.</li>
	<li>Começar a dividir as células aspirando a mídia, em seguida, lave uma vez com fosfato estéril tampão salino (PBS), retire o excesso PBS e então incubar com 2,5 mL de 0.5 x ácido tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (5 min, a 37 ° C).<ol>
<li>Adicionar um volume de mídia DMEM (completada conforme descrito acima) para parar a reação e então separar as células aspirando lentamente e delicadamente acima e para baixo com uma pipeta eletrônica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em seguida, transferi a suspensão de células para um recipiente apropriado (por exemplo, tubo de centrifuga conico de 15-50 mL). Centrifugue em um balde de balanço (100 x g), desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com PBS estéril.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em mídia DMEM fresca e sementes em uma densidade de célula apropriada (por exemplo, 1 x 106 células em balão2 75 cm) em frascos de cultura fresco ou pratos grandes, de acordo com as práticas de laboratório local.<ol>
<li>Substitua a mídia existente com mídia fresca cada 2 dias. Nota: O vetor de expressão foi derivado de pIRES1hyg e usado de acordo com as instruções do fabricante, como descrito anteriormente,21. p(EGFP) IRES1hyg foi gerado pelo subcloning do cDNA EGFP como um BamHI + NotI inserir do pEGFP-N1 para o BamHI + NotI digerido pIRES1hyg21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 dia antes de transfeccao, semente HEK-293 células em uma densidade de 0,5 x 105 células/cm2 em placas de cultura de tecidos de 24 ou 12 --bem.</li>
	<li>No dia do transfection, prepare-se complexos de reagente de transfeccao lipídios-DNA em tubos de microcentrifuga separadas 1,5 mL (1 tubo/poço).<ol>
<li>Comece adicionando 250 µ l de meio de soro reduzida em cada tubo, e em seguida, adicione 4 µ g de DNA (misture suavemente).</li>
		<li>Posteriormente, adicionar 250 µ l de uma mistura previamente preparada de reagente de transfeccao 10 µ l lipídico e 250 µ l de meio de soro reduzida, para cada tubo (misture delicadamente novamente).</li>
		<li>Finalmente, proceder com transfections, incubando células HEK-293 com complexos de reagente de Transfeccao de lipídios de DNA por 4 h, então substitua DMEM suplementado como descrito acima (etapa 1.1) e incube por outro 48 h. Executar seleção de drogas de estábulo transfectants com 100 µ g/mL hptII B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Separe as células HEK-293 com tripsina como descrito acima (etapa 1.2). Depois de lavar as células em PBS estéril, resuspenda em um veículo apropriado (por exemplo, 10% v/v InI em PBS), para obter uma concentração final de célula de 5 x 106/mL.</li>
</ol>2. preparação do coelho
Nota: O posicionamento do transdutor e do coelho para IMI não é o ideal para avaliar a morfologia e função do coração do animal. Assim, é aconselhável realizar um exame ecocardiográfico completo20 antes o IMI (veja abaixo) e nos pontos de tempo posterior, conforme definido pelo design experimental. Isto terá como objectivo avaliar as linha de base características anatômicas e funcionais do coração no animal que receberá uma injeção e também avaliar os efeitos, do IMI na função do coração.
<ol><li>Efectuar este exame de forma cega e seguindo as orientações do Comité de ecocardiografia do colégio americano de medicina interna de veterinária e associação americana de sociedade de ecocardiografia/Europeia para Cardiovascular Imaging 22 , 23 , 24.</li>
	<li>Obter um rastreamento simultâneo 1-chumbo eletrocardiograma (ECG) ao longo do estudo ecocardiográfico toda.</li>
	<li>Anestesiar o coelho com ketamina 10mg/kg, combinado com a medetomidina 200 µ g/kg, injeção intramuscular (IM).</li>
	<li>Verifique se o nível da anestesia após 10-20 min após a administração da anestesia.</li>
	<li>Usando uma tesoura Retire os cabelos do peito amplamente (por exemplo, abaixo do pescoço à região sub xifoide) (figura 1A).</li>
	<li>Raspar as regiões adicionais de 1-2cm2 na face interna do membro direito anterior (região mediocubital) e de ambos os membros posteriores (região mediotibial) (figura 1B).</li>
	<li>Coloque o adesivos eletrodos de ECG nas regiões depiladas dos membros de forma síncrona, monitorar o ritmo cardíaco durante o procedimento (Figura 1).</li>
	<li>Coloque o animal na posição decúbito supino em uma manta térmica, com os membros estendidos usando fita cirúrgica anexada à tabela (Figura 1).<ol>
<li>Certifique-se que as orelhas são flexionadas para trás por trás das costas/cabeça do coelho e em uma posição que é inferior a seus membros dianteiros, pois isso ajuda a manter o correto posicionamento do tórax do animal durante todo o procedimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permitir que o animal de respirar espontaneamente enquanto administrar oxigênio por máscara durante todo o processo (100%, 2-3 L/min).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig1.jpg"> Figura 1. Preparação do coelho para IMI. (A) cortar o cabelo do tórax; (B) grampo de cabelo de membros; (C) Coloque eléctrodos e posicione o coelho com as pernas estendidas em uma manta térmica. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. técnica de contraste percutânea guiada por ecocardiografia IMI no coelho
<ol><li>Limpar e desinfectar a pele do tórax com uma solução à base de clorexidina.<ol>
<li>Use uma técnica asséptica durante todo o processo, de acordo com a actual melhor prática.</li>
		<li>Sempre que possível e se possível, realizar um procedimento totalmente estéril, incluindo, mas não limitado a, o uso de material estéril como vestidos, luvas, cortinas de ferida cirúrgica, estéril vestir material para a mesa, bem como um ultra-som estéril cobertura do transdutor e o gel de ultra-som estéril. Isto irá reduzir ao mínimo o risco de introdução de patógenos ao animal recebendo IMI e é uma prática comum na prática clínica (por exemplo, durante a punção cardíaca). Nota: Recomenda-se sempre proceder em conformidade com os regulamentos locais e nacionais de investigação animal aplicável à instituição local e país de prática.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplicar o gel de transmissão do ultra-som no peito e/ou para o transdutor e com o cabo do transdutor em volta do pescoço do experimentador, executar uma verificação de janela rápida do coração do animal, que muitas vezes é útil para visualizar a anatomia e planejar para o IMI.</li>
	<li>Coloque o transdutor manualmente no 4th-6th intercostal espaço, 2-3 cm da linha paraesternal direita com um ângulo de incidência de ~ 90 ° em relação ao lado direito da parede torácica (Figura 2A).</li>
	<li>Ajuste a localização do transdutor em relação do espaço intercostal, bem como seus ântero-posterior e ângulo dorsoventral para otimizar uma visão do eixo curto modificado ao nível dos músculos papilários. Identifica-se neste ponto de vista do ventrículo direito (RV), ventrículo esquerdo (LV), septo interventricular (IVS), parede posterior (PW), bem como ântero-lateral (AL) e músculos papilar póstero-medial (PM), (Figura 2B).<ol>
<li>Tem um amplo campo de visão, aumentando significativamente a profundidade utilizando o controle apropriado no sistema (por exemplo, botão, dial).</li>
		<li>Prestar especial atenção à obtenção de uma imagem simétrica nesta vista, bem como a diferenciação adequada de contornos endocárdico e epicárdico e, se necessário, ajuste através de controles de otimização de imagem (por exemplo, ganho).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que a visão ecocardiográfica ideal é obtida (Figura 2B), manter esta posição durante o resto do procedimento, enquanto um segundo operador executa o IMI (veja abaixo).<ol>
<li>Enquanto segura o transdutor, evite esconder a marca de orientação do transdutor, que deve sempre ser virado para a frente, permitindo assim o seu alinhamento com a agulha em etapas subsequentes (Figura 2A, C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Com uma agulha 24G ligada a uma seringa de 1 mL, coloca a agulha perto da pele do hemithorax esquerdo em uma posição de espelhamento simétrica em relação ao transdutor. Em seguida, manualmente, alinhe a agulha com a marca de orientação do transdutor em um ângulo de ~ 90° (Figura 2) e avançar lentamente a agulha através da pele e na cavidade do peito. Nota: A inserção da agulha percutânea nesta posição e orientação facilita a visualização da agulha no plano do feixe de ultra-som (Figura 2D, E), permitindo o monitoramento em tempo real e, quando necessário, ajuste de a localização da agulha em relação à região alvo do miocárdio (Figura 2, G, H).</li>
	<li>Com a ponta do local de destino, lentamente entregar o injectate (até 0,25 mL por injecção) dentro de 10-30 s (Figura 2E), enquanto a lenta e suavemente retracção da agulha durante a injeção para aumentar a extensão do miocárdio tratados.<ol>
<li>Use InI 10% (v/v), diluído em PBS para padronização da técnica e como um traçador em situ enquanto adquirindo competência, bem como para confirmar a segmentação bem sucedida de todos os quatro sites IMI dentro do miocárdio por patologia bruta e Histopatologia (ver Resultados do representante). Uma vez que a competência é alcançada, InI poderia ser substituído por um agente de contraste de ultra-som comercial adequado, se desejado. Nota: Entrega de 10% (v/v) InI diluída em PBS com ou sem células em resultados de miocárdio em hyperechogenicity transmural (ou seja, a aparência brilhante eco) no local de destino da injeção (Figura 2E, F). Transiente desaceleração ou aceleração da frequência cardíaca, associada com contrações ventriculares prematuras (por exemplo, isolado, parelhas de versos e trigêmeos) frequentemente são observados até mesmo do primeiro contato da agulha com o epicárdio, bem como durante e/ou logo após o IMI. No entanto, sem arritmias fatais são desenvolvidas, e efeitos adversos agudos raramente são observados usando até 0,25 mL (1,25 x 106 células) de injectate por injecção IMI (consulte Representante resultados e discussão).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar mudanças sutis no ângulo de incidência da agulha conforme necessário para completar a injeções de 0,25 mL para cada um dos sites IMI de quatro destino (três na ventricular esquerda livre parede (LVFW) e no IVS).</li>
	<li>Depois de concluir o procedimento IMI contraste percutânea guiada por ecocardiografia, avaliar o ritmo cardíaco (por exemplo, através da série ECG rastreamento e/ou 24 h Holter ECG) e realizar exames ecocardiográficos de serial janela para verificar a ausência de complicações, até que o animal está totalmente recuperado da anestesia e só então transferência para um quarto de ciclo de luz.<ol>
<li>Aqui, usamos o Holter ECG de 24h para monitorar os efeitos de IMI com InI no ritmo cardíaco durante 24 h. Para isso, comparamos um grupo de 6 coelhos com fenótipo normal (grupo Normal) e um grupo de 6 coelhos que receberam a administração intravenosa de doxorrubicina (uma cardiotóxicos regime droga, comumente usada para o tratamento de câncer; Grupo DOX) na dose de 2 mg/kg/semana por 8 semanas e então as duas coortes recebeu IMI com InI.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig2.jpg"> Figura 2 . Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelho. (A) colocação do transdutor no hemithorax direito a um ângulo de ~ 90 °. (B) imagem representativa de uma visão do eixo curto paraesternal (PSSX) do coração ao nível dos músculos papilários no coelho. (C) alinhamento da agulha em um ângulo de ~ 90 ° em relação a marca de orientação do transdutor. (D) localização da agulha no local de destino em uma exibição PSSX do coração (nota que a agulha é facilmente visualizada no plano do feixe de ultra-som). (E e F) demonstração de hyperechogenicity no local de destino mediante injeção Intramiocárdica com tinta nanquim (pontas de seta destacam o hyperechogenicity transmural). (G) localização acidental da agulha na câmara de LV (pontas de seta destacam o eixo da agulha). (H) reposicionamento da agulha para a parede livre de LV (pontas de seta destacam o eixo da agulha). RV = ventrículo direito; LV = ventrículo esquerdo; IVS = septo interventricular; PW = parede posterior; AL = músculo papilar ântero-lateral; PM = músculo papilar póstero-medial. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. publicar análises IMI
<ol><li>Realizar análise histopatológica de amostras de tecido do coração de coelhos.<ol>
<li>Fixar o tecido para 24h em formol 10%, seguido de desidratação, com o aumento da concentração de etanol como segue: • 1 x em 70% (60 min) • 1 x em ethanol/5% de 95% de metanol (60 min) • 1 x em 100% (60 min) • 1 x em 100% (90 min) • 1 x em 100% (120 min) Nota: Toda a incubação do acima é realizadas à temperatura ambiente (RT). Em seguida, substituir duas vezes com 100% de xileno (1h, RT) e finalmente incorporar em parafina em duas etapas (60 min, 58 ° C)25.</li>
		<li>Execute 4-5 µm, cortes de tecido com um micrótomo25. Monte seções em slides.</li>
		<li>Execute a coloração com hematoxilina-eosina e2726,25,do métodos corante tricromo de Masson.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em cortes de tecido do coração transplantada, execute imuno-histoquímica para detectar células HEK-293 de EGFP(+) (por exemplo, usando o método (ABC) complexo avidina-biotina), resumidamente:<ol>
<li>Cera de 4-5 µm seções de coração grosso em xilol 100% (10 min, a RT). Reidratar o tecido por lavagem com a diminuição de soluções de concentração de etanol (2 x em 100% (2 min); 2x em 95% (2 min) 1 x em 70% (2 min); 1 x em 50% (2 min); 1 x em 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) no RT</li>
		<li>Realizar a inibição da peroxidase endógena, cobrindo as seções com 100 µ l de 3% H2O2 diluído em metanol (preparado com 5 mL de solução stock de 30% de H2O2e a adição de metanol acima para um volume total de 50 mL) ( Incubar 30 min, RT) e em seguida lavar por imersão com solução salina tamponada de Tris (TBS; pH 7,6).</li>
		<li>Executar o antígeno desmascaramento através de tratamento enzimático, cobrindo as seções com 100 µ l de 0,1% Pronase (preparado com 0,01 g Pronase diluído em 10 mL TBS) (incubar 12 min, RT), em seguida lavar com TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incubar em solução (soro de cabra normal a 10% em TBS) de bloqueio usando 100 µ l por deslize (30 min, RT) e lavar com TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incube com frango antiproteína verde fluorescente (GFP) como anticorpo primário (1: 500 em TBS) (1 h, 30 ° C) e lavar com TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incube com anticorpo secundário biotinilado cabra-antifrango IgG (1: 250 em TBS) (1 h, 30 ° C) e em seguida lavar com TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incube com complexo avidina-biotina (20 min, 30 ° C) e então rotular usando tetrahydrochloride 3,30-diaminobenzidina (DAB) (RT, 5-10 min).</li>
		<li>Finalmente, desidrata-se por lavagem em aumentar as concentrações de etanol (1 x em 30% (2 min) 1 x em 50% (2 min) 1 x em 70% (2 min); 2 x em 95% (2 min); 2 x em 100% (2 min)) no RT, seções de corante de contraste usando o método de hematoxilina-eosina25e montar slides de capa. Incluem o positivo, negativo, bem como controles de isotipo. Nota: O protocolo breve descrito acima não se destina para uso geral imuno-histoquímica; otimização para o tecido de interesse e condições é necessária.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O objetivo principal era desenvolver uma técnica minimamente invasiva que pode ser utilizada para a entrega de células-tronco em miocárdio de coelhos (um grande porte pré-clínicos modelo animal)17,18, enquanto aproveitando-se da utilização de um relativamente barato prontamente disponível em muitas clínicas do sistema de imagem e centros de pesquisa. Aqui, mostramos que, usando um sistema de ecocardiografia clínica, e auxiliado por InI, um agente amplamente dispo...

Terapias celulares e gene são emocionantes e sempre desenvolvendo estratégias para a regeneração/reparação de miocárdio lesionado em HFrEF. Alguns estudos compararam a eficácia (por exemplo, taxa de retenção de célula) com as diferentes rotas de entrega de celular, que têm consistentemente demonstrado a superioridade do IMI sobre rotas Intracoronário ou intravenosa1,2 , 3 , 4 , 5. assim, não é surpreendente que uma grande proporção de estudos sobre modelos translacionais de terapia com células estaminais do miocárdio lesionado, entregar o injectate através do IMI realizada sob visão direta em um peito aberto procedimento6,7 . No entanto, esta abordagem tem várias limitações, incluindo a natureza invasiva do procedimento, que acarreta o risco de mortalidade peri-processuais (muitas vezes sob-relatado)8. Além disso, um IMI sob visão direta não elimina a possibilidade de injeção inadvertida na cavidade ventricular. Na prática clínica um IMI durante a cirurgia de peito aberto pode ser um método apropriado para a entrega de célula terapêutico, por exemplo, durante a artéria coronária ignorar a cirurgia de enxerto (CABG); no entanto, esta abordagem pode não ser apropriada para a entrega de célula na cardiomiopatia global de origem não-isquêmica (por exemplo, HFrEF secundária à cardiomiopatia induzida pelo regime (AICM)).
Não há dúvida que doença isquêmica do coração (IHD) é a causa mais comum de HFrEF (~ 66%)9,10; no entanto, cardiomiopatia não-isquêmica, incluindo AICM, ainda afeta uma proporção significativa de pacientes com HFrEF (33%)9 . Com efeito, os avanços recentes em oncologia clínica resultaram em mais de 10 milhões de sobreviventes de câncer em os EUA sozinhos11, com estimativas de um número similar na Europa, consistente com uma tendência geral para a sobrevivência melhorada de pacientes com câncer12 ,13. Assim, explorando os benefícios da novela terapias tais como transplante de células estaminais para cardiomiopatia não-isquêmica, bem como a testagem de uma rota eficaz e minimamente invasiva de células-tronco de entrega é de extrema importância, dado o número crescente de pacientes afetados por cardiotoxicidade secundária a drogas anticâncer.
Digno de nota, estudos utilizando a terapia de células-tronco, com o objetivo de reparação/regenerar o miocárdio lesionado frequentemente de testes de hipóteses envolve o uso de pequenos roedores (por exemplo, ratos e ratazanas). Estes modelos, muitas vezes, exigem sistemas de ultra-som caro de alta frequência para avaliação da função miocárdica, geralmente equipada com transdutores de matriz linear que tem algumas limitações inerentes de associado (por exemplo, reverberação)14. No entanto, outros modelos tais como coelhos, representando uma grande maquete pré-clínicos, possuem algumas vantagens para testar a hipótese de terapias de células-tronco em HFrEF. Assim, em contraste com ratos e camundongos, coelhos mantêm um sistema de transporte do Ca+ 2 e Eletrofisiologia celular que se assemelha ao de seres humanos e outros animais de grande porte (por exemplo, cães e porcos)15,16,17 ,18,19. Outra vantagem, é a sua acessibilidade para ultrassom cardíaco de imagem usando relativamente barato e sistemas amplamente disponível ecocardiografia clínica equipados com transdutores array fase relativamente alta frequência, por exemplo, 12 MHz, tais como aqueles usados frequentemente em Cardiologia Pediátrica e neonatal. Estes sistemas permitem excelente imagem ecocardiográfica com tecnologia de ponta, e eles se aproveitam da superioridade da harmônica de imagem20. Além disso, testes de hipóteses extensa do potencial de terapias regenerativas cardíacas (por exemplo, terapia de células-tronco), sua segurança, eficácia, cardiomyogenic potencial, bem como avaliação do destino do injectate uma vez entregaram para o miocárdio, é obrigatório antes de eles podem ser considerados para uso humano, e eles exigem o uso de modelos animais pré-clínicos grandes, tais como o coelho17,19. Aqui, descrevemos uma técnica minimamente invasiva para a entrega do celular através do IMI de contraste-ecocardiografia percutânea guiada usando um sistema de ecocardiografia clínica, que se destina na terapia baseada em transplante de células-tronco para cardiomiopatia não-isquêmica20 . Descrevemos também os benefícios da tinta nanquim (InI, também conhecida como tinta de China) como um traçador ultra-som de agente e em situ de contraste da injectate no centro de coelho.

<table><tbody><tr><td>Sistema de ultrassom HD11 XE</td><td>Sistema de</td><td>ecocardiografia</td> <td>Philips 10670267</td>.</tr><tr><td>S12-4</td><td>Philips</td><td>B01YgG</td><td>4-12 MHz transdutor de matriz de</td></tr><tr><td>fase Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)</td><td>Parket laboratories Inc</td><td>N 01-08</td><td></td></tr><tr><td>Vasovet 24G</td><td>Braun</td><td>REF 381212</td><td>&nbsp; cateter sobre a agulha</td></tr><tr><td>Omnifix-F Seringa de 1 ml</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Imalgene (Cetamina)</td><td>Merial</td><td>RN 9767</td><td>É necessária prescrição veterinária</td></tr><tr><td>Domtor (Medetomidina)</td><td>Esteve</td><td>CN 570686.3</td><td>É necessária prescrição veterinária</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faber-Castel TG1</td><td>Faber-Castel</td><td>16 33 99</td><td>Índia (China) Ink</td></tr><tr><td>Holter Syneflash</td><td>Ela SF0003044S médico</td><td></td> Sistema de <td>ECG Holter de 24 horas.</td></tr><tr><td>Eletrodos Sensor Azul&reg;</td><td>Eletrodos de ECG Holter Ambu (NUMED)</td><td>VLC-00-S</td><td>.</td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2155</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olimpus</td><td>CO11</td><td></td></tr><tr><td>ABC Vector Elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6200</td><td>Avidin Biotin Complex Kit.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP de frango</td><td>Invitrogen</td><td>A10262</td><td>Anticorpo primário.</td></tr><tr><td>Laboratório de vetor de anticorpo IgG de cabra anti-frango biotinilado</td><td></td><td>BA-9010</td><td>Anticorpo secundário.</td></tr><tr><td>3,30-diaminobenzidina tetracloridrato (DAB)</td> <td>DAKO (Agilent)</td> <td>Microscópio de fluorescência S3000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td>Zeiss AX10 Axioskop</td><td></td></tr><tr><td>Holter ECG</td><td>Elamedical</td><td>Syneflash SF0003044S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s meio Eagle modificado (DMEM)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>10% de soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11573397</td><td></td></tr><tr><td>0,05% de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (reagente de transfecção lipídica)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Meio de soro reduzido (Opti-MEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>Higromicina B</td><td>Calbiochem (MERCK)</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>Xileno (histológico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Peróxido de Hidrogênio (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Fisher Scientific</td><td>53-702-250KU</td><td></td></tr></tbody></table>

injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Terapia celular e gene são emocionantes e reduziram de promissoras para efeitos de regeneração cardíaca no cenário de insuficiência cardíaca com fração de ejeção (HFrEF). Antes que possam ser considerados para uso e implementados nos seres humanos, estudos pré-clínicos extensivos são necessárias em grandes modelos animais para avaliar a segurança, eficácia e destino do injectate (por exemplo, as células-tronco), uma vez entregado para o miocárdio. Pequenos roedores modelos oferecem vantagens (por exemplo, custo-eficácia, acessibilidade para manipulação genética); no entanto, tendo em conta as limitações inerentes destes modelos, estas conclusões raramente traduzem para a clínica. Por outro lado, grandes modelos animais como coelhos, têm vantagens (por exemplo, eletrofisiologia cardíaca semelhante em relação aos seres humanos e outros animais de grandes porte), mantendo um bom equilíbrio de custo-benefício. Aqui, demonstramos como executar uma técnica de injeção (IMI) contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica, que é minimamente invasiva, segura, bem tolerada e muito eficaz na entrega alvo de injectates, incluindo as células, em vários locais dentro do miocárdio de um modelo de coelho. Para a execução desta técnica, podemos também aproveitaram de um sistema de ecocardiografia clínica amplamente disponível. Depois de colocar em prática o protocolo descrito aqui, um pesquisador com conhecimento básico de ultra-som irá tornar-se competente no desempenho desta técnica minimamente invasiva e versátil para uso rotineiro em experiências, destinadas a testes de hipóteses do capacidades de terapêuticas regenerativas cardíaca no modelo de coelho. Uma vez que a competência é alcançada, todo o processo pode ser realizado em 25 min depois anestesiando o coelho.

IMI guiada por ecocardiografia com contraste percutânea com InI:
Usando o protocolo descrito acima, e uma vez que o posicionamento ideal da ponta da agulha foi confirmado pela ecocardiografia e iniciada a injeção, transmural hyperechogenicity foi observada durante a entrega do InI (10% v/v na PBS) (Figura 2E) , bem como logo após o IMI para a região de destino (...

Novas estratégias terapêuticas na medicina regenerativa cardíaca exigem extensos e detalhados estudos em modelos animais pré-clínicos grandes antes que eles podem ser considerados para uso em seres humanos. Aqui, vamos demonstrar uma técnica de injeção contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelhos, que é valioso para a eficácia de tais terapias romance de testes de hipóteses.

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer com segurança e precisão um volume de injeção no miocárdio ventricular esquerdo do coração do coelho. E para fazer isso aproveitando as orientações da ecocardiografia percutânea com contraste. Isso é feito primeiro anestesiando o animal e, em seguida, preparando o tórax para o procedimento.Em seguida, depois de colocar o coelho em um cobertor térmico e verificar se um sinal de ECG é exibido corretamente, use um sistema de ultrassom clínico para obter uma janela acústica apropriada e otimize a imagem em um amplo campo de visão. Em seguida, após carregar a seringa com células marcadas misturadas com um agente de contraste adequado e sob orientação de ultrassom, alinhe cuidadosamente a agulha oposta ao transdutor e posicione-a próxima à pele do hemitórax esquerdo, antes de avançar lentamente a agulha para a região alvo do miocárdio. Finalmente, o injetado é administrado com segurança, conforme demonstrado pela hiperecogenicidade transmural no local da injeção na imagem ecocardiográfica.Em última análise, a confirmação ex vivo da administração bem-sucedida do injetado é demonstrada pela presença de corante no miocárdio, enquanto a análise imuno-histoquímica transversal de seções de tecido miocárdico é usada para mostrar a entrega bem-sucedida de um marcador celular e corante no miocárdio alvo. O objetivo deste vídeo é demonstrar como realizar esta técnica com segurança e precisão, para nossa possibilidade, no coelho de hoje, usando um sistema de ecocardiografia clínica. As principais vantagens desta técnica são a natureza mínima e básica da máquina e a capacidade de usar orientação ecocardiográfica com contraste para visualização precisa dos locais alvo de injeção, reduzindo ao mínimo o risco de entrega acidental entre câmaras.Antes de prosseguir com a injeção intramiocárdica, comece injetando uma combinação de cetamina e medetomidina para anestesiar o animal. Conforme demonstrado, o coelho permanece calmo quando a cabeça é coberta com um cobertor cirúrgico. Uma vez que o animal esteja anestesiado, use uma máquina de cortar cabelo para remover os pelos da pele do tórax, começando abaixo do pescoço e depois passando para a região subxifóide.Raspe regiões adicionais de um a três centímetros da face interna do membro anterior direito, bem como as regiões tibiais mediais dos membros posteriores direito e esquerdo. Em seguida, aplique um gel condutor adequado nos eletrodos e posicione-os nas regiões raspadas dos membros. Fixe os eletrodos com fita cirúrgica para evitar a perda de contato durante a movimentação do animal durante o procedimento.Em seguida, coloque o animal em um cobertor térmico, verifique se um sinal de ECG correto é exibido na tela do sistema, mantenha o animal em decúbito dorsal e permita que o animal respire espontaneamente enquanto administra oxigênio por máscara facial durante todo o procedimento. Limpe e desinfete completamente a pele raspada do peito com uma solução à base de clorexidina. Para manter um bom contato da pele com o transdutor e reduzir artefatos e melhorar a qualidade geral da imagem, aplique uma quantidade suficiente de gel de ultrassom no transdutor.Em seguida, coloque manualmente o transdutor no quarto ao sexto espaço intercostal a dois a três centímetros de distância da linha paraesternal direita e em um ângulo de incidência do feixe de ultrassom de aproximadamente 90 graus, em relação à parede torácica. Certifique-se de que a marca de orientação do transdutor esteja voltada para a frente para facilitar seu alinhamento com a agulha nas etapas subsequentes. Você deve obter uma visão do eixo curto paraesternal do coração ao nível dos músculos papilares.E é importante ter um amplo campo de visão, aumentando a profundidade com o controle adequado no sistema. Se necessário, ajustar a localização do transdutor em relação ao espaço intercostal, bem como seu ângulo ântero-posterior e dorsoventral para otimizar a imagem e, em seguida, identificar nesta incidência os músculos ventrículo direito, VD, ventrículo esquerdo, VE, septo interventricular, SIV, parede posterior, PW, bem como músculos papilares ântero e posteromedial. Preste atenção especial para obter uma imagem simétrica nesta visão, bem como a diferenciação apropriada das contorções endocárdicas e epicárdicas e, se necessário, ajustar por meio de controles de otimização de imagem, como controle de ganho.Uma vez obtida a visão ecocardiográfica correta, mantenha essa posição durante todo o resto do procedimento enquanto um segundo operador realiza a injeção intramiocárdica. Para isso, use uma seringa pré-carregada com uma agulha acoplada que deve ser colocada perto da pele do hemitórax esquerdo em uma posição de espelhamento simétrica em relação ao transdutor. Em seguida, alinhe manualmente a agulha com a marca de orientação do transdutor em um ângulo de aproximadamente 90 graus e avance lentamente a agulha através da pele e na cavidade torácica.A inserção percutânea da agulha nessa posição e orientação permite a visualização da agulha no plano do feixe de ultrassom, permitindo assim o monitoramento em tempo real e, quando necessário, o ajuste da localização da agulha em relação à região alvo do miocárdio, como mostrado aqui. Nota-se, nesta imagem, a presença da agulha na câmara ventricular esquerda, mostrada pelas pontas das setas. Isso pode ser facilmente reposicionado retraindo e reposicionando suavemente a agulha no local desejado.Com a ponta no local alvo, administre lentamente o injetado por um período de 20 a 30 segundos, enquanto retrai lenta e suavemente a agulha para aumentar a extensão do miocárdio tratado. Realize mudanças sutis no ângulo de incidência da agulha conforme necessário para completar as injeções em quatro locais de injeção intramiocárdica. Um no septo intraventricular e três na parede livre do ventrículo esquerdo, e fornecem um volume de 250 microlitros de injetado por local de injeção.Após a conclusão do procedimento, continue monitorando as varreduras ecocardiográficas da janela bisserial do coelho, bem como os traçados de ECG para verificar a ausência de complicações secundárias ao procedimento, até que o animal esteja totalmente acordado da anestesia. O uso de monitoramento de ECG Holter de 24 horas é aconselhável para ajudar a determinar os efeitos das injeções intramiocárdicas no ritmo cardíaco. Utilizando o protocolo aqui descrito, uma vez confirmado o posicionamento intramiocárdico da ponta da agulha por ecocardiografia e iniciada a injeção, observou-se hiperecogenicidade transmural durante a entrega de tinta nanquim na região alvo nesta incidência paraesternal de eixo curto, pontas de setas brancas.A hiperecogenicidade também foi observada logo após a injeção, conforme mostrado nesta visão paraesternal de eixo longo do coração, onde uma imagem brilhante de eco pode ser vista claramente nas cabeças das setas brancas do septo interventricular. Quando a injeção intramiocárdica foi imediatamente seguida de eutanásia, depósitos de tinta nanquim eram facilmente visíveis no exame externo do coração, como mostrado nesta imagem. Pontas de seta pretas.Da mesma forma, cortes de tecido cardíaco no nível dos músculos papilares revelaram depósitos transmurais de tinta nanquim na parede livre do ventrículo esquerdo, cabeças de setas pretas, demonstrando uma entrega eficiente e eficaz de injetado no miocárdio. Nesta mesma imagem, um depósito de tinta nanquim também era visível no septo interventricular. Seta branca.Embora o procedimento tenha sido geralmente bem tolerado, foi muito comum observar aceleração ou desaceleração transitória da frequência cardíaca, associada a contrações ventriculares prematuras isoladas, PVC, tanto durante quanto logo após o procedimento. De fato, o monitoramento com Holter ECG de 24 horas em animais que receberam injeção intramiocárdica com tinta nanquim revelou que as arritmias eram muito comuns e que sua frequência relativa poderia ser afetada pelo estado fisiológico subjacente do animal. Esta imagem mostra um exemplo de PVC isolado, a arritmia mais frequentemente observada, detectada durante o Holter.Uma comparação entre um grupo de coelhos com fenótipo normal e um grupo de coelhos que receberam administração intravenosa de doxorrubicina, ou DOX, uma droga cardiotóxica e contra o câncer, por oito semanas. Antes da injeção intramiocárdica com tinta nanquim indicou que os PVCs isolados foram significativamente mais frequentes no grupo DOX. Outras arritmias detectadas pelo Holter ECG em ambos os grupos foram dísticos de PVC, trigêmeos de PVC e taquicardia ventricular não sustentada.Significativamente, enquanto a frequência cardíaca média nos grupos normal e DOX foi comparável, o desvio padrão do normal para normal, intervalos R para R ou SDNN, uma medida da dinâmica não linear relacionada ao estado de saúde do coração, exibiu uma redução acentuada no grupo tratado com doxorrubicina. Antes do procedimento, a transfecção bem-sucedida da proteína fluorescente verde aprimorada, células marcadas positivas para eGFP, foi confirmada por uma microscopia de fluorescência durante as condições de cultura de células in vitro. Então, após a injeção intramiocárdica, que foi imediatamente seguida de eutanásia, a entrega bem-sucedida de células marcadas positivas para eGFP no miocárdio foi demonstrada por meio de análise imuno-histoquímica de cortes de tecido cardíaco.Assim, como mostrado nesta imagem, abundantes células marcadas estavam presentes no miocárdio. Pontas de setas pretas, intercaladas com depósitos de tinta nanquim. Depósitos de tinta nanquim e abundantes células positivas para eGFP, pontas de setas brancas, ainda estavam presentes quando a eutanásia foi adiada por 24 horas após a injeção intramiocárdica.É importante notar que uma resposta inflamatória aguda foi observada neste momento, com neutrófilos infiltrando o miocárdio, setas vermelhas, sugerindo uma resposta aguda de rejeição celular às células xenogênicas que foram transplantadas. Inflamação aguda também foi observada 24 horas após a injeção intramiocárdica apenas com tinta nanquim. No entanto, neste caso, as células predominantes que infiltraram o miocárdio foram os macrófagos.Pontas de seta brancas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma injeção intramiocárdica percutânea, guiada por ecocardiografia contrastada em um coração de coelho. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 25 minutos após a estase.

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JoVE Journal

Medicine

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Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos (Vídeo) | JoVE Journal

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

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