Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

O objetivo geral deste procedimento é criar um modelo animal de atrofia geográfica de olhos grandes para transplantar células epiteliais pigmentares da retina derivadas embrionárias humanas para o olho e avaliar a integração das células doadoras usando tomografia de coerência óptica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina regenerativa, como o tratamento baseado em células-tronco para doenças degenerativas. A principal vantagem desse ambiente cirúrgico é a fonte ilimitada de células saudáveis e o cenário cirúrgico para injeção sub-retiniana, que tem muitas semelhanças com um procedimento destinado ao paciente.

As implicações desta técnica se estendem à terapia da degeneração macular relacionada à idade por meio da ostentação de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco embrionárias humanas. Nossa zootecnista, Monica Aronsson, está segurando o coelho em posição para que possamos visualizar e visualizar a retina com tomografia de coerência óptica. Depois de anestesiar um coelho de acordo com o protocolo de texto, coloque-o sob o microscópio cirúrgico com a cabeça voltada para o cirurgião.

Em seguida, use um afastador de pálpebra para remover as pálpebras e um pano estéril para remover a membrana nictitans. Para microcirurgia, use uma técnica de pars plana transvítrea de calibre 25 de duas portas ou três portas opcional com trocartes não valvulados para a inserção de instrumentos microcirúrgicos. A máquina de vitrectomia multifuncional possui portas para conectar uma cânula de infusão, endoiluminação, um vitrector e um endolaser.

Para injeções sub-retinianas, apenas a endoiluminação é obrigatória, o que torna suficiente uma configuração de duas portas. Usando uma pinça de coágulo para agarrar e deslocar a conjuntiva, sobrepasse o local de inserção. Insira transesclericamente um dos dois trocartes superiores, a um a dois milímetros do limbo, em um ângulo paralelo de limbo de trinta a quarenta e cinco graus.

Prossiga para inserir o trocarte no meio da ponta. Em seguida, gire o trocarte noventa graus e avance-o para o olho, visando o pólo posterior. Isso evitará o vazamento pós-cirúrgico dessa esclerotomia e também diminuirá o risco de endoftalmite.

Repita com o segundo trocarte superior. Ao inserir o trocarte, é importante estar de um a dois milímetros do limbo para tunelar a inserção e apontar para o pólo posterior para minimizar o risco de infecção, sangramento vítreo, descolamento de retina e toque da lente. Aplique lágrimas sintéticas como um gel de contração na córnea e, em seguida, posicione uma lente de contato plana de uso único na córnea para visualizar a retina.

Em seguida, coloque quinhentos microlitros de iodato de sódio em uma seringa de um mililitro conectada a um tubo de extensão operado por um assistente e uma cânula com ponta de polietileno de calibre 38 operada pelo cirurgião. Insira a sonda de endoiluminação através do trocarte superior esquerdo. Em seguida, insira a cânula de injeção através do trocarte superior direito e avance a cânula através do espaço vítreo em direção à retina, visando a área logo abaixo da cabeça do nervo óptico.

Permita que a ponta da cânula toque lentamente a retina até que um clareamento focal seja visível. Não deixe a cânula penetrar na retina, pois isso pode causar hemorragia. Agora, penetrando na retina com a agulha, injete cinquenta microlitros de iodato de sódio por via sub-retina durante um período de cinco segundos.

Como existe um plano de clivagem natural entre a retina e a coróide subjacente, uma bolha semitransparente claramente visível deve se formar gradualmente durante a injeção. Durante a injeção, retraia lentamente a agulha, mas certifique-se de que a ponta seja mantida dentro da bolha para minimizar o refluxo. Após a remoção da endoiluminação e da cânula de injeção, use uma pinça de coágulo para remover os trocartes.

Em seguida, use a ponta, ou a extremidade romba da pinça, para aplicar uma leve pressão por trinta segundos na esclerotomia sem sutura de vedação suave. Durante a recuperação, atender o animal de acordo com o protocolo de texto e aguardar sete dias pelo transplante. Sete dias após a injeção de iodato de sódio e após a administração de triancinolona intravítrea, de acordo com o protocolo de texto, remova o meio de diferenciação celular de uma monocamada de hESC-RPE confluente de vinte e quatro poços e use quinhentos microlitros de PBS sem cálcio e magnésio para lavar cada poço.

Depois de tripsinizar as células, incline a placa e remova cuidadosamente a tripsina para permitir que as células permaneçam presas à placa. Colete as células em oitocentos microlitros de meio de diferenciação pré-aquecido fresco de trinta e sete graus Celsius, pipetando suavemente, ou mesmo raspando, se necessário, para obter uma única suspensão celular. Usando zero vírgula dois por cento de azul de tripano, conte as células em uma câmara de hemocitômetro de acordo com as instruções do fabricante.

Em seguida, adicionar cinco mililitros de meio de diferenciação à suspensão celular e centrifugar as células a trezentas vezes g, à temperatura ambiente, durante cinco minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em PBS esterilizado por filtro fresco a uma concentração final de mil células por microlitro. Alíquota da suspensão celular anterior em alíquotas de seiscentos microlitros e mantenha-as no gelo até e durante a cirurgia.

Após anestesiar o coelho e dilatar as pupilas de acordo com o protocolo de texto, coloque o coelho com a cabeça voltada para o cirurgião. Use o afastador da pálpebra para remover as pálpebras e um pano estéril para remover a membrana nictitans. Para microcirurgia, use uma técnica de pars plana transvítrea de calibre 25 de duas portas ou três portas opcional com trocartes colocados nas mesmas posições demonstradas anteriormente neste vídeo.

Se as esclerotomias anteriores forem visíveis, execute a inserção do trocarte apenas adjacente, mas não através desses locais de inserção, para minimizar o risco de vazamento pós-operatório. Aplique lágrimas sintéticas no olho como antes e coloque uma lente de contato plana de uso único sobre a solução na córnea para visualizar a retina. Depois de posicionar adequadamente a ponta e apontar para o centro da área pré-tratada com iodato de sódio, distinguida por um reflexo de endoiluminação metálico característico, injete sub-retinalmente cinquenta microlitros de uma suspensão hESC-RPE suavemente misturada.

A retina neurossensorial deve se separar facilmente, criando uma bolha claramente visível. Durante a injeção, retraia lentamente a agulha, mas certifique-se de que a ponta seja mantida dentro da bolha para minimizar o refluxo. Após a remoção da endoiluminação e da cânula de injeção, use uma pinça de coágulo para remover os trocartes e use a extremidade romba da pinça para aplicar uma leve pressão por trinta segundos como antes.

Use uma tomografia de coerência óptica de domínio espectral, ou dispositivo SD-OCT, com o software que o acompanha para obter B-scans transversais dos animais tratados, de acordo com as instruções do fabricante. Coloque o animal anestesiado e com dilatação da pupila em uma montagem ajustável para obter um caminho desobstruído da fonte de luz do instrumento até a retina do coelho. Para evitar o desfoque da imagem, mantenha a córnea úmida lavando com solução salina tópica a cada trinta a sessenta segundos.

Obtenha pelo menos três varreduras de OCT com oftalmoscopia a laser de varredura confocal infravermelha simultânea ou imagens de referência de refletância SLO confocal representando a parte superior, central e inferior da área injetada. Obtenha várias cores de laser simultâneas de imagens de fundo de olho com SLO confocal azul, verde, infravermelho e refletância de laser multicolorida. Capture imagens de autofluorescência de luz azul usando o recurso de laser de luz azul do dispositivo SD-OCT.

Imagens in vivo representativas de BAF, IR-cSLO e SD-OCT de uma retina normal de coelho albino são mostradas aqui. Uma explosão da imagem SD-OCT ilustra as diferentes camadas da retina com seus níveis distintos de reflexão de luz capturados pelo instrumento SD-OCT. Como mostrado nesta imagem SD-OCT, tirada três meses após a injeção de cinquenta microlitros de uma solução milimolar de iodato de sódio, é criada uma bolha que se dissolveu e degenerou progressivamente a retina externa.

Pode-se observar afinamento das camadas neurorretinianas mais externas nas áreas SD-OCT e hipo-BAF, correspondendo à perda de EPR, recriando assim um fenótipo semelhante ao GA. Após a identificação da área de dano, cinquenta mil células hESC-RPE foram reinjetadas para transplante, criando uma segunda bolha que se resolveu. Áreas de hiper-BAF leves a moderadas estão presentes com um hiper-BAF focalmente aumentado na fronteira da área de dano, indicativo de estresse crônico do EPR nativo.

A bolha correspondente à injeção de hESC-RPE em olhos não pré-tratados mostrando manchas de células pigmentadas na imagem MC e estruturas retinianas bem preservadas na varredura SD-OCT é mostrada para comparação. Dominar este belo método clínico para injeção sub-retiniana facilitará o transplante clínico de tratamento baseado em células para condições, como degeneração macular relacionada à idade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como configurar injeções sub-retinianas em um modelo de tipo de vida, como preparar células derivadas de células-tronco embrionárias humanas para injeções sub-retinianas e como visualizar a integração de células doadoras usando tomografia de coerência óptica.