Name: Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprenda a realizar transplante subretinal de células epiteliais de pigmento retinal derivadas de células-tronco embrionárias humanas em modelo de grandes olhos com atrofia geográfica.

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Este estudo foi suportado por concessões do Instituto Karolinska, Fundação do coroa princesa Margareta para os deficientes visuais, Edwin Jordan Fundação para pesquisa oftalmológico, o sueco Eye Foundation, da rei Gustav Foundation V, a ARMEC Lindeberg Foundation e Fundação Cronqvist.

O seguinte protocolo segue as orientações de cuidados com animais de Karolinska Instituet. Todas as experiências com animais usando coelhos albinos de Nova Zelândia (Tabela de materiais) foram aprovadas pelo Comitê de ética animal regional (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permitir: dnr 56/15). O uso de hESC (dnr 2011/745-31/3) e a transferência e manipulação de hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) também está em conformidade com a legislação sueca e regulamentos do Karolinska Institutet e foi aprovado pelo (Comité de ética humana regional Regionala Etikprövningsnämnden eu Stockholm).
1. apresentam injeção de iodato de sódio (NaIO3) em um modelo Animal de olhos grandes
<ol><li>Anestesiar animais por administração intramuscular na coxa com uma mistura de 35 mg/kg de ketamina e xilazina 5 mg/kg em soro fisiológico, utilizando uma seringa de 30 G, e dilatar as pupilas com colírio tópico, usando uma mistura de fenilefrina ciclopentolato e 2,5% de 0,75%. Anesthetization adequada é confirmado se o animal não reage a uma pitada dura de sua perna de trás.</li>
	<li>Coloque o coelho sob o microscópio cirúrgico com a cabeça virada para o cirurgião (figura 1A). Use um afastador de tampa para remover as pálpebras e nictitans membrana com um pano estéril para minimizar o risco de contaminação. Uso equilibrado de solução salina (BSS) para evitar ressecamento enquanto sob anestesia em ambos os olhos.</li>
	<li>
Para microcirurgia, uso uma porta 2 (ou 3-porta opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica com GMD sem válvula, para a inserção de instrumentos microcirúrgicos (figura 1B). A máquina multifunções vitrectomia tem portas para conectar uma cânula de infusão, endoillumination, vitrector e endolaser. Por injeções subretinal, apenas o endoillumination é obrigatório, o que faz um set-up 2 portas suficientes. Insira o endoillumation através do trocarte superior esquerdo e use o trocarte direito superior para a cânula injeção subretinal.
	<ol>
<li>Para uma configuração de 3 portas, use o trocarte temporal inferior para a cânula de infusão de BSS. Se os instrumentos facultativos (como um vitrector) são usados, inseri-los através do trocarte direito superior.</li>
		<li>Introduza os 2 trocartes superiores 1-2 mm do limbo usando pinça de garras para agarrar e deslocar a conjuntiva sobrejacente o local de inserção.</li>
		<li>Verifique se os trocartes são transsclerally inserido em um ângulo de paralelo de limbo de 30-45° e prosseguir para o meio da ponta do trocarte. Em seguida rode o trocarte 90° e avançar para dentro do olho, visando o polo posterior do olho. Este procedimento irá evitar o escapamento pós-cirúrgica dos sclerotomies e também diminuir o risco de Endoftalmite (ou seja, a infecção bacteriana no olho). Veja também Figura 2B para posições de trocarte.</li>
		<li>Colocar uma lente de contato plana de uso único na córnea para visualizar a retina, com lágrimas sintéticas como gel de contato entre o olho e a lente de contato (figura 1A).</li>
		<li>Desenhe 500 µ l de NaIO3 em uma seringa de 1 mL, conectado a um tubo de extensão (operado pelo assistente) e uma cânula de polytip de 38 G (operado pelo cirurgião).</li>
		<li>Inserir a sonda de endoillumination através do trocarte superior esquerdo e a cânula de injeção através do trocarte superior direito e fazer avançar a cânula através do espaço vítreo para a retina, apontando para a área logo abaixo da cabeça do nervo óptico.</li>
		<li>Permitir que a ponta da cânula para tocar lentamente a retina até um clareamento focal é visível. A injeção em si irá penetrar na retina, permitindo a entrega subretinal. Não deixe a cânula penetrar na retina, pois pode causar hemorragia.</li>
		<li>Injete 50 µ l de NaIO3 subretinally durante um período de 5 s. Uma vez que existe um plano de clivagem natural entre a retina e a coroide subjacente, uma bolha semitransparente claramente visível deve formar gradualmente durante a injeção.</li>
		<li>Durante a injeção, lentamente retratar a agulha, mas certifique-se de que a ponta é mantida dentro da bolha para minimizar o refluxo.</li>
		<li>Após a remoção da cânula endoillumation e injeção, remover os trocartes usando pinça de garras e aplique uma leve pressão para 30 s para os sclerotomies de sutura-menos Auto-selante usando a ponta ou extremidade romba da pinça.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Post-surgically dar 10 mL de soro fisiológico por via subcutânea para prevenir a desidratação. Não dê pós-cirúrgica esteroides tópicos ou antibióticos. Para analgésicos dar 0,5 mL de buprenorfina 0,3 mg/ml por via subcutânea após a cirurgia, bem como o dia após a cirurgia.</li>
	<li>Após o uso, lavar todos os instrumentos, mergulhando-os por alguns segundos em primeiro lugar em etanol a 70%, em segundo lugar em etanol a 45% e por último, em água destilada. Secá-las corretamente com uma toalha de papel.</li>
	<li>Assistir animais até que recupere a consciência suficiente e colocá-los todos solteiros engaiolado. Se for necessário (por exemplo, para fins de imuno-histoquímica), eutanásia em animais por injecção intravenosa de pentobarbital 100 mg/kg (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Espere 7 dias para prosseguir com o transplante de células hESC-RPE.</li>
</ol>2. apresentam transplante de células de hESC-RPE em animais tratados
<ol><li>Administrar 2mg (100 µ l) de intravitreal triancinolona em animais anestesiados, usando uma agulha de injeção de 30g inserida 1-2 mm do limbo no quadrante temporal inferior 1 semana antes do transplante de hESC-RPE e administrá-lo novamente a cada 3 meses. Certifique-se de ponto a ponta para o polo posterior do olho para evitar um toque de lente.</li>
	<li>Cultura uma monocamada hESC-RPE conforme descrito anteriormente,1.</li>
	<li>Remova a mídia de diferenciação celular (ver Tabela de materiais) de uma monocamada confluente 24-bem hESC-RPE e lavar cada um com 500 µ l de PBS sem Ca2 + e Mg2 +. Repita esta ação mais uma vez, para um total de 2 lavagens.</li>
	<li>Descartar o sobrenadante, adicione 500 µ l de tripsina por bem e incubar durante 12 min a 37 ° C.</li>
	<li>Incline o prato e Retire cuidadosamente a tripsina (células devem permanecer anexadas à placa). Recolha pilhas em 800 µ l de mídia de diferenciação escaldadas fresco 37 ° C por pipetagem suave, ou mesmo raspar se necessário, para obter uma suspensão de célula única. Nota: Use um coador de célula de 40 µm se observam-se aglomerados de células.</li>
	<li>Contagem de células em uma câmara de hemocytometer usando 0,2% Trypan azul, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Adicione 5 mL de células de mídia e centrífuga de diferenciação à temperatura ambiente, 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Descartar o sobrenadante e ressuspender em PBS filtro recém esterilizados (passado através de um filtro de seringa de 25 mm) a uma concentração final de 1.000 células / µ l.</li>
	<li>Alíquota a anterior suspensão de eritrócitos em 600 alíquotas µ l e manter no gelo até e durante a cirurgia.</li>
	<li>Anestesia animais por administração intramuscular na coxa com uma mistura de 35 mg/kg ketamina e 5 mg/kg de xilazina em Salinas, utilizando uma seringa de 30 G. Dilate as pupilas com colírio tópico usando amix de fenilefrina ciclopentolato e 2,5% de 0,75%. Anesthetization adequada é confirmado se o animal não reage a uma pitada dura em sua perna de trás.</li>
	<li>Coloque o coelho com a cabeça virada para o cirurgião. Use um afastador de tampa para remover as pálpebras e nictitans membrana com um pano estéril para minimizar o risco de contaminação. Use BSS para evitar ressecamento enquanto sob anestesia em ambos os olhos.</li>
	<li>
Para microcirurgia, uso uma porta 2 (ou 3-porta opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica com trocartes colocados nas mesmas posições, conforme descrito na etapa 1.3 e a Figura 2. Se o sclerotomies anteriores são visíveis, realizar inserção de trocarte só adjacente, mas não através destes, para minimizar o risco de fugas no pós-operatório.
	<ol>
<li>Colocar uma lente de contato plana de uso único na córnea para visualizar a retina, com lágrimas sintéticas como o gel de contato entre o olho e a lente de contato (figura 1A).</li>
		<li>Após o correcto posicionamento (consulte as etapas 1.3.5 e 1.3.6) da ponta, injete 50 µ l de uma suspensão suavemente misturados hESC-RPE (50.000 células) subretinally. Aponte para o centro da área de3 pré-tratados NaIO distinguida-se por um reflexo característico "metálico" endo-iluminação. A retina marcante deve separar facilmente criar uma bolha visível. Resplendor a agulha com estéril H2O entre coelhos/após utilização para evitar entupimento devido à célula de agulha agrupa. Mudança da agulha quando o entupimento é notada.</li>
		<li>Durante a injeção, lentamente, retirar a agulha mas certifique-se de que a ponta é mantida dentro da bolha para minimizar o refluxo.</li>
		<li>Após a remoção da cânula endoillumation e injeção, remover os trocartes usando pinça de garras e aplique uma leve pressão para 30 s para os sclerotomies de sutura-menos Auto-selante usando a ponta ou extremidade romba da pinça.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Post-surgically dar 10 mL de soro fisiológico por via subcutânea para prevenir a desidratação. Não dê pós-cirúrgica esteroides tópicos ou antibióticos. Para analgésicos dar 0,5 mL de buprenorfina 0,3 mg/ml por via subcutânea após a cirurgia, bem como o dia após a cirurgia.</li>
	<li>Após o uso, lavar todos os instrumentos, mergulhando-os por alguns segundos, em primeiro lugar em etanol a 70%, em segundo lugar em etanol a 45% e por último, em água destilada. Secá-las corretamente com uma toalha de papel.</li>
	<li>Assistir animais até que recupere a consciência suficiente e colocá-los todos solteiros engaiolado. Se for necessário (por exemplo, para fins de imuno-histoquímica), eutanásia em animais por injecção intravenosa de pentobarbital 100 mg/kg.</li>
</ol>3. in Vivo Retinal e apresentam imagem
<ol><li>
Usar um dispositivo de (SD-OCT) a tomografia de coerência óptica domínio espectral com o software que acompanha (consulte a tabela de materiais) para obter transversais b-exames de animais tratados, de acordo com as instruções do fabricante. Para evitar o desfoque de imagem, certifique-se de manter a córnea úmida por lavagem com solução salina tópica cada 30-60 s.
	<ol>
<li>Coloque os animais anestesiados e pupila dilatada (consulte as etapas 1.1 e 2.10) em uma montagem ajustável para obter um caminho desobstruído da fonte de luz de instrumento para a retina de coelho.</li>
		<li>Obter pelo menos 3 exames de OCT com Oftalmoscopia do laser infravermelho-confocal digitalização de simultânea de imagens de referência de reflectância (IR-cSLO) que representa a parte superior, inferior e central da área injetada.</li>
		<li>Obter imagens de fundo pt-rosto com cSLO azul, verde, infravermelho e multicolor laser reflectância (ou seja, várias cores simultâneas do laser), respectivamente.</li>
		<li>Capture imagens de autofluorescência de luz azul (BAF) usando a capacidade de laser de luz azul do dispositivo SD-OCT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li>
<li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li>
<li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li>
<li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22603978">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li>
<li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li>
</ol>

Nenhum dos autores tem interesses concorrentes ou interesses conflitantes.

Neste protocolo, a geração de um modelo de grandes olhos de GA e seu uso pré-clínicos para avaliar hESC-RPE integração na vivo é descrita.
Para tradução de terapias regenerativas para GA e doenças relacionadas para a clínica7, é importante desenvolver e aperfeiçoar métodos que fielmente capturar os métodos clínicos para o transplante e de imagem. O coelho é neste aspecto atraente: tem um olho relativamente grande que permite que a cirurgia intra-ocular e uso de...

Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos pré-clínicos de atrofia geográfica (GA) que permite a avaliação da integração do transplantado hESC-RPE no espaço subretinal. Os métodos descritos em detalhe aqui têm sido utilizados em 3 publicações recentes que demonstram a produção de uma população enriquecida, pura e funcional das células RPE de hESC1, bem como a criação de danos na retina exterior e um fenótipo de GA-como induzida pela subretinal injeção de soluções salinas fisiológicas (i.e., BSS e PBS) ou NaIO3 no coelho olho2,3. Mais demonstrámos que transplantes de suspensão sub retiniana de hESC-RPE formam extensas monocamadas funcionais com capacidade de resgate do fotoreceptor2.
Várias vantagens acompanham o uso do olho de coelho para a geração de um modelo de GA da doença. Em primeiro lugar, o tamanho do olho de coelho, que é de 70% do volume de um olho humano adulto, permite o transplante clinicamente significativa usando uma densidade de celular que é muito menor do que rotineiramente utilizados em olhos pequenos roedores (1.000 células / µ l vs 50.000 células / µ l)4 , 5. em segundo lugar, a cirurgia em roedores é geralmente transscleral através da coroide, que compromete a barreira da retina e potencialmente desencadeia uma resposta inflamatória e uma possível rejeição6. Os dois fatores juntos podem levar a multilayering e aglutinação de células transplantadas e uma integração total pobre das células transplantadas em um tecido retinal nativo perturbado. No entanto, o modelo de grandes olhos coelho permite executar uma técnica cirúrgica com instrumentação idêntica a um ambiente clínico. Em terceiro lugar, um modelo de grandes olhos também permite alta resolução na vivo de imagens e monitoramento de células transplantadas e retina sobrejacente a tempo1,2,3. Assim, descrevemos um modelo pré-clínicos clinicamente relevante e custo-eficiente que deve ser uma alternativa atraente para roedores para qualquer pessoa com interesse em pesquisa de retina normal e doente e o espaço abaixo da retina.

<table><tbody><tr><td>Meio de diferenciação NutriStem hESC XF - bFGF e &ndash; TGFb</td><td>Biological Industries</td><td>06-5100-01-1A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 1x</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS sem Ca2+ e Mg2+</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células 40 &mu; m Nylon</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 30 G 0,5' &rsquo;; 0,3 mm x 13 mm</td><td>BD Microlance</td><td>304827</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm Filtro de seringa</td><td>Acrodisc</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>0,4% azul tripano</td><td>ThermoFisher Scientific Corp</td><td>15250061</td><td>Uso a 0,2%</td></tr> <tr><td>NaIO3</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>S4007</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>65079550</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Solveco AB</td><td>1047</td><td></td></tr><tr><td>Cetaminol, 100 mg / mL</td><td>Intervet, Boxmeer</td><td>511519</td><td>Use 35 mg / kg de cetamina</td></tr><tr><td>Rompun vet, 20 mg / mL</td><td>Bayer Animal Health</td><td>22545</td><td>Use 5 mg / kg de xilazina</td></tr><tr><td>Triescência, 40 mg / mL</td><td>Alcon Nordic A / S</td><td>412915</td><td>2 mg de</td></tr><tr><td>Cyklopentolat-fenilefrina intraviterial, 0,75% + 2,5%</td> <td>APL</td><td>321968</td><td>Use 1 gota em cada olho</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Laboratoires Th&eacute; um</td><td>597562</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tópica</td><td>Apotea AB</td><td>7053249369080</td><td></td></tr><tr><td>Allfatal vet. 100 mg/mL</td><td>Omnidea</td><td>77168</td><td>Use 100 mg/mL pentobarbital</td></tr><tr><td>Tubo de extensão (Hammer)</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3223</td><td></td></tr><tr><td>25 G/38 G cânula sub-retiniana politip</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3219</td><td>25 G/38 G</td></tr><tr><td>Lente plana de uso único</td><td>Volk</td><td></td><td></td>#VWFD10</tr><tr><td>Barraquer Colibri afastador de tampa</td><td>AgnTho's AB</td><td>42-020-030</td><td></td></tr><tr><td>Trocartes não valvulados</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751448</td><td></td></tr><tr><td>Pinça com garras</td><td>Bausch & Máquina de vitrectomia Lomb Nordic AB</td><td>ET1811</td><td></td></tr><tr><td>Alcon Accurus 400VS</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065740238</td><td></td></tr><tr><td>Accurus 25+ Gauge Vitrectomia TotalL Plus Pak</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751493</td><td></td></tr><tr><td>dispositivo SD-OCT</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis HRA+OCT</td><td>Use Heidelberg Eye Explorer versão 1.9.10.0</td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro Neubauer</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>Coelhos albinos da Nova Zelândia</td><td>Lidk&ouml; pings Rabbit Farm, Suécia</td><td></td><td></td></tr><tr>células <td></td><td></td><td>hESC-RPE</td><td>Ver número de referência 1</td></tr><tr><td>Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml</td><td>Dechra</td><td>660500</td><td>Utilizar 0,5 ml de buprenorfina por via subcutânea</td></tr></tbody></table>

subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Atrofia geográfica (GA), a fase tardia do degeneration macular age-related seco é caracterizada por perda de pigmento da retina epitelial (RPE) camada, que leva à subsequente degeneração das estruturas da retina vitais (por exemplo, fotorreceptores) causando deficiência de visão severa. Da mesma forma, RPE-perda e diminuição da acuidade visual é visto no seguimento a longo prazo acima dos pacientes com avançado relacionadas com a idade degeneração macular úmida (AMD) intravitreal tratamento de anti-vascular fator de crescimento endotelial (VEGF). Portanto, por um lado, é fundamental para derivar eficientemente as células RPE de uma fonte ilimitada de que poderia servir como terapia de reposição. Por outro lado, é importante avaliar o comportamento e a integração das células derivadas em um modelo da doença acarrete cirúrgica e métodos de imagem como perto possível aqueles aplicados no corpo humano. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado baseado em nossas publicações anteriores que descreve a geração de um modelo pré-clínicos de GA usando o olho de coelho albino, para avaliação das células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais de pigmento retinal (RPE-hESC) em um configuração de clinicamente relevante. HESC-RPE diferenciado são transplantadas para olhos ingénuos ou olhos com NaIO3-induzido GA-como degeneração da retina usando uma G 25 transvitreal pars plana técnica. Avaliação de áreas degeneradas e transplantadas é realizada pelo multimodal de alta resolução não-invasiva imagens em tempo real.

Representante na vivo imagens da FAB, IR-cSLO e SD-PTU de uma retina de coelho albino normal são mostradas na Figura 2. Observe as diferentes camadas da retina com seus distintos níveis de reflexão da luz capturada pelo instrumento SD-OCT.
Figura 1A e figura 1B, a instalação para criar bolhas sub retiniana é ilustrada: um retractor...

Células epiteliais de pigmento retinal podem servir como uma terapia de reposição celular para a forma avançada de degeneration macular age-related seco. Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica e o subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal embrionárias humanas células-tronco derivadas para este modelo de doença.

Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um modelo animal de atrofia geográfica de olhos grandes para transplantar células epiteliais pigmentares da retina derivadas embrionárias humanas para o olho e avaliar a integração das células doadoras usando tomografia de coerência óptica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina regenerativa, como o tratamento baseado em células-tronco para doenças degenerativas. A principal vantagem desse ambiente cirúrgico é a fonte ilimitada de células saudáveis e o cenário cirúrgico para injeção sub-retiniana, que tem muitas semelhanças com um procedimento destinado ao paciente.As implicações desta técnica se estendem à terapia da degeneração macular relacionada à idade por meio da ostentação de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco embrionárias humanas. Nossa zootecnista, Monica Aronsson, está segurando o coelho em posição para que possamos visualizar e visualizar a retina com tomografia de coerência óptica. Depois de anestesiar um coelho de acordo com o protocolo de texto, coloque-o sob o microscópio cirúrgico com a cabeça voltada para o cirurgião.Em seguida, use um afastador de pálpebra para remover as pálpebras e um pano estéril para remover a membrana nictitans. Para microcirurgia, use uma técnica de pars plana transvítrea de calibre 25 de duas portas ou três portas opcional com trocartes não valvulados para a inserção de instrumentos microcirúrgicos. A máquina de vitrectomia multifuncional possui portas para conectar uma cânula de infusão, endoiluminação, um vitrector e um endolaser.Para injeções sub-retinianas, apenas a endoiluminação é obrigatória, o que torna suficiente uma configuração de duas portas. Usando uma pinça de coágulo para agarrar e deslocar a conjuntiva, sobrepasse o local de inserção. Insira transesclericamente um dos dois trocartes superiores, a um a dois milímetros do limbo, em um ângulo paralelo de limbo de trinta a quarenta e cinco graus.Prossiga para inserir o trocarte no meio da ponta. Em seguida, gire o trocarte noventa graus e avance-o para o olho, visando o pólo posterior. Isso evitará o vazamento pós-cirúrgico dessa esclerotomia e também diminuirá o risco de endoftalmite.Repita com o segundo trocarte superior. Ao inserir o trocarte, é importante estar de um a dois milímetros do limbo para tunelar a inserção e apontar para o pólo posterior para minimizar o risco de infecção, sangramento vítreo, descolamento de retina e toque da lente. Aplique lágrimas sintéticas como um gel de contração na córnea e, em seguida, posicione uma lente de contato plana de uso único na córnea para visualizar a retina.Em seguida, coloque quinhentos microlitros de iodato de sódio em uma seringa de um mililitro conectada a um tubo de extensão operado por um assistente e uma cânula com ponta de polietileno de calibre 38 operada pelo cirurgião. Insira a sonda de endoiluminação através do trocarte superior esquerdo. Em seguida, insira a cânula de injeção através do trocarte superior direito e avance a cânula através do espaço vítreo em direção à retina, visando a área logo abaixo da cabeça do nervo óptico.Permita que a ponta da cânula toque lentamente a retina até que um clareamento focal seja visível. Não deixe a cânula penetrar na retina, pois isso pode causar hemorragia. Agora, penetrando na retina com a agulha, injete cinquenta microlitros de iodato de sódio por via sub-retina durante um período de cinco segundos.Como existe um plano de clivagem natural entre a retina e a coróide subjacente, uma bolha semitransparente claramente visível deve se formar gradualmente durante a injeção. Durante a injeção, retraia lentamente a agulha, mas certifique-se de que a ponta seja mantida dentro da bolha para minimizar o refluxo. Após a remoção da endoiluminação e da cânula de injeção, use uma pinça de coágulo para remover os trocartes.Em seguida, use a ponta, ou a extremidade romba da pinça, para aplicar uma leve pressão por trinta segundos na esclerotomia sem sutura de vedação suave. Durante a recuperação, atender o animal de acordo com o protocolo de texto e aguardar sete dias pelo transplante. Sete dias após a injeção de iodato de sódio e após a administração de triancinolona intravítrea, de acordo com o protocolo de texto, remova o meio de diferenciação celular de uma monocamada de hESC-RPE confluente de vinte e quatro poços e use quinhentos microlitros de PBS sem cálcio e magnésio para lavar cada poço.Depois de tripsinizar as células, incline a placa e remova cuidadosamente a tripsina para permitir que as células permaneçam presas à placa. Colete as células em oitocentos microlitros de meio de diferenciação pré-aquecido fresco de trinta e sete graus Celsius, pipetando suavemente, ou mesmo raspando, se necessário, para obter uma única suspensão celular. Usando zero vírgula dois por cento de azul de tripano, conte as células em uma câmara de hemocitômetro de acordo com as instruções do fabricante.Em seguida, adicionar cinco mililitros de meio de diferenciação à suspensão celular e centrifugar as células a trezentas vezes g, à temperatura ambiente, durante cinco minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em PBS esterilizado por filtro fresco a uma concentração final de mil células por microlitro. Alíquota da suspensão celular anterior em alíquotas de seiscentos microlitros e mantenha-as no gelo até e durante a cirurgia.Após anestesiar o coelho e dilatar as pupilas de acordo com o protocolo de texto, coloque o coelho com a cabeça voltada para o cirurgião. Use o afastador da pálpebra para remover as pálpebras e um pano estéril para remover a membrana nictitans. Para microcirurgia, use uma técnica de pars plana transvítrea de calibre 25 de duas portas ou três portas opcional com trocartes colocados nas mesmas posições demonstradas anteriormente neste vídeo.Se as esclerotomias anteriores forem visíveis, execute a inserção do trocarte apenas adjacente, mas não através desses locais de inserção, para minimizar o risco de vazamento pós-operatório. Aplique lágrimas sintéticas no olho como antes e coloque uma lente de contato plana de uso único sobre a solução na córnea para visualizar a retina. Depois de posicionar adequadamente a ponta e apontar para o centro da área pré-tratada com iodato de sódio, distinguida por um reflexo de endoiluminação metálico característico, injete sub-retinalmente cinquenta microlitros de uma suspensão hESC-RPE suavemente misturada.A retina neurossensorial deve se separar facilmente, criando uma bolha claramente visível. Durante a injeção, retraia lentamente a agulha, mas certifique-se de que a ponta seja mantida dentro da bolha para minimizar o refluxo. Após a remoção da endoiluminação e da cânula de injeção, use uma pinça de coágulo para remover os trocartes e use a extremidade romba da pinça para aplicar uma leve pressão por trinta segundos como antes.Use uma tomografia de coerência óptica de domínio espectral, ou dispositivo SD-OCT, com o software que o acompanha para obter B-scans transversais dos animais tratados, de acordo com as instruções do fabricante. Coloque o animal anestesiado e com dilatação da pupila em uma montagem ajustável para obter um caminho desobstruído da fonte de luz do instrumento até a retina do coelho. Para evitar o desfoque da imagem, mantenha a córnea úmida lavando com solução salina tópica a cada trinta a sessenta segundos.Obtenha pelo menos três varreduras de OCT com oftalmoscopia a laser de varredura confocal infravermelha simultânea ou imagens de referência de refletância SLO confocal representando a parte superior, central e inferior da área injetada. Obtenha várias cores de laser simultâneas de imagens de fundo de olho com SLO confocal azul, verde, infravermelho e refletância de laser multicolorida. Capture imagens de autofluorescência de luz azul usando o recurso de laser de luz azul do dispositivo SD-OCT.Imagens in vivo representativas de BAF, IR-cSLO e SD-OCT de uma retina normal de coelho albino são mostradas aqui. Uma explosão da imagem SD-OCT ilustra as diferentes camadas da retina com seus níveis distintos de reflexão de luz capturados pelo instrumento SD-OCT. Como mostrado nesta imagem SD-OCT, tirada três meses após a injeção de cinquenta microlitros de uma solução milimolar de iodato de sódio, é criada uma bolha que se dissolveu e degenerou progressivamente a retina externa.Pode-se observar afinamento das camadas neurorretinianas mais externas nas áreas SD-OCT e hipo-BAF, correspondendo à perda de EPR, recriando assim um fenótipo semelhante ao GA. Após a identificação da área de dano, cinquenta mil células hESC-RPE foram reinjetadas para transplante, criando uma segunda bolha que se resolveu. Áreas de hiper-BAF leves a moderadas estão presentes com um hiper-BAF focalmente aumentado na fronteira da área de dano, indicativo de estresse crônico do EPR nativo.A bolha correspondente à injeção de hESC-RPE em olhos não pré-tratados mostrando manchas de células pigmentadas na imagem MC e estruturas retinianas bem preservadas na varredura SD-OCT é mostrada para comparação. Dominar este belo método clínico para injeção sub-retiniana facilitará o transplante clínico de tratamento baseado em células para condições, como degeneração macular relacionada à idade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como configurar injeções sub-retinianas em um modelo de tipo de vida, como preparar células derivadas de células-tronco embrionárias humanas para injeções sub-retinianas e como visualizar a integração de células doadoras usando tomografia de coerência óptica.

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