Um microcontrolador operado dispositivo para a geração de extratos líquidos de aerossol de cigarro eletrônico e fumo cigarro convencional

O objetivo geral deste procedimento é gerar extratos líquidos de aerossóis de cigarro eletrônico para uso em ensaios toxicológicos. Este método pode ajudar a responder a perguntas importantes sobre cigarros eletrônicos, como como o aerossol do cigarro eletrônico afeta as células vasculares humanas? A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que o protocolo de fluxo de ar e tempo de sopro seja personalizado por qualquer laboratório individual para atender às suas necessidades específicas de pesquisa.

As implicações dessa técnica se estendem a uma melhor compreensão dos riscos potenciais do uso de cigarros eletrônicos, pois fornece uma plataforma personalizável que pode gerar extratos de aerossóis de cigarros eletrônicos em seu próprio laboratório. Este método pode fornecer informações sobre os riscos dos cigarros eletrônicos. Também pode ser aplicado a outros produtos, como produtos convencionais de tabaco ou produtos de cannabis.

Para começar, prenda um frasco de Buchner de 100 mililitros a um suporte de anel de aço e crie uma armadilha de vácuo enchendo-o com 50 gramas de cloreto de cálcio para servir como dessecante. Em seguida, feche o frasco com uma rolha de borracha. Enrole a junção da rolha com filme de parafina e passe uma pipeta pelo orifício.

Usando tubos de vinil, conecte a pipeta que se estende do topper a um conector de mangueira de interseção em T. Em seguida, use-o para conectar os dois impingers um ao outro e para conectar a saída do segundo impinger ao conector da mangueira de interseção em T. Em seguida, use o tubo de vinil para conectar a porta de entrada do primeiro impinger para servir como uma porta de inalação.

Ligar também a arma lateral do balão de Buchner à porta de entrada de um regulador de fluxo de ar. E conecte a porta de saída do regulador de fluxo de ar a uma bomba de vácuo. Em seguida, coloque uma base rosqueada 510 em uma braçadeira de suporte de anel e use tubos de vinil para conectar a válvula solenóide à extremidade livre do conector da mangueira de interseção em T.

Quando terminar, verifique se todas as juntas estão herméticas e aplique braçadeiras de mangueira e graxa a vácuo conforme necessário. Primeiro, determine a massa de cada cartomizador ou tanque de cigarro eletrônico antes de usá-los, colocando-os em uma balança analítica. A diferença de peso entre pré e pós-uso determinará a dosagem apropriada.

Para cigarros comerciais de pesquisa 3R4F, o teor de nicotina será de 7 miligramas. Para todos os outros cigarros comerciais, o teor de nicotina deve ser determinado por métodos analíticos convencionais. Ao usar o ensaio de viabilidade de células de captação vermelha neutra para análise a jusante, encha o reservatório do impinger primário com 4,3 mililitros de meio de cultura de células endoteliais.

Em seguida, prepare o cigarro eletrônico ou cigarro convencional para extração. Para preparar um cigarro convencional para extração, aplique um pedaço de fita adesiva transparente ao redor do filtro e coloque uma marca facilmente visível onde o papel de cigarro se junta ao filtro. Para preparar um cigarro eletrônico, certifique-se de que a bateria esteja bem carregada e que o cartomizador esteja bem aparafusado à bateria.

Se estiver usando um tanque de cigarro eletrônico, certifique-se de que um volume apropriado de líquido de cigarro eletrônico esteja carregado no tanque e aparafuse o tanque na base rosqueada 510. Para o cigarro convencional, coloque-o na porta de inalação e prenda com uma braçadeira de mangueira. Em seguida, ligue a bomba de vácuo.

Ajuste o medidor de vazão para puxar 1,65 litros por minuto para garantir uma baforada de 55 mililitros em dois segundos. Em seguida, ligue o microcontrolador e use-o para acender o cigarro na primeira tragada. Ligue a bomba até que a concentração desejada projetada seja alcançada.

Para um cigarro eletrônico, comece carregando-o na porta de inalação e prendendo-o com uma braçadeira de mangueira. Tal como acontece com o cigarro convencional, ligue a bomba de vácuo e ajuste o medidor de vazão para puxar 1,65 litros por minuto para garantir uma baforada de 55 mililitros em dois segundos. Opere a bomba até que o volume desejado projetado tenha sido usado.

Em seguida, pare o vácuo e determine a massa pós-uso de cada cartomizador ou tanque de cigarro eletrônico usando uma balança analítica. Compare isso com a massa pré-uso para determinar a massa total consumida. Se uma massa insuficiente foi consumida, devolva o cigarro eletrônico ao dispositivo e execute a extração por mais tempo.

Após cada extração, enxágue a tubulação e os reservatórios do dispositivo com etanol a 70% e água deionizada para evitar o transporte entre as amostras. Em seguida, execute brevemente o dispositivo vazio para permitir que o fluxo de ar ajude na secagem das linhas. Se o extrato for usado para cultura de células, filtre o extrato contendo mídia através de um filtro de seringa de polietersulfona de 0,22 mícron.

Um dia antes de executar o ensaio, semeie células endoteliais da veia umbilical humana em placas de 96 poços a 10.000 células por poço em 100 microlitros de meio de crescimento de células endoteliais. Incube as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2. No dia seguinte, substitua o meio de cultura antigo por 100 microlitros de meio de cultura de células endoteliais frescas para servir como controle ou 100 microlitros de meio de crescimento de células endoteliais contendo 500 micromoles de nicotina consumida para servir como grupo de tratamento.

Sele a placa com um selo de alumínio para manter os poços herméticos e, em seguida, coloque a placa de volta na incubadora por 18 a 24 horas. Muitos dos componentes da fumaça do cigarro e do aerossol do cigarro eletrônico são voláteis, por isso é importante cobrir os poços com uma vedação de alumínio para que os poços fiquem herméticos. Pouco antes de seu uso, dilua uma solução de estoque vermelho neutro 100x 1 a 100 em meio de cultura celular para criar uma solução de coloração vermelha neutra 1x.

Incubar a solução de coloração vermelha neutra a 37 graus Celsius durante pelo menos 30 minutos antes da sua utilização. É normal que alguns cristais precipitem durante a incubação. Para evitar a aplicação desses cristais nos poços de cultura de células, passe a solução por um filtro de 22 mícrons.

Remova o meio de cultura experimental e adicione 100 microlitros da solução de coloração vermelha neutra a cada poço. Use o excesso de mancha para criar pelo menos três poços em branco para quantificação adequada. Incube a placa por duas a quatro horas, depois remova a solução de coloração vermelha neutra e lave as células três vezes por submersão em PBS.

Em seguida, aplique uma solução vermelha neutra para desmanchar e incube a placa por pelo menos dez minutos em temperatura ambiente enquanto agita. Quando terminar, leia a placa com uma absorbância de 540 nanômetros. Dentro de 24 horas após a exposição das células endoteliais da veia umbilical humana ao extrato de fumaça de cigarro convencional ou ao extrato de aerossol de cigarro eletrônico, há uma redução significativa na viabilidade celular.

Além dos estudos de viabilidade celular, os próprios extratos podem ser analisados usando espectrometria de massa por cromatografia gasosa se extraídos em acetona. Usando este método, muitos componentes do extrato podem ser determinados. Não se esqueça de que trabalhar com aerossol ou fumaça pode ser perigoso e que todas as extrações devem ser realizadas em uma capa de segurança química.