Name: Dissecção e cultura de explante de murino alantoide para a análise In Vitro de fixação alantoico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a dissecção e cultura de explante de alantoide murino para análise in vitro da fixação alantoica usando α4β1 integrina imobilizada. Este método modela o primeiro passo crítico na formação da placenta.

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Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (para A.G.).

Reprodução de rato foi aprovada pelo Regierung Unterfranken, e todas as análises foram realizadas em estrita conformidade com todos os alemão e da União Europeia leis e regulamentos aplicáveis relativos ao uso de animais de laboratório e cuidados.
1. revestimento de microtitulação placas com α4β1 integrina para Ex Utero Allantois explante cultura
<ol><li>Reconstitua a liofilizado murino α4β1 integrina a 200 µ g/mL em salina tampão fosfato (PBS). Dilua para uma concentração final de 10 µ g/mL em pré-aquecido (37 ° C) PBS. Pipete 20 µ l/poço da solução diluída α4β1 integrina para o número necessário de poços de uma placa de microtitulação (1 alantoide/poço). Nota: Evite a formação de bolhas de ar quando o revestimento dos poços da placa de microtitulação.</li>
	<li>Incube as placas de microtitulação para 60 min a 37 ° C, colocando-os em uma incubadora de cultura de tecidos umidificado.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. Usar sucção suave e inclinar a placa para evitar tocar bem fundo com a ponta da pipeta. Lavar os poços duas vezes pela adição de 50 µ l de meio de cultura previamente aquecido (37 ° C) como de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) e remover o meio de lavagem por sucção suave.</li>
	<li>Passo fundamental: bloco de ligação grátis sites pela adição de 50 µ l/poço de 0,1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) / DMEM e incube por ≥ 30 min a 37 ° C, colocando as placas de microtitulação numa incubadora umidificado cultura de tecidos. Nota: Explantes alantoide podem anexar várias superfícies na presença de soro. Portanto, é imperativo para bloquear sites de ligação não-específica, após o revestimento dos poços com integrina e antes de adicionar o alantoide dissecado por explantes cultura no soro contendo médio (consulte a etapa 4.4).</li>
	<li>Manter os Poços revestidos na solução de bloqueio a 37 ° C, até que seja necessário na etapa 4.4.</li>
</ol>2. o útero dissecação de um rato grávida na Dpc 8
Nota: Reduza taxas de falso-positivo de gravidez, de discriminação de ganho de peso15.
<ol><li>Sacrifica o mouse por deslocamento cervical. Desinfecte o casaco na região abdominal por pulverização com etanol a 70% (v/v). Nota: Utilize luvas quando manusear os ratos. Eutanásia por deslocamento cervical sem anestésicos impede a contaminação química do alantoide, que pode interferir com o acessório de alantoide.</li>
	<li>Abra a pele abdominal, fazendo uma pequena incisão na linha com uma tesoura. Use os dedos com luvas para manter a pele acima e abaixo da incisão e separar a pele em direção ao peito e a cauda do rato.</li>
	<li>Agarre o peritônio com fórceps. Com a outra mão, faça uma incisão em forma de V de anterior para posterior usando a tesoura e mover o tecido para expor na cavidade abdominal. Use a pinça para empurrar os intestinos de um lado para obter acesso ao útero.</li>
	<li>Localize os dois cornos uterinos. Segure o colo do útero (o segmento caudal) com fórceps e corte os ligamentos com uma tesoura bem. Então retire ambos os cornos uterinos por separando os ovidutos com uma tesoura.</li>
	<li>Usar fórceps para transferir o útero em um prato de 10cm estéril contendo estéril, temperatura (RT) PBS. Remova o tecido adiposo, vasos e nervos que cercam os cornos uterinos com pinça fina e/ou tesoura (figura 1A).</li>
</ol>3. embrião dissecação
Nota: Execute as seguintes etapas sob um microscópio estereoscópico equipado com uma gama de zoom de 8:1.
<ol><li>Separe os embriões por corte entre os locais de implantação com uma tesoura. Segure o revestimento do útero muscular dos brotos útero com pinça e puxá-lo distante para expor a decídua (figura 1B).</li>
	<li>Usando fórceps, transferi os gomos do útero para uma nova placa de 10 cm contendo estéril, RT PBS.</li>
	<li>Corrigi a decidua em torno do embrião com as pontas da pinça.</li>
	<li>Fazer uma incisão no lado anti-mesometrial da decidua com pinça fina (Figura 1) e descascar a decidua com fórceps para expor o embrião (Figura 1). Nota: O polo mesometrial da decidua é altamente vascularizado e pode ser mais largo na base que a parte de anti-mesometrial, que contém o embrião e aparece mais pálida.</li>
	<li>Disse o embrião com pinça (Figura 1E, F).</li>
	<li>Usando uma microcolher, transferi o embrião para uma gota de PBS estéril contido em um prato de estéril de 3,5 cm.</li>
	<li>Transferir o embrião para uma gota fresca de PBS no mesmo prato 3,5 cm usando uma microcolher e dissecar o embrião do saco vitelino usando fórceps (Figura 1, H).</li>
	<li>Opcionalmente, se necessário (por exemplo, para a genotipagem por reação em cadeia da polimerase), transferir o saco vitelino em um tubo estéril aspirando com ~ 5 µ l PBS em uma ponta da pipeta orifício grande 200 µ l. Loja a-20 ° C. Nota: Tecido materno (ou seja, o saco vitelino parietal, incluindo a membrana do Reichert e o cone de ectoplacental) que possam contaminar a preparação do saco vitelino pode levar a resultados errôneos de genotipagem. Remoção desses tecidos é mais fácil antes a dissecação do embrião do saco vitelino.</li>
</ol>4. o alantoide dissecção e cultura Ex Utero no imobilizado α4β1 integrina
<ol><li>Corte o alantoide do seu local de inserção basal na extremidade posterior do embrião usando pinça fina (Figura 1 H).</li>
	<li>Opcionalmente, se a plataforma do desenvolvimento é necessária, conta os pares somite do embrião por inspeção visual, usando um microscópio equipado com ótica de contraste de fase e um 5 × 10 × objetivo. Nota: O embrião pode ser estendido com fórceps para facilitar a contagem do somite. Fusão e apego corioalantoicas ocorrem entre E 8.0 e 9.0 E em embriões com pares de 6 somite ≥. Giro começa em embriões com 6-8 pares de somite.</li>
	<li>Pipeta de 40 µ l/poço de DMEM suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino, L-glutamina e antibióticos no número necessário de poços de placa do microtiter pré-revestida (ver seção 1).</li>
	<li>Recolher o alantoide flutuante aspirando com ~ 5 µ l PBS, em um grande orifício de uma ponta de pipeta de 200 µ l. Transferi 1 alantoide/bem.</li>
	<li>Incubar as allantoides colocando as placas de microtitulação numa incubadora de cultura de tecidos umidificado (37 ° C, 5% CO2) para , por exemplo, 6, 12 e 24 h. Para evitar interferência com o acessório de alantoide, não mova as placas de microtitulação entre esses pontos de tempo.</li>
	<li>Em cada ponto do tempo, marcar acessório alantoide (por exemplo, nenhum acessório/flutuante alantoide alantoide parcialmente ou totalmente anexada; totalmente propagação alantoide) usando um microscópio equipado com ótica de contraste contraste ou diferencial do interferência fase e um × 5 ou 10 × objectivo (Figura 2). Nota: Exemplos representativos de allantoides recém isoladas e totalmente anexadas são mostrados na Figura 2. Ex utero, ponta distal do allantoides isolados de camundongos C57BL/6J de sua anexa dentro de 4-6 h (isto é referido como penhora parcial da alantoide), e acessório completo do alantoide inteira é alcançado dentro de ~ 12 h de cultura. Por 18-24 h, o explante tem aplainado e assumiu uma forma circular (referida para como totalmente espalhar alantoide) com um CD31 positivo do plexo vascular9,16.</li>
</ol>5. confirmação dos coloração o alantoide explantado para o CD31 marcador de células endoteliais
<ol><li>Aspire o meio de cultura de explantes de propagação totalmente e corrigir as células adicionando 40 µ l/poço de 4% (p/v) paraformaldeído/PBS. Nota: Paraformaldehyde é tóxico. Use luvas e óculos de segurança para evitar o contato de olho e pele.</li>
	<li>Incubar durante 10 minutos a RT e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Lavar três vezes com a adição de 40 µ l/poço de PBS e remover o meio de lavagem por sucção suave.</li>
	<li>Permeabilize as células e bloquear sites inespecificas adicionando 40 µ l/poço de 0,1% (v/v) de soro de cabra normal BSA/10% Triton X-100/0.1% (w/v) (v/v) em PBS por 30 min em RT. Wash duas vezes adicionando 40 µ l/poço de PBS e remover o meio de lavagem por sucção suave. Nota: O protocolo pode ser pausado a noite neste ponto.</li>
	<li>Mancha de células, adicionando 20 µ l/poço de anticorpos anti-CD31 primário diluído 01:50 em 0,1% (p/v) BSA/PBS durante a noite a 4 ° C. Lavar três vezes com a adição de 40 µ l/poço de PBS e remover o meio de lavagem por sucção suave.</li>
	<li>Detecta anticorpos primários ligados pela adição de 20 µ l/poço de cabra secundário fluorescente etiquetado anticorpos anti-rato diluído 1: 200 em 0,1% (p/v) BSA/PBS por 1h em placas de microtitulação RT. Protect da luz por envolvimento em papel de alumínio ou colocando em uma câmara escura. Lavar três vezes com a adição de 40 µ l/poço de PBS e remover o meio de lavagem por sucção suave.</li>
	<li>Inserir células, adicionando 20 µ l/poço de meio de montagem. Encube por ~ 1h no RT até o meio de montagem tem solidificado. Armazenar placas de microtitulação no RT ou a 4 ° C, protegido da luz.</li>
	<li>Imagem do plexo vascular do alantoide explants sob um microscópio de fluorescência, equipado com um × 5 ou 10 × objetivo e filtros de fluorescência apropriado. Nota: Imagens representativas do plexo vascular CD31 positivo de uma totalmente propagação alantoide são mostradas na Figura 3. Outros marcadores para o plexo vascular, tais como anticorpos dirigidos contra Flk-1, Flt, gravata-1 ou Tie-2 pode ser usado como bem16.</li>
</ol>

<ol><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Segerer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+developmental+function+for+murine+phosphoglycolate+phosphatase+in+safeguarding+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation.</a> Sci Rep. 6, 35160(2016).</li>
<li>Kane, S. V., Acquah, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+transport+of+immunoglobulins%3A+a+clinical+review+for+gastroenterologists+who+prescribe+therapeutic+monoclonal+antibodies+to+women+during+conception+and+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy.</a> Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).</li>
<li>Xu, X., Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+absorption%2C+distribution%2C+metabolism%2C+and+excretion+studies+of+therapeutic+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics.</a> AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).</li>
<li>Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origins+of+NAFLD%3A+a+womb+with+a+clue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).</li>
<li>Racicot, K., Mor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+viral+infections+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Risks associated with viral infections during pregnancy.</a> J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).</li>
<li>Grandjean, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life-Long+Implications+of+Developmental+Exposure+to+Environmental+Stressors%3A+New+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives.</a> Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).</li>
<li>Inman, K. E., Downs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+allantois%3A+emerging+paradigms+in+development+of+the+mammalian+umbilical+cord+and+its+relation+to+the+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus.</a> Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).</li>
<li>Arora, R., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+allantois%3A+a+model+system+for+the+study+of+blood+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation.</a> Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).</li>
<li>Watson, E. D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structures+and+transport+functions+in+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Development of structures and transport functions in the mouse placenta.</a> Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).</li>
<li>Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+events+mediated+by+alpha+4+integrins+are+essential+in+placental+and+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development.</a> Development. 121 (2), 549-560 (1995).</li>
<li>Gurtner, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+murine+VCAM1+gene%3A+essential+role+of+VCAM-1+in+chorioallantoic+fusion+and+placentation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation.</a> Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).</li>
<li>Kwee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+development+of+the+embryonic+and+extraembryonic+circulatory+systems+in+vascular+cell+adhesion+molecule+%28VCAM-1%29+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice.</a> Development. 121 (2), 489-503 (1995).</li>
<li>Downs, K. M., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+into+early+placental+ontogeny%3A+allantoic+attachment+to+the+chorion+is+selective+and+developmentally+regulated%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated.</a> Development. 121 (2), 407-416 (1995).</li>
<li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).</li>
<li>Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+murine+allantois+by+allantoic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Study of the murine allantois by allantoic explants.</a> Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).</li>
<li>Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+pre-placental+tissues+reveals+that+the+allantois+is+required+for+maintained+expression+of+Gcm1+and+Tpbpalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha.</a> Placenta. 47, 12-23 (2016).</li>
<li>Zeigler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allantois+and+chorion%2C+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion%2C+have+hematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li>
<li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17671451">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Na presença de soro, que é uma fonte rica de moléculas pro-adesivo da matriz extracelular como a fibronectina, explantes alantoide prontamente irão anexar vários plástico, vidro ou superfícies de filtro9,16. Assim, se o objectivo do ensaio realizado é especificamente investigar o efeito de uma modificação genética ou qualquer outro tratamento no acessório alantoide para imobilizado α4β1, é fundamental para bloquear sites de ligação não-específica (por exemplo...

A placenta é indispensável para o crescimento embrionário e desenvolvimento no ambiente uterino. Constitui a interface para o oxigênio, metabólito e troca de nutrientes entre a circulação fetal e materna e também funções como órgão endócrino e imunológico. Qualquer insulto endógeno ou exógeno que prejudica o desenvolvimento da placenta pode levar a retardo de crescimento intra-uterino, perda fetal ou complicações na gravidez, tanto em ratos e em seres humanos1. Enquanto o número de mutações específicas do mouse que causam fisiologia placentária anormal continua a aumentar2, com 219 genótipos atualmente listados no site da informática do genoma do rato (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), muitos destes fenótipos não são bem compreendidos, do ponto de vista mecanicista. Além de alterações genéticas, drogas pequena molécula, anticorpos monoclonais, toxinas, agentes patogénicos, metabolitos em excesso ou vários agentes ambientais podem afetar desenvolvimento de placenta e função3,4,5 , 6 , 7. ainda, simples em vitro ensaios que passos críticos do modelo em desenvolvimento de placenta são escassos.
Desenvolvimento placentário murino é iniciado no início midgestation, quando o alantoide (o precursor do desenvolvimento do cordão umbilical) emerge da extremidade posterior do embrião como um broto que cresce em direção do córion8. Chorioadhesive células na camada exterior do bud alantoico mediam o apego e a difusão do alantoide na superfície do cório (corioalantoicas "fusão"). O córion dobra-se posteriormente em vilosidades no qual vasculatura do alantoide cresce para formar o labirinto, a camada interna da placenta onde nutrientes e oxigênio são trocados entre o sangue materno intimamente justapostos sinusoides e vasos embrionários9 ,10.
O anexo do alantoide para córion é o passo inicial e fundamental na formação do labirinto, e defeitos neste processo estão entre as causas mais comuns de letalidade embrionária em midgestation1. Embora um número de mutantes de rato tem sido descrito onde corioalantoicas ceda a ocorrer10, e o banco de dados do MGI atualmente lista 108 mutantes de rato que caracterizam-se por fusão corioalantoicas anormal (http:// www.Informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), a interação intercelular entre as células vasculares adesão molécula-1 (VCAM-1, expressado na mesoderme alantoico) e α4β1 integrina (expressado no mesotélio gonadotrofina coriônica, que é derivado do mesoderma extraembryonic) parece ser indispensável para a ligação corioalantoicas e fusão11,12,13. Coloração imuno-histoquímica de todo-monte selvagem-tipo embriões tem mostrado que o VCAM-1 é expresso dentro os dois terços distais do caule alantoico no dia aproximadamente embrionário (E) 7,513 (palco do somite 1-4), e que sua expressão permanece elevada durante corioalantoicas anexo e - fusão11,12. Falha de alantoico apego ao córion normalmente é detectada por análise histológica de botões do útero. No entanto, alantoide tamanhos são fisiologicamente altamente variáveis entre e mesmo dentro de ninhadas do mesmo grau de desenvolvimento14, e o alantoide só pode anexar o córion quando atingiu um tamanho suficiente para fazer contato físico. Reflectindo esta variabilidade natural, anexo corioalantoicas ocorre em algum momento entre ~ E 8.0 E 9.0 e no uteroe uma avaliação estatisticamente confiável deste processo pela histologia depende, portanto, a análise de um grande número de conceptuses para obter suficiente amostras na fase do desenvolvimento apropriado.
Aqui, descrevemos um método para avaliar fixação alantoico ex utero que é menos dependente do tamanho do alantoide. Demonstramos a dissecação de embriões do rato e seus allantoides desde o útero de ratos grávidas ~ 8 dias post coitum (dpc; dpc 0.5 designa a detecção de um tampão vaginal), e a cultura subsequente do alantoide explants na α4β1 imobilizado integrinas. Este método permite uma avaliação rápida, funcional de acessório e espalhando o comportamento de vários explantes alantoide em paralelo e em pontos diferentes de tempo sucessivos. O protocolo pode ser usado para tela para efeitos de diversos fatores ambientais, drogas ou mutações específicas no alantoide acessório ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Camundongos selvagens C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No:&nbsp; </td><td></td>000664</tr><tr><td>70 % (v/v) Etanol</td><td>VWR International</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>Pinça padrão</td><td>padrão Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Pinça utilizada para abrir a cavidade abdominal.</td></tr><tr><td>Pinça de micro dissecação</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 forceptos de biologia médica com ponta fina e afiada.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura fina&nbsp;</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>14094-11</td><td>Lâminas retas.</td></tr><tr><td>Tesoura de mola&nbsp;</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>15012-12</td><td>Tesoura de mola Noyes com lâminas de 14 mm para a dissecção de brotos uterinos.</td></tr><tr><td>Microspoon</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Diâmetro da colher.</td></tr><tr><td>Placas de microtitulação</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>Usamos lâminas de angiogênese não revestidas e estéreis (volume interno 50 &micro; L) com uma superfície hidrofóbica que não é tratada com cultura de tecidos para reduzir não-&# 945; 4&#946; Ligação mediada por 1 ao plástico.</td></tr><tr><td>Placa de 10 cm</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Placas de cultura de tecidos estéreis.</td></tr><tr><td>Placa de 3,5 cm</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>Placas de cultura de tecidos estéreis.</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de orifício grande</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Pontas de pipeta de baixa ligação, 200 &micro;L.</td></tr><tr><td>&#945; 4&#946; 1 integrina</td><td>R& D Systems</td><td>6054-A4</td><td>Murine &#945; 4&#946; 1 integrina expressa recombinantemente e purificada a partir de uma linhagem celular de ovário de hamster chinês.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>sem Ca2+ e Mg2+.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Meio de Águia Modificado (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>A formulação contém 4,5 g/L de glicose, 110 mg/L de piruvato de sódio e 3,7 g/L de NaHCO3 mas nenhuma L-glutamina, que é adicionada separadamente.</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10,000 U/mL Penicilina e 10,000 &micro; g/mL de estreptomicina). Preparar e armazenar alíquotas a -20 °; C para evitar congelamento/descongelamento.</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Solução estoque. Preparar e armazenar alíquotas a -20 °; C para evitar congelamento/descongelamento.</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>Usamos FBS inativado por calor (aquecido a 56 &graus; C por 30 min com mistura para inativar o complemento).</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Usamos albumina livre de protease e ácidos graxos. Preparar uma solução a 0,1 % (p/v) em DMEM. Filtrar a solução através de um filtro de cultura celular descartável com um 0,22 &micro; m tamanho dos poros e membrana de baixa ligação às proteínas, e armazenar alíquotas a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>para-formaldeído</td><td>Carl</td><td>Roth 0335.2</td><td>Para fazer uma solução de formaldeído em PBS, pesar para-formaldeído em pó em um exaustor ventilado e adicioná-lo ao PBS pré-aquecido a cerca de 60 &graus; C em um béquer em uma placa de agitação. Adicione 1 N NaOH gota a gota até que a solução desapareça. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente e filtre através de uma seringa de filtro de 0,22 mm. Ajuste o pH com HCl diluído para cerca de 6,9 e ajuste para o volume final com PBS. Nós alíquotas e congelamos a solução, mas ela também pode ser armazenada a 4 & C por aproximadamente quatro semanas.&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Use pontas de pipeta de orifício largo para manusear o Triton X-100 não diluído.</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>Para bloquear a ligação inespecífica de anticorpos em análises de imunofluorescência.</td></tr><tr><td>&#945;-CD31 Anticorpos</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>Anticorpos monoclonais de rato purificados contra camundongos, clone MEC 13.3.</td></tr><tr><td>Anticorpos secundários anti-rato de cabra</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>IgG anti-rato de cabra (cadeias pesadas e leves), adsorvidos cruzados, marcados com fluorescência com Alexa Fluor 488. Outras etiquetas fluorescentes também são possíveis.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Meio de montagem para citoquímica. MW ~ 31.000</td></tr><tr><td>Labovert&nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&nbsp;</td><td>Microscópio de contraste de fase invertida equipado com uma objetiva de 4 x e 10 x para contagem de pares de somitos. Outros microscópios de contraste de fase (como os que são usados rotineiramente na cultura de tecidos) também são adequados. &nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Estereomicroscópio M80 da Leica Microsystems</td><td></td><td>com faixa de zoom de 8 : 1 (produzindo uma ampliação entre 7,5 x e 60 x) para dissecção de embriões e alantóides.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>sistema de microscópio para histologia com iluminação LED. Usamos objetivas HCX PL FLUOTAR 5 x/0,15 e HC PL FLUOTAR 10 x/0,30. Outros microscópios equipados com contraste de fase e óptica de fluorescência podem ser usados para pontuar a fixação do alantóide.&nbsp;</td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>3-CCD câmera de captura digital anexada ao microscópio LED DM4000B. Usamos o software Diskus (Hilgers) para operar o microscópio e a câmera.</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Microscópio confocal para imagens de alta resolução do endotélio no plexo vascular de explantes alantóides. As imagens de imunofluorescência foram obtidas com uma objetiva de 40 x.</td></tr></tbody></table>

dissecção e cultura de explante de murino alantoide para a análise in vitro de fixação alantoico

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

A placenta é essencial para o crescimento e o desenvolvimento de embriões de mamíferos. Por este motivo, inúmeras alterações genéticas e insultos ambientais também prováveis que perturbam o desenvolvimento da placenta ou função podem causar perda de gravidez precoce em ratos e seres humanos. No entanto, simples em vitro ensaios para a tela para potenciais efeitos sobre a formação da placenta são escassos. Aqui, focalizamos o primeiro e fundamental passo na formação da placenta, que consiste de penhora do alantoide com o cório de modelagem. Nós descrevemos um método para avaliar rapidamente o acessório de explantes alantoico na imobilizado α4β1 integrina, que serve como substrato cório-mimética. Esta abordagem in vitro permite uma avaliação qualitativa do acessório e espalhando o comportamento de vários explantes alantoide em pontos diferentes vez consecutiva. O protocolo pode ser usado para investigar o efeito de mutações específicas do mouse, drogas ou vários fatores ambientais que têm sido associados a complicações na gravidez ou perda fetal no alantoide acessório ex vivo.

Este protocolo descreve um método para isolar e explantes murino allantoides ex vivoe detalha a avaliação qualitativa do alantoide penhora a α4β1 integrina, um processo crítico durante na vivo corioalantoicas fusão. Os representante resultados mostrados na figura 1A–H demonstram as etapas sucessivas de isolamento alantoide a partir do útero gestante. Tecidos maternos que cercam os cornos uterinos, tais como ...

Descrevemos um ensaio em vitro de fixação corioalantoicas de modelo, o primeiro passo na formação da placenta. O protocolo demonstra a cultura de dissecção e explante de murino allantoides em imobilizado α4β1 integrina. Acessório de alantoide é avaliado microscopicamente em pontos de tempo pré-determinado.

Dissecção e cultura de explante de murino alantoide para a análise In Vitro de fixação alantoico

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

O objetivo geral deste procedimento é a dissecação e cultura de explante de alantóides murinos para a análise da ligação alantóide in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento embrionário de mamíferos, como o controle da fixação alantóide para a formação da placenta. A principal vantagem dessa técnica é que ela modela o primeiro e crítico passo na formação da placenta in vitro.Demonstrando o procedimento estará Kerstin Hadamek, uma técnica do meu laboratório. Para montar as placas, primeiro adicione 20 microlitros de solução de integrina Alpha 4 / Beta 1 recém-feita em cada poço. Planeje um alantóide por poço.Não deposite nenhuma solução com bolhas de ar, pois isso impedirá o revestimento adequado. Depois de carregar os poços, incube a placa por uma hora em uma incubadora umidificada. Após a incubação, aspire o sobrenadante dos poços enquanto segura a placa em uma inclinação, para que a pipeta possa sugar suavemente a solução sem tocar no fundo do poço.Em seguida, lave os poços duas vezes usando 50 microlitros de meio de cultura quente. Ao remover o meio de lavagem, use sucção suave. Aplique 50 microlitros de solução em bloco em cada po

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Cultura de órgão embrionário de pulmão é um sistema muito útil para estudar interações epitélio-mesenquimais. Ambos epiteliais e mesenquimais procede morfogênese em condições específicas que podem ser facilmente manipulados neste sistema.

Cultura do mouse pulmão embrionário, um sistema para avaliar os mecanismos moleculares de Ramificação

O mesênquima craniana sofre movimentos morfogênicos dramáticas que provavelmente fornece uma força motriz para a elevação das pregas...

Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

Cultura celular primária é uma técnica útil para a análise de populações específicas de células, principalmente a partir de embriões de camundongos transgênicos em estágios de desenvolvimento específicos. Nisto, os ventrículos embrionárias são dissecados e dissociados, e os grânulos de anticorpos conjugados reconhecer e separar as células endoteliais para análise posterior.

Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais

Apresenta-se um ensaio de migração de células ex vivo que permite a quantificação precisa do potencial de migração de células de crista neural entérico na presença de vários factores de crescimento.

Um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas

Descrevemos a dissecção e ex vivo cultura de rato pele embrionária. O sistema mantém uma cultura de interface ar-líquido através da superfície do tecido e permite imagens em um microscópio invertido. Melanoblastos, um componente da pele em desenvolvimento, são marcadas por fluorescência, permitindo o seu comportamento a ser observada por meio de microscopia confocal.

Ex vivo Cultura do Rato Embryonic pele e Live-imaging de Migração melanoblasto

A tecnologia de imagem aprimorada está permitindo imagens tridimensionais de órgãos durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos todo um sistema de cultura de órgãos que permite imagens ao vivo das vilosidades em desenvolvimento no intestino fetal de camundongo.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para Ex Vivo Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

A cultura de gotículas verticais ex vivo é uma alternativa às técnicas experimentais atuais in vitro e in vivo. Este protocolo é fácil de executar e requer quantidades menores de reagente, ao mesmo tempo em que permite a capacidade de manipular e estudar a vascularização, morfogênese e organogênese fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

Um método simples para estabelecer placentária primária humana (vilosidades) e culturas de órgãos deciduais é descrito. culturas de órgãos vilosidades e deciduais são ferramentas inestimáveis ​​para estudar patogenia na interface materno-fetal humano. A infecção com a bactéria intracelular Listeria monocytogenes facultativos é demonstrada.

Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação.

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Este protocolo descreve o uso culto Aorta-gônada-Mesonephros para análises de expressão, unidades formadoras de colônia, na cultura e baço e reconstituição de longo prazo para determinar o efeito de fatores regulatórios e vias de sinalização no tronco hematopoiético desenvolvimento da célula. Isto foi demonstrado como um sistema eficaz para estudar a função e biologia de células-tronco hematopoiéticas.

Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento

Aprenda a dissecção e cultura de explante de alantoide murino para análise in vitro da fixação alantoica usando α4β1 integrina imobilizada. Este método modela o primeiro passo crítico na formação da placenta.

Dissecção e cultura de explante de murino alantoide para a análise In Vitro de fixação alantoico

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