Simultânea distinção de monoespecíficos e DFS70 mistos padrões durante exibição de ANA com um substrato de romance nocaute ELITE/DFS70 HEp-2

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um ensaio imunofluorescente indireto aprimorado que usa um novo HEp-2, substrato nocaute 70 denso e fino salpicado para rastrear autoanticorpos antinucleares e, simultaneamente, confirmar padrões monoespecíficos e mistos densos e salpicados finos 70. O novo substrato HEp-2 usa um procedimento padrão de imunofluorescência indireta e critérios de interpretação para triagem de anticorpos antinucleares clinicamente relevantes, também conhecidos como ANAs. A principal vantagem é a capacidade de distinguir o padrão 70 pontilhado fino denso de padrões associados a doenças, salpicados homogêneos ou mistos desafiadores na etapa de triagem.

Demonstrando o procedimento estará Sofia Badanin, técnica do nosso laboratório de controle de qualidade. Para lâminas de substrato, use lâminas de vidro com 12 poços em cada lâmina, contendo as células HEp-2 convencionais ou uma mistura de 70 células HEp-2 nocauteadas convencionais e densas e finas. Deixe as bolsas contendo as lâminas de substrato se equilibrarem à temperatura ambiente para um desempenho ideal e para evitar a condensação de umidade na superfície da lâmina antes da adição da amostra.

Isso deve levar entre 10 e 15 minutos. Uma vez equilibrado à temperatura ambiente, remova cuidadosamente as lâminas do substrato com os dedos, evitando o contato entre as lâminas e as laterais da bolsa. Rotule as lâminas e coloque-as em uma câmara de incubação forrada com toalhas de papel umedecidas para evitar o ressecamento das lâminas durante a incubação da amostra e conjugação.

Dispense aproximadamente 50 microlitros dos controles negativos e positivos, bem como os soros diluídos do paciente em poços de lâminas individuais antes de colocar as lâminas na câmara de incubação. O teste FAN é o primeiro passo na triagem de uma doença autoimune. É fundamental que a contaminação cruzada de amostras de pacientes na lâmina seja evitada para minimizar resultados falsos positivos ou falsos negativos.

Para evitar a contaminação cruzada do poço, evite encher demais os poços. Coloque a tampa na câmara de incubação e incube as lâminas por 30 minutos em temperatura ambiente. Se houver algum FAN presente no soro do paciente, ele se ligará às células presentes em cada vontade durante esse período.

Terminado o período de incubação, remova a lâmina da câmara de incubação. Segure a lâmina na extremidade da aba e enxágue suavemente por 10 a 15 segundos com aproximadamente 10 mililitros do tampão de lavagem salina tampolado com fosfato reconstituído. Transfira a lâmina imediatamente para um frasco Coplin com tampão de lavagem PBS e deixe de molho por 10 minutos.

Repita o processo com todos os slides restantes. Remova apenas uma lâmina de cada vez do frasco Coplin. Para remover o excesso de tampão de lavagem PBS da lâmina, bata suavemente ou seque a lâmina em uma toalha de papel.

Em cada poço, aplique suavemente uma gota de isotiocianato de fluoresceína, conjugado fluorescente anti-IgG humano marcado. Em seguida, incubar as lâminas na câmara de incubação de coloração fechada durante 30 minutos. Terminado o período de incubação, remova a lâmina da câmara de incubação.

Segure a corrediça na extremidade da aba e enxágue suavemente como antes, com aproximadamente 10 mililitros de tampão de lavagem PBS. Transfira a lâmina imediatamente para um frasco Coplin com tampão de lavagem PBS e deixe de molho por 10 minutos. Coloque as lamínulas fornecidas no kit sobre uma toalha de papel seca.

Na borda inferior da lamínula, aplique entre 3 e 4 gotas da mídia de montagem em uma linha. Em seguida, retire uma lâmina de cada vez do frasco Coplin contendo o tampão de lavagem. Para remover o excesso de tampão de lavagem, bata suavemente ou seque a lâmina na toalha de papel.

Evite deixar uma quantidade excessiva de tampão de lavagem na lâmina, aplicar muita pressão na lamínula ou introduzir bolhas de ar. Tudo isso pode afetar a morfologia celular, os padrões fluorescentes resultantes e a intensidade das reações. Abaixe a corrediça suavemente sobre a lamínula, colocando a borda inferior da corrediça na borda da lamínula.

Isso permite que o meio de montagem presente na lamínula flua para a borda superior da lâmina e minimiza a formação de bolhas de ar, que podem interferir na leitura de cada poço. Visualize as lâminas com um microscópio fluorescente, usando um conjunto de filtros de isotiocianato de fluoresceína localizado em uma câmara escura. Examine a amostra quanto à fluorescência verde brilhante específica ao microscópio com uma ampliação de 200 vezes ou mais para fazer a interpretação final sobre positividade e padrão.

Observe os controles positivo e negativo. O controle positivo exibirá fluorescência verde brilhante no núcleo. O controle negativo não exibirá fluorescência verde específica sob um microscópio de fluorescência.

Registre o resultado positivo ou negativo para cada poço e inclua o padrão ANA para casos positivos. O substrato nocaute HEp-2 denso e fino salpicado de 70 preserva todos os principais padrões nucleares e citoplasmáticos. O padrão pontilhado fino denso é caracterizado pela presença de coloração salpicada uniformemente distribuída em todo o núcleo interfásico e cromatina na fase mitótica.

A presença de células HEp-2 convencionais que expressam o antígeno 70 pontilhado fino denso e as células HEp-2 projetadas desprovidas do antígeno facilita a distinção precisa do padrão 70 pontilhado fino denso, mantendo todas as vantagens dos substratos HEp-2 convencionais. Os soros positivos para os principais padrões de FAN associados à doença foram misturados com um soro denso fino salpicado 70 padrão positivo em proporções iguais e testados em HEp-2 convencional e HEp-2 denso fino salpicado 70 knockout substratos. Aqui, as setas vermelhas indicam células na fase mitótica.

As setas amarelas indicam os núcleos HEp-2 convencionais e as setas azuis indicam os núcleos HEp-2 projetados. Para todas as combinações de reações representadas, o substrato nocaute 70 pontilhado fino e denso mostra uma clara diferença de intensidade entre as células não modificadas e as células modificadas no mesmo campo de visão. Isso ajuda a distinguir reações 70 monoespecíficas e mistas densas e salpicadas finas.

Os autoanticorpos contra antígenos nucleares e citoplasmáticos são altamente prevalentes em doenças autoimunes sistêmicas. O padrão pontilhado fino denso resultante de autoanticorpos contra DFS70, também conhecido como proteína PSIP1, foi relatado como altamente prevalente em populações saudáveis. Além disso, esses autoanticorpos DFS70 ocorrem tanto isoladamente quanto com outros ANAs associados à doença.

Isso torna fundamental para os laboratórios clínicos distinguir com precisão esse padrão de outros padrões associados a doenças. Por exemplo, em um padrão salpicado homogêneo misto, que está associado ao lúpus, pode ser mal interpretado como padrão DFS70 que necessita de vários ensaios confirmatórios. O método de imunofluorescência indireta usando substratos HEp-2 é considerado o método de triagem padrão-ouro para ANAs.

No entanto, a precisão é altamente dependente da habilidade do técnico, da execução cuidadosa das etapas individuais e da interpretação precisa dos padrões resultantes. Por outro lado, a avaliação comparativa de substratos nocaute convencionais para HEp-2 e DFS70 demonstra a utilidade desse novo substrato na distinção do padrão DFS70 com alta confiança, durante a triagem de ANAs. A interpretação adicional dos padrões DFS70 monopositivos e mistos foi relativamente simplificada usando este substrato HEp-2 aprimorado.

O novo substrato usa um protocolo padrão de imunofluorescência indireta e critérios de interpretação estabelecidos para todos os padrões de FAN clinicamente relevantes.