Usando CRISPR/Cas9 Gene edição para investigar a atividade oncogênica do mutante Calreticulin em células hematopoiéticas dependentes de Cytokine

O objetivo geral deste experimento é utilizar a edição de genes CRISPR/Cas9 para modelar mutações de calreticulina em células hematopoiéticas dependentes de citocinas, a fim de estudar sua atividade oncogênica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das malignidades hematológicas, como a função biológica das mutações condutoras quando elas são expressas em níveis fisiológicos. A principal vantagem dessa técnica é que ela utiliza o sistema de edição de genes CRISPR/Cas9 para modelar e estudar a função biológica dos genes envolvidos no câncer.

Para recozer e fosforilar os oligos, adicione os reagentes a um total de 10 microlitros em um tubo de PCR mantido em gelo. Defina o programa no termociclador. Use água para diluir a reação após a conclusão do ciclo.

Para digerir o vetor lentiGuide-Puro, prepare 50 microlitros de reação do digestor. Em seguida, inicie a reação de digestão a 55 graus Celsius em um bloco de calor. Após uma hora, adicione um microlitro adicional de enzima de restrição BsmB1 e continue a reação por mais uma hora.

Para desfosforilar o osso cortado, adicione sete microlitros de tampão de reação de fosfatase e dois microlitros de enzima fosfatase ao vetor digestivo. Em seguida, incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos. Purifique o osso dorsal já cortado e desfosfilado usando um kit comercial.

Para preparar a mistura de ligação, adicione 15 nanogramas de osso dorsal digerido e outros reagentes a um tubo de PCR mantido em gelo e ajuste o volume para 10 microlitros com água. Incubar a reação à temperatura ambiente durante uma hora. Em seguida, transforme as células compatíveis com STBL3 com dois microlitros da mistura de ligação.

Em seguida, coloque no caldo de lisogenia o ágar contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Depois disso, incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius. Escolha três colônias e inocule-as.

Realize a mini preparação para cada cultura e sequencie o local de inserção do oligo com um primer da região promotora U6. Semeie células hek293t em um prato de 10 centímetros. E deixe-o para incubação durante a noite.

Para preparar a mistura de DNA para transfecção, pipete 45 microlitros do reagente de transfecção para o DNA. Use uma pipeta para misturar o DNA e o reagente de transfecção com cuidado e deixe repousar por 20 minutos. Depois disso, adicione a mistura de transfecção de DNA gota a gota nas células semeadas.

Gire suavemente as placas. E incube a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por um dia. Colher o vírus que contém sobrenadante após 24 e 48 horas, passando-o através de um filtro de 0,22 micrómitre.

E alíquota de 1,6 mililitros de sobrenadante em cada frasco criogênico. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células Ba/F3 em meio pipetando as células para cima e para baixo várias vezes. Adicione 500 microlitros de células ressuspensas, 1,5 mililitros de sobrenadante viral, quatro microlitros de polibreno e 10 nanogramas por mililitro de interleucina murina 3 em uma placa de cultura de tecidos de seis poços.

Centrifugar a placa a 440 g durante 120 minutos a 37 graus Celsius. Após a centrifugação, transfira a placa para uma incubadora para incubação noturna a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Depois disso, gire as células para baixo a 440 G por três minutos.

E ressuspenda em cinco mililitros de meio quente fresco em uma placa de seis poços. Para selecionar as células infectadas por Cas9, primeiro gire a célula para baixo. Em seguida, ressuspenda em meio quente fresco suplementado com cinco microgramas por mililitro de blasticidina após 48 horas de spinfecção.

Continue selecionando células por nove dias com blasticidina até que todas as células não infectadas estejam mortas. Em seguida, transfira as células resistentes para um meio com um micrograma por mililitro de blasticidina. Transduza as células parentais e as células que expressam Cas9 de forma estável com a construção repórter pXPR-011 através da infecção lentiviral.

Continue selecionando células com dois microgramas por mililitro de puromicina por três dias, 48 horas após a infecção. Infectar as células que expressam Cas9 com ácido ribonucléico guia único usando lentivírus. Em seguida, use dois microgramas por mililitro de puromicina para selecionar as células por três dias, 48 horas após a infecção.

Bin as células Ba / F3 de crescimento exponencial que expressam Cas9 ectópico e o ácido ribonucléico guia único de interesse. Aspire o sobrenadante e lave as células com cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Gire as células para baixo e lave com solução salina tamponada com fosfato três vezes.

Em seguida, conte o número de células usando um analisador de viabilidade celular. Em seguida, as células de sementes em triplicados em dois mililitros de meio fresco sem interleucina 3 em seis placas de cultura de poço. Comece a monitorar e contar as células a cada dois dias durante oito dias.

Dados psicométricos de fluxo representativos demonstrando a atividade de Cas9 em células Ba / F3 parentais e células Cas9 com superexpressão de Ba / F3 são mostrados aqui. O sinal da proteína fluorescente verde é reduzido em 76% nas células Cas9 com superexpressão de Ba / F3, indicando atividade robusta de Cas9, enquanto nas células Ba / F3 parentais, o sinal da proteína fluorescente verde permanece em 100% Curvas de crescimento representativas para células que demonstram atividade oncogênica da calreticulina são mostradas aqui. A mutação de mudança de quadro mediada por CRISPR/Cas9 mais um par de bases foi introduzida no locus do éxon nove da calreticulina usando RNase guia única m1 e m2.

As curvas de crescimento para células Cas9 do receptor de trombopoetina Ba/F3 direcionadas à calreticulina mostram crescimento independente da interleucina 3 murina. No entanto, as curvas de crescimento para os outros tipos de células não mostram nenhum crescimento independente de citocinas. Os resultados do sequenciamento confirmam a edição no alvo do exon nove da calreticulina endoginosa em células Cas9 do receptor de trombopoetina Ba/F3 direcionadas à calreticulina usando a RNase guia única m1 e m2.

As mutações de mudança de quadro de par de bases mais um são indicadas em preto. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas semanas se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante entender que tipo de mutações no gene de interesse podem ser responsáveis pelo fenótipo desejado.

Após esse procedimento, outros métodos para caracterizar ainda mais a mutação, como seu papel na sinalização celular ou nas interações proteína-proteína, podem ser realizados para entender melhor o mecanismo pelo qual ela causa a doença. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da hematologia explorarem o efeito de mutações de ganho de função em níveis fisiológicos na transformação celular em células hematopoiéticas Ba/F3. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como utilizar a metodologia de edição de genes CRISPR/Cas9 para investigar a atividade oncogênica de mutações de ganho de função em células hematopoiéticas dependentes de citocinas.

Não se esqueça de que trabalhar com lentivírus pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em uma instalação BL2 plus devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.