Expressão gênica em camadas de aleurona cevada bombardeado com maior Throughput de medição

O objetivo geral deste procedimento é medir a expressão gênica de construções repórter após introduzi-las em células de cevada-aleurona por bombardeio de partículas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na expressão gênica regulada por hormônios vegetais, como como moléculas de sinalização específicas agem para regular o ácido abscísico em genes induzidos por cevada. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece maior rendimento do que os métodos anteriores, permitindo que um grande número de construções gênicas e condições de incubação sejam testadas.

Demonstrando o protocolo estará Grace, uma aluna do meu laboratório. Primeiro, coloque alguns grãos sem embriões na tampa de uma placa de Petri de plástico de 90 milímetros contendo 20 mililitros de solução de absorção e 20 microlitros de cloranfenicol. Usando uma pinça estéril, remova suavemente o tegumento transparente de cada grão.

Descascar os tegumentos do grão de cevada é uma etapa crítica. Se os tegumentos das sementes não forem totalmente removidos, os microtransportadores de ouro serão impedidos de entrar nas células de aleurona. Mas se o peeling for feito de forma muito grosseira, as células de aleurona podem ser danificadas.

Depois de descascar o tegumento de todos os grãos, transfira-os da placa de Petri para uma placa de vermiculita. Em seguida, coloque os grãos descascados sem embriões em uma incubadora a 24 graus Celsius por 16-20 horas. Agora, rotule um tubo de um vírgula cinco mililitros de cada tratamento que será incluído no experimento de bombardeio.

A cada tubo, adicione dois vírgula cinco microgramas de plasmídeo de controle interno de luciferase UBI, dois vírgula cinco microgramas de um plasmídeo repórter GUS e a quantidade desejada de um plasmídeo efetor. Adicione água ultrapura a cada tubo para elevar o volume total para cinco microlitros. Para cada tratamento, adicione 50 microlitros de microcarreadores suspensos em 50% de glicerol em cada tubo de cinco mililitros contendo DNA plasmidial.

Na etapa final do procedimento de codificação do microportador, pipete oito microlitros de microportadores suspensos em cada um dos cinco macrotransportadores e deixe-os secar ao ar. Configure o aparelho de bombardeio de partículas ligando a bomba de vácuo, abrindo a válvula de hélio e, em seguida, ligando o sistema de entrega de partículas. Coloque um disco de ruptura de 1550 psi na tampa de retenção e monte-o no sistema de entrega de partículas.

Coloque um macroportador contendo a combinação de plasmídeo desejada com uma tela de parada no conjunto de lançamento do microportador. Insira o conjunto na ranhura superior da câmara de bombardeio. Em seguida, organize oito grãos sem embriões em um padrão radial apertado com as extremidades mais finas apontando para dentro em um círculo de papel de filtro que é colado na tampa de uma placa de Petri de 90 mililitros.

Coloque o prato com os grãos na câmara de bombardeio a uma distância de seis centímetros da tela de parada. Feche a porta e pressione o interruptor de vácuo para evacuar a câmara de bombardeio para 95 quilopascais. Gire rapidamente o interruptor de vácuo para a posição de espera.

Em seguida, mantenha pressionado o interruptor de disparo para bombardear a amostra. Depois de liberar o vácuo, transfira os grãos bombardeados para uma placa de Petri rotulada de 60 milímetros contendo quatro mililitros de solução absorvida com um miligrama por mililitro de cloranfenicol. Repita até que todos os bombardeios tenham sido concluídos.

Em seguida, incube os grãos bombardeados em uma plataforma agitada a 100 rpm a 24 graus Celsius por 24 horas. Usando uma pinça, remova os oito grãos bombardeados da placa de Petri de 60 milímetros e seque-os em uma toalha de papel. Divida os grãos em dois tubos rotulados de dois mililitros, cada um contendo 800 microlitros de tampão de moagem e um cordão de aço inoxidável de cinco milímetros.

Depois de repetir a etapa anterior para todos os grãos bombardeados, coloque até 48 tubos de dois mililitros em duas prateleiras de um homogeneizador de esferas. Em seguida, monte as prateleiras no homogeneizador e agite as amostras a 30 hertz por três minutos. Quando terminar, remova as prateleiras do homogeneizador e coloque-as no gelo por cinco minutos para resfriar novamente as amostras.

Agora, monte os racks no homogeneizador na direção oposta. Agitar novamente as amostras a 30 hertz durante três minutos. Depois de retirar as prateleiras do homogeneizador, coloque-as no gelo por cinco minutos para resfriar novamente as amostras.

Em seguida, centrifugue os extratos de grãos a 16.000 G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Imediatamente após a centrifugação, decantar os sobrenadantes transparentes para um segundo conjunto de tubos de microcentrífuga. Vortex breve cada tubo e armazenar no gelo.

Após a transferência do sobrenadante, recupere os grânulos de aço inoxidável dos pellets para que possam ser lavados e reutilizados. Agora adicione 200 microlitros de tampão de ensaio GUS a cada poço de uma placa de 96 poços. Coloque 50 microlitros de cada extrato de grão em um dos poços e misture com a ponta da pipeta.

Em seguida, sele a parte superior da placa com filme de vedação. Coloque a placa de 96 poços em uma incubadora no escuro a 37 graus Celsius por 20 horas. Após a incubação, centrifugue a placa de 96 poços a 4.000 G a quatro graus Celsius por 10 minutos.

Quando terminar, coloque o prato no gelo. Agora, adicione 250 microlitros de zero vírgula dois molares de carbonato de sódio a cada poço de uma placa preta de 96 poços. Adicione seis vírgula dois cinco microlitros de cada mistura de ensaio GUS centrifugada em cada poço da placa preta e misture com a ponta da pipeta.

Inclua poços com seis vírgula dois, cinco microlitros de 10-40 a 100 micromolares, quatro metilumbeliferona como padrões. Coloque a placa preta em um fluorômetro de placa. Leia a fluorescência da metilumbeliferona definindo o ganho do instrumento, de modo que um poço contendo seis vírgula dois cinco microlitros de 40 micromolares, quatro metilumbeliferona e 250 microlitros de carbonato de sódio zero vírgula dois molares dê uma leitura de 100 unidades de fluorescência.

Neste experimento, uma construção repórter HVA1 GUS foi introduzida em células de aleurona junto com uma construção efetora UBI TaABF1. Enquanto uma proporção TaABF1 HVA1 de apenas zero vírgula zero, um foi suficiente para causar uma indução tripla do gene repórter HVA1 na ausência de ácido absísico exogenis ou ABA. Níveis mais altos da construção TaABF1 resultaram em expressão progressivamente maior de HVA1 de maneira dependente da dose.

Tanto o exogenis ABA quanto o TaABF1 podem induzir fortemente a expressão do construto repórter HVA1 GUS. Em ambos os casos, a presença de um butanol inibiu fortemente a indução de HVA1, o que sugere que a fosfolipase D pode desempenhar um papel importante na ativação da expressão do gene HVA1 por ABA através de TaABF1. O ABA demonstrou inibir fortemente a expressão induzida pela giberelina para a construção repórter Amy32b GUS.

Embora nem o peróxido de hidrogênio nem o nitroprussiato de sódio tenham causado qualquer redução significativa. Esses resultados, portanto, não apóiam um papel para o óxido nítrico e o peróxido de hidrogênio nas respostas ABA das células de aleurona. Uma vez dominada, essa técnica pode permitir que muitas amostras diferentes sejam medidas quanto à expressão gênica em um tempo relativamente curto.

Por exemplo, o bombardeio de 200 amostras de grãos diferentes pode ser feito por dois investigadores em algumas horas. Então, no dia seguinte, um único investigador pode preparar todos os extratos de proteína em duas horas. O ensaio GUS modificado realizado em placas de 96 poços também requer muito menos trabalho do que outros protocolos que usam nos futuros ensaios de tubo.