Name: Observação e Análise da Espalhamento Raman Aprimorado por Superfície do Piscar de Olhos. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Aprenda a observar e analisar o espalhamento Raman aprimorado por superfície do piscar de olhos em moléculas únicas sobre nanopartículas de prata. Este método permite coletar dados simultâneos de múltiplos pontos.

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O autor agradece a Prof Y. Ozaki (Kwansei Gakuin University) e Dr. T. Itoh (National Institute of Advanced Industrial Science e Technology) para sua discussão proveitosa deste trabalho. Este trabalho foi financiado pelo KAKENHI (subsídio para C de investigação científica) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (n º 16K. 05671).

1. preparação da amostra
<ol><li>
Preparação de nanopartículas de prata coloidais 20<ol>
<li>Para fabricar a nanopartículas de prata coloidais, dissolva 0,030 g de nitrato de prata e 0,030 g de citrato trissódico dihidratado em 150 mL de água num balão de fundo redondo de 200 mL.</li>
		<li>Combine o balão com um condensador de refluxo (Dimroth).</li>
		<li>Misture a solução do frasco com uma barra magnética de agitador e mexa. Em seguida, aqueça a solução agita o balão em banho de óleo a 150 ° C por 60 min. Nota: A solução vai virar cinza amarela, então leitosa.</li>
		<li>Arrefecer a suspensão em temperatura ambiente e manter a suspensão no frasco coberto com folha de alumínio em um frigorífico. Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto. Use as nanopartículas coloidais, depois armazenar no frigorífico, dentro de um mês.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da amostra para multi-coloridas piscando de emissão 11<ol>
<li>Para preparar uma lâmina de microscópio, lave à mão uma placa de vidro com sabão e enxágue com água.</li>
		<li>Adicionar 0,1% solução aquosa de poli-L-lisina para a placa de vidro e remover a solução com um ventilador.</li>
		<li>Adicionar a suspensão coloidal de prata para a placa de vidro e remover a suspensão com um ventilador.</li>
		<li>Coloque uma área para soltar a placa de vidro com uma caneta de bloqueador líquido.</li>
		<li>Gota de água destilada na placa de vidro e cubra-o com outra placa de vidro para criar um slide de microscópio e evitar que a água evapora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da amostra para monótonos coloridas piscando SERS 7 , 8 , 9 , 10<ol>
<li>Para preparar uma lâmina de microscópio, lave à mão uma placa de vidro com sabão e enxágue com água.</li>
		<li>Misturar a suspensão coloidal de prata com tintura de thiacyanine ou thiacarbocyanine (µM 25 ou 4, respectivamente) e uma solução aquosa de NaCl (10 mM) em uma relação de volume de 2:1:1.</li>
		<li>Deixar a suspensão da amostra na placa de vidro e remover a suspensão com um ventilador.</li>
		<li>Coloque uma área para soltar a placa de vidro com uma caneta de bloqueador líquido.</li>
		<li>Gota de solução aquosa de NaCl (1 M) na placa de vidro para imobilizar as nanopartículas de prata e cubra-o com outra placa de vidro para criar um prato de corrediça do microscópio e impedir a evaporação da solução.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. observação de nanopartículas de prata a piscar
<ol><li>
Iluminação da amostra
	<ol>
<li>Coloque a placa de vidro de amostra preparada usando protocolo 1.2 ou 1.3 no palco de um microscópio invertido.</li>
		<li>Ilumine a placa de vidro de amostra usando luz branca através de um condensador de campo escuro e foco em vários pontos coloridos (azuis, verdes, amarelos e vermelhos) na placa de vidro, usando uma lente objetiva (60 X).</li>
		<li>Ilumine a placa de vidro de amostra utilizando um feixe atenuado, entregado a um ângulo de 30° em relação à superfície da amostra, de um laser de assemelhace (cw) diodo bombeado de estado sólido (DPSS) através de um filtro de interferência.</li>
		<li>Para usar iluminação laser para observar a nanoaggregates de prata como monótonas manchas coloridas em uma envolvente da mesma cor, mover a área de iluminação do laser para o centro da vista e focalizar os pontos na placa de vidro, ajustando o estágio na direção z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observação de piscar
	<ol>
<li>Inserir um filtro de passa-tempo após a lente objetiva e iluminam a placa de vidro de amostra usando um feixe de cw-laser DPSS entregado a um ângulo de 30° em relação à superfície da amostra através de um filtro de interferência.</li>
		<li>Encontrar a piscar pontos conforme mostrado na Figura 1 (ver também Figura S1 no material complementar) movendo o palco na x - e y-direções.</li>
		<li>Gravar vídeo dos pontos piscando com o microscópio invertido, acoplado a uma câmera de refrigeração digital dispositivo de carga acoplada (CCD), que tem uma resolução de tempo de 61-120 ms, por 20 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. análise de piscar SERS
<ol><li>
Derivação do perfil do tempo de vídeo
	<ol>
<li>No software que controla a câmera CCD, abra o arquivo de vídeo.</li>
		<li>Para selecionar os pontos piscando e área escura, arraste áreas que cobrem separadamente as regiões com e sem manchas na imagem de vídeo.</li>
		<li>Para derivar perfis de tempo de intensidade de sinal o pontos piscando e áreas escuras no vídeo, selecione Análise Temporal em análisee clique a calcular na janela de Análise Temporal .</li>
		<li>Salve os dados como um arquivo de texto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise do perfil do tempo
	<ol>
<li>Achate uma linha de base do perfil tempo subtraindo-se o perfil de tempo do área escura e/ou montagem com uma função polinomial, como mostrado nas figuras 2A e 2B.</li>
		<li>Avalie uma intensidade média de base que consiste em aproximadamente 2000 pontos, eubasee um desvio-padrão das intensidades de linha de base, σ, como mostrado nas figuras 2 e 2D.</li>
		<li>Distinguir eventos brilhantes de acontecimentos sinistros usando intensidades maiores do que um limiar de eubase + 3σ e registar a duração de cada evento. Na Figura 3, por exemplo, registrar o evento de 0 para 3.5476 s como o evento escuro (com uma duração de t = 3.5476 s) e registrar o evento de 3.5476 para 4.0981 s como o evento brilhante (com uma duração de t = 0.5505 s). Repita o procedimento como mostrado na tabela 1.</li>
		<li>Conte o número de eventos brilhantes e escuros para cada duração, tal como expresso nas primeiras e segunda linhas da tabela 2.</li>
		<li>Soma do número de eventos para cada duração, exceto para eventos mais curtos do que a duração t. Conforme expresso nas segunda e terceiros linhas da tabela 2, por exemplo, somar o número de eventos para cada duração (excepto os eventos para t = 0.0612 s) como 41 + 18 + 9 +...; o resultado é igual a soma de t = 0.1223 s, ou seja, 103.</li>
		<li>Divida os somatórios por cada duração e normalizá-los. Conforme expresso na tabela 2, por exemplo, dividir o somatório para duração t = 0.0612 s pela duração 0.0612 s. O resultado é 3,351.5791. Em seguida, divida o resultado pelo total dos resultados na quarta linha da tabela 2. A distribuição de probabilidade é derivada para ser 0.64494.</li>
		<li>Plotar as distribuições de probabilidade para o brilhante eventos Pem(t) contra sua duração t em um gráfico do logaritmo-logaritmo e caber Log10Pem(t) pelo Log10 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg">) para deduzir o poder lei expoente α para um determinado ponto a piscar. Se Pem(t) é montado por <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg"> , a linha cabida se desvia as parcelas em valores pequenos de Pem(t), como mostrado pela linha pontilhada na Figura 4A.</li>
		<li>Plotar as distribuições de probabilidade para eventos escuro Pfora(t) contra sua duração t em um gráfico do logaritmo-logaritmo e apto Log10Pfora(t) por Log10( <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg"> a deduzir a energia lei expoente αfora e o truncamento de tempo τ a piscar mesmo local. Se Pfora(t) é montado por <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg"> , a cabido curva desvia as parcelas em valores pequenos de Pfora(t).</li>
		<li>Repita 3.2.1 para 3.2.8 para os outros pontos piscando no vídeo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Qian, X. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+single-nanoparticle+SERS%3A+from+fundamental+mechanisms+to+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).</li>
<li>Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+by+surfaced-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).</li>
<li>Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS+-a+single-molecule+and+nanoscale+tool+for+bioanalytics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).</li>
<li>Kitahama, Y., Ozaki, Y. Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKitahama%2C+Y+%22Frontiers+of+Surface-Enhanced+Raman+Scattering%3A+Single-Nanoparticles+and+Single+Cells%22">Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells</a>. , Wiley. Chichester. Chapter 6 (2014).</li>
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<li>Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jrs.5079/abstract">Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law.</a> J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).</li>
<li>Habuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Surface+Enhanced+Resonance+Raman+Spectroscopy+of+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).</li>
<li>Weiss, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp0126863">Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics.</a> J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).</li>
<li>Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-examining+the+origins+of+spectral+blinking+in+single-molecule+and+single-nanoparticle+SERS%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS.</a> Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).</li>
<li>Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+blinking+in+surface+enhanced+resonance+Raman+scattering+and+fluorescence+by+electromagnetic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism.</a> J. Chem. Phys. 136, 024703(2012).</li>
<li>Willets, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+SERS+hot+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of SERS hot spots.</a> Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).</li>
<li>Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Frequency+Domain+Existence+Proof+of+Single-Molecule+Surface-Enhanced+Raman+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).</li>
<li>Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359029407000726">Power-law intermittency of single emitters.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).</li>
<li>Tang, J., Marcus, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fluorescence+blinking+in+semiconductor+nanocrystal+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots.</a> J. Chem. Phys. 123, 054704(2005).</li>
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</ol>

O autor não tem nada para divulgar.

Da junção da prata nanoaggregate, SERS é emitido. Assim, precisamos preparar nanoaggregates ao invés de nanopartículas coloidais, que são cobertas com ânions de citrato. Agregados de prata são formados a partir a salgar-para fora o efeito criado pela adição de poli-L-lisina, que tem -NH3+ e é a origem dos SERS, ou cátions at+ de NaCl, conforme mostrado na Figura S2 do material complementar. Além disso, para iluminar os muitos locais na área ampla, o feixe de laser sem foc...

Superfície-enhanced Raman espalhamento (SERS) é altamente sensível Espectroscopia Raman de uma superfície de metal nobre. Desde que o espectro Raman fornece informações detalhadas sobre a estrutura molecular com base nas posições do pico afiado, através dos modos vibracionais dos grupos funcionais nas moléculas, as informações de uma única molécula sobre uma superfície metálica podem ser investigadas usando SERS1,2,3. De um nanoaggregate de prata com um adsorbate no nível do único-molécula, um sinal intermitente é observado1,2,3,4,5,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16e o espectro varia1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13,14. Piscando pode ser induzida por uma única molécula que aleatoriamente se move dentro e fora de um campo de (EM) eletromagnético melhorado em uma junção de nanoaggregate prata nanômetros de tamanho. Portanto, piscando é considerada uma prova simples para a deteção de único-molécula, comparada com uma técnica usando uma distribuição de Poisson de intensidades SERS e um bi-analito2,3,17. No entanto, os mecanismos detalhados do espectro piscando e flutuante, que pode depender fortemente de comportamento molecular na superfície Ag, são ainda controversos.
Em estudos anteriores, piscar SERS foi analisada usando a função de autocorrelação, que pode calcular o coeficiente de difusão e concentração de moléculas entrando e um reforço EM campo12,13,14 . Além disso, uma pontuação normalizada desvio-padrão, que representa a instabilidade na intensidade total, foram obtida a partir do perfil de tempo do sinal15. No entanto, essas abordagens analíticas podem basear-se sobre o comportamento de algumas moléculas. Em contraste, em uma imagem de super-resolução de piscar SERS, comportamento único-molécula em um campo EM avançado pode ser identificados16. No entanto, essas técnicas podem obter tais parâmetros somente em um campo EM reforçada. O comportamento aleatório de uma única molécula dentro de uma grande variedade (por exemplo, no piscar SERS) pode ser representado como uma lei de potência, ao invés de uma média de4,5,6,7,8 ,9,10,11, semelhante à fluorescência pisca de um único semicondutor quantum dot (QD)18,19. Usando um poder lei análise4,5,6,7,8,9,10,11, comportamento molecular pode ser estimado no estado brilhante (no campo EM reforçada) e no estado escuro10; ou seja, o comportamento da molécula sobre toda a superfície de prata pode ser estimado.
Para esta técnica, a prata coloidais nanoaggregates são usados4,5,6,7,8,9,10,11. Estes nanoaggregates mostrar várias bandas de ressonância (LECC) de plasmon de superfície localizadas que afetam fortemente reforçada de campos eletromagnéticos quando eles estão animados em certos comprimentos de onda. Assim, prata SERS-ativo nanopartículas existem em suspensão coloidal e alguns dados pode ser obtida imediatamente. No caso de nanoestruturas simples, que têm regimes, formas e tamanhos específicos, a dependência de LECC de SERS piscando pode esconder outras dependências7; ou seja, se o bom ou mau nanostructure de LECC é usado, os parâmetros será constantes, e outras dependências, portanto, ficará oculta. Análise de lei do poder tem sido usado para descobrir várias dependências dos SERS piscando de prata coloidal nanoaggregates4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11.

<table><tbody><tr><td>Nitrato de prata, 99,8%</td> <td>Wako</td><td>194-00832</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trissódico di-hidratado, 99. %</td> <td>Wako</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Solução aquosa de poli-L-lisina, 0,1%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>3,3 '-disulfopropiltiacanina trietilamina</td><td>Hayashibara Biochemical Laboratories</td><td>NK-2703</td><td>um tipo de corantes de tiacinina</td></tr><tr><td>3,3'-dietil-5,5'-dicloro-9-metiltiacarbocianina sal de iodo</td><td>Hayashibara Biochemical Laboratories</td><td>SMP-9</td><td>um tipo de corantes de tiacaropocianina</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, 99,5%</td> <td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Condensador Dimroth</td><td>Iwaki</td><td>61-9722-22</td><td>perchased de AS ONE</td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>Corning</td><td>DC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Banho</td> <td>de óleoAdvantech</td><td>OS-220</td><td></td></tr><tr><td>Placa de vidro</td><td>Matsunami</td><td>S-1112</td><td>Soprador de lâminas de microscópio</td></tr><tr><td></td><td>Hozan</td><td>Z-288</td><td>Espanador de ar</td></tr><tr><td>Caneta bloqueadora de líquidos</td><td>Daido Sangyo</td><td></td><td>LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Caneta barreira hidrofóbica pronta para uso projetada para aplicações de imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX-70</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Olympus</td><td>LCPlanFl 60&times;</td><td>NA 0.7</td></tr><tr><td>Condensador de campo escuro</td><td>Olympus</td><td>U-DCD</td><td>NA 0.8- 0.92</td></tr><tr><td>Câmera CCD digital refrigerada</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-AG</td><td>controlada pelo software Aqua Cosmos</td></tr><tr><td>Software para a câmera CCD digital refrigerada</td><td>Hamamatsu</td><td>AquaCosmos</td><td>usado também para derivação dos perfis de tempo dos pontos piscantes no vídeo&nbsp;</td></tr><tr><td>Câmera CCD colorida</td><td>ELMO</td><td>TNC-C920</td><td>não usada para análise</td></tr><tr><td>DPSS laser</td><td>RGB sistema laser</td><td>NovaPro532-75</td><td>&lambda; = 532 nm; 60 mW (corresponde a uma densidade de potência de 600 W/cm2)Filtro de</td></tr> <tr><td>interferência</td><td>Semrock</td><td>LL01-532-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-longo</td><td>Semrock</td><td>BLP01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Software para a distinção e contagem dos eventos claros/escuros</td><td>empregada doméstica</td><td></td><td>programada por C++</td></tr><tr><td>Software para a montagem por uma lei de potência</td><td>LightStone</td><td>Origin6.1</td><td></td></tr></tbody></table>

observação e análise da espalhamento raman aprimorado por superfície do piscar de olhos.

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

De uma única molécula em uma junção de prata nanoaggregate, piscar superfície-enhanced Raman espalhamento (SERS) é observada. Aqui, um protocolo é apresentado em como preparar o SERS-ativo nanoaggregate de prata, gravar um vídeo de determinados pontos piscando em imagem microscópica e analisar as estatísticas pisca. Nesta análise, uma lei de potência reproduz as distribuições de probabilidade para eventos brilhantes em relação a sua duração. As distribuições de probabilidade para eventos escuros são montadas por uma lei de potência com uma função exponencial. Os parâmetros da lei poder representam o comportamento molecular nos Estados brilhantes e escuros. O modelo de passeio aleatório e a velocidade da molécula através de toda a superfície de prata podem ser estimados. É difícil de estimar, mesmo quando usando as médias, funções de autocorrelação e imagem latente de super-resolução SERS. No futuro, análises de lei de poder devem ser combinadas com imagem espectral, porque as origens de piscar não podem ser confirmadas por este método de análise sozinho.

Do nanoaggregates prata com poli-L-lisina, preparado pelo Protocolo 1.2, multicoloridos pontos piscando de SERS e fluorescência avançada superfície são observados, como mostrado na Figura 111. Em contraste, monótonos pontos piscando coloridos de SERS foram observados para a nanoaggregates de prata com as moléculas de corante preparadas pelo Protocolo 1.37,8,<sup clas...

Este protocolo descreve a análise de superfície-enhanced Raman a piscar espalhamento devido o passeio aleatório de uma única molécula em uma superfície de prata usando as leis do poder.

Observação e Análise da Espalhamento Raman Aprimorado por Superfície do Piscar de Olhos.

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...

O objetivo geral desta análise do espalhamento Raman aprimorado por superfície intermitente é investigar o comportamento de moléculas únicas em superfícies de nanopartículas metálicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na ciência da interface e do coral sobre o comportamento de trabalho de interfaces sólidas líquidas A principal vantagem dessa técnica é que muitos dados podem ser coletados porque aproximadamente uma dúzia de pontos piscando podem ser observados simultaneamente em um vídeo. Para iniciar este procedimento, lave duas lâminas de microscópio de vidro com detergente líquido e água da torneira.Enxágue as lâminas com água destilada e deixe-as secar ao ar. Em seguida, aplique uma solução aquosa de 0,1% de poli-l lisina em uma lâmina seca. Deixe a solução descansar na lâmina por dois a três segundos.Em seguida, use um soprador de ar comprimido para remover o excesso de solução e secar a lâmina. Em seguida, aplique uma suspensão de nanopartículas de prata coloidal na lâmina. Deixe a suspensão descansar por dois a três segundos.Seque a lâmina com ar comprimido. Em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para envolver completamente uma área de 26 milímetros por 26 milímetros na lâmina. Deixe a barreira secar.Coloque água destilada na lâmina para preencher a área fechada. Cubra a lâmina com a segunda lâmina de vidro limpa e seca para evitar a evaporação da água. Coloque o conjunto de lâminas no sample stage do microscópio invertido.Ilumine a lâmina com luz branca através de um condensador de campo escuro. Foque em pontos de várias cores mudando de uma lente objetiva de 2x para uma lente objetiva de 60x. Em seguida, use um laser de onda contínua de estado sólido bombeado por diodo de 532 nanômetros, um filtro de interferência passa-banda e uma lente para iluminar a amostra com um feixe atenuado em um ângulo de 30 graus em relação à superfície da amostra.Mova a iluminação do laser para o centro da visualização e ajuste levemente a direção z do estágio de amostra, para refinar o foco nos pontos. Observe os agregados como manchas monótonas contra um fundo uniforme. Em seguida, desligue o laser e insira um filtro de borda passa-longa após a lente objetiva.Ilumine a amostra com o laser em um ângulo de 30 graus em relação à superfície da amostra, através do filtro de interferência e da lente externa. Mova o palco nas direções x e y para encontrar os pontos piscando. Em seguida, use uma câmera CCD digital profunda e fria com um tempo de quadro de 61 a 120 milissegundos para adquirir um vídeo de 20 minutos dos pontos.Para iniciar a análise, abra o vídeo adquirido no software da câmera CCD. Clique e arraste para selecionar áreas com e sem pontos piscando. Execute uma análise temporal para derivar um perfil de tempo de intensidade de sinal para as manchas e áreas escuras.Adquira perfis para todos os pontos piscantes e áreas escuras de interesse dessa maneira. Em seguida, gere distribuições de probabilidade para eventos claros e escuros em relação às suas durações. Manchas piscantes multicoloridas foram observadas a partir de SERS de nanoagregados de prata, preparados com lâminas revestidas de poli-l lisina.O sinal piscando é atribuído às moléculas únicas de caminhada aleatória nas junções agregadas nano de prata. Os sinais do único nanoagregado mostraram intensidades variadas ao longo do tempo, ao contrário da fluorescência piscante de um ponto quântico. O limite para eventos brilhantes foi definido como três desvios padrão acima da intensidade da linha de base, e as durações dos eventos claros e escuros foram determinadas para cada ponto.A distribuição de probabilidade de eventos brilhantes foi plotada em relação à duração do evento como uma linha e um gráfico logarítmico, enquanto a distribuição de probabilidade de eventos escuros foi plotada em relação à duração como uma curva. Como as durações dos eventos escuros eram geralmente mais longas do que as durações pares brilhantes, os expoentes da lei de potência para eventos brilhantes tendiam a ser menores do que os dos eventos escuros. Tempos de truncamento mais curtos para eventos escuros indicaram uma caminhada aleatória molecular mais rápida, uma barreira de energia mais alta de um estado não emissivo para um estado emissivo ou uma combinação de ambos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como observar e analisar os fenômenos SERS piscando.

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Research

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Chemistry

Química

Discutimos a construção e operação de um sistema não-linear complexa óptico que utiliza comutação totalmente óptica ultra-rápida para isolar Raman a partir de sinais de fluorescência. Usando este sistema, somos capazes de separar com sucesso sinais Raman e fluorescência utilizando energias de pulso e poderes média que permanecem biologicamente seguro.

Rejeição de fundo de fluorescência em Ressonância e microspectroscopy Raman espontâneo

Fonte: Espinoza, R., et al. Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores em tempo real do cérebro de camundongos para diagnóstico de tecidos. J. Vis. Exp. (2022).  O vídeo demonstra imagens de espalhamento Raman estimulado (SRS) de duas cores de seções de tecido cerebral de camundongos. Dois feixes de laser sincronizados são direcionados para a seção de tecido para excitar vibrações moleculares, resultando em uma mudança de intensidade relativa nos feixes. Lipídios e proteínas no...

Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores do tecido cerebral de camundongos

Descrevemos a fabricação e caracterização de sistemas nanobiológicos fazendo interface com substratos nanoestruturados com proteínas imobilizadas e aptâmeros. As etapas experimentais relevantes envolvendo a fabricação litográfica de substratos nanoestruturados, biofuncionalização e caracterização de espectroscopia Raman aprimorada por superfície (SERS) são relatadas. A detecção SERS de proteínas imobilizadas na superfície e a sondagem da ligação proteína-ligante e aptâmero-ligante são...

Superfície reforçada Raman Detection Espectroscopia de Biomoléculas Usando EBL Fabricadas Nanoestruturados Substratos

Podemos descrever a construção de um espectrómetro de (CW-SBS) continuous-wave-estimulada-Brillouin-dispersão rápida. O espectrômetro emprega lasers de diodo de frequência única e um entalhe vapor atômico-filtro para adquirir espectros de transmissão das amostras turvas/não-turvo com alta-resolução espectral em velocidades de até 100-fold mais rápido do que aqueles de espectrômetros de CW-SBS existentes. Esta melhoria permite a análise de material de alta velocidade Brillouin.<br...

Espectrômetro de espalhamento Brillouin estimulado assemelhace de alta velocidade para análise de Material

Neste manuscrito, é descrita a implementação de um microscópio de espalhamento Raman (SRS) estimulado, obtido pela integração de um conjunto experimental de SRS com um microscópio de varredura a laser. O microscópio de SRS é baseado em duas fontes do laser do femtossegundo (FS), em um ti-safira (ti: SA) e em oscilador paramétrico ótico sincronizado (OPO).

Implementação de um microscópio não-linear baseado em espalhamento Raman estimulado

A microscopia de dispersão de Raman estimulada (SRS) permite imagens seletivas e livres de rótulos de moieties químicos específicos e tem sido efetivamente empregada para imagens de moléculas lipídicas in vivo. Aqui, fornecemos uma breve introdução ao princípio da microscopia SRS e descrevemos métodos para seu uso no armazenamento lipídeto de imagem em Caenorhabditis elegans.

Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada

A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica de imagem poderosa, não destrutiva e livre de rótulos. Uma aplicação emergente é a histologia raman estimulada, onde imagens de SRS de duas cores nas transições de proteína e lipídio de Raman são usadas para gerar imagens pseudo-hematoxilina e eosina. Aqui, demonstramos um protocolo para imagens de SRS em tempo real e duas cores para diagnóstico de tecido.

Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

Apresentamos um protocolo para adquirir imagens químicas com microscopia de dispersão Raman estimulada por banda larga (SRS). Baseado em um microscópio SRS que opera com detecção diferencial de bloqueio multicanal, o protocolo descreve a preparação da amostra, o ajuste do aparelho SRS e a quimiometria para desembaraçar diferentes constituintes de amostras quimicamente heterogêneas.

Multiplex Imagem química baseada em banda larga estimulada raman dispersão microscopia

Um microscópio de transformada de Fourier de campo amplo, baseado em um interferômetro birrefringente compacto e ultra-estável, permite a aquisição paralela de espectros para todos os pixels de um detector 2D. A abordagem no domínio do tempo permite o desemaranhamento de sinais fotoluminescentes e Raman, e possibilita o mapeamento rápido Raman (~5 ms/pixel) com resolução espacial de ~1 μm e espectral de 23 cm-1 .

Um Microscópio Raman Multimodal de Transformada de Fourier de Campo Amplo

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar pequenas vesículas extracelulares individuais (sEVs) usando espectroscopia Raman aprimorada superficial sem marcação (SERS), possibilitando diagnósticos minimamente invasivos de doenças e avaliação de sEVs como veículos terapêuticos de entrega.

Explorando a Aplicação da Biosensição Baseada em Espalhamento Raman Aprimorado em Superfícies de SEVs individuais no diagnóstico e terapêuticas de doenças

Aprenda a observar e analisar o espalhamento Raman aprimorado por superfície do piscar de olhos em moléculas únicas sobre nanopartículas de prata. Este método permite coletar dados simultâneos de múltiplos pontos.

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