Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

O objetivo geral desta preparação de propagação da cromatina é visualizar cronologicamente os padrões de localização dinâmica de proteínas ligadas à cromatina e morfologia cromossômica de oócitos ao longo da oogênese de mamíferos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia reprodutiva feminina, como emparelhamento cromossômico homólogo, sinapse, reparo de DNA e segregação cromossômica meiótica. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a imunomarcação clara e a visualização de proteínas associadas aos cromossomos e a avaliação da ploidia oocitária.

A oogênese é propensa a erros e a segregação incorreta dos cromossomos geralmente resulta em doenças genéticas. Este método pode ser usado para melhorar nossa compreensão das causas maternas de aneuploidia e infertilidade. Depois de sacrificar um camundongo fêmea de 14 a 19 dias após o coito, faça uma abertura em forma de V na cavidade abdominopélvica.

Em seguida, remova o corno uterino materno. Em seguida, separe os embriões da placenta e sacrifique os embriões por decapitação. Em seguida, transfira-os para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo três mililitros de PBS a 37 graus Celsius.

Em seguida, mova um filhote para um prato separado, também carregado com PBS quente. Depois de sacrificar o feto, faça um corte ao longo da linha média ventral da metade posterior, ao longo da metade anterior abaixo dos membros anteriores e diretamente acima dos membros posteriores e da cauda. Em seguida, abra o abdômen do embrião usando uma tesoura de 3,5 polegadas.

Usando pinças de ponta fina, desloque ou remova o fígado e as alças do intestino, expondo as gônadas. Agora determine se as gônadas são gônadas masculinas ou femininas. Os ovários estão localizados imediatamente abaixo e atrás do rim, em direção à parede posterior da cavidade peritoneal.

Remova os dois ovários usando uma pinça de ponta fina e transfira-os para um pequeno recipiente contendo PBS que é mantido a 37 graus Celsius. Prossiga rapidamente para coletar os ovários de todos os fetos. Em seguida, em um novo recipiente pequeno, mergulhe completamente cada conjunto separado de ovários em meio mililitro de tampão de hipoextração recém-feito.

Deixe-os incubar a 25 graus Celsius por pelo menos 15 minutos, mas não mais que 30 minutos. Durante a incubação, use uma caneta PAP de barreira hidrofóbica para desenhar dois quadrados de 22 por 22 milímetros em uma lâmina de vidro limpa. Prepare uma lâmina para cada conjunto de ovários.

Quando a incubação estiver completa, adicione uma gota de 50 microlitros de sacarose 100 milimolares a uma lâmina limpa e transfira um par de ovários para a gota. Agora use duas agulhas de calibre 27 para provocar os ovários e liberar as células neles. Com uma pinça, remova e descarte os grandes pedaços de ovário.

Em seguida, pipete cuidadosamente a solução de sacarose para dispersar as células liberadas. Em seguida, carregue cada quadrado em uma lâmina com 40 microlitros de 1% PFA com 0,2% Triton X-100. Espalhe a solução ao redor do quadrado usando uma ponta de pipeta ou balançando a lâmina para frente e para trás.

Em seguida, para cada poça de solução de sacarose com células, carregue duas poças fixadoras com 20 microlitros de células suspensas para que cada lâmina tenha células de um conjunto de ovários. Para coletas de oócitos MI ou MII, primeiro prepare e eutanasiar o camundongo doador. Em seguida, faça uma grande abertura em forma de V na cavidade abdominopélvica e use uma pinça para deslocar os intestinos para localizar cada corno uterino.

Encontre os ovários proximais à caixa torácica. Segure o oviduto com uma pinça fina e corte a gordura superior ao ovário usando uma tesoura de dissecação. Enquanto ainda segura o oviduto, use uma pinça fina para liberar o ovário da bursa e transfira os ovários para uma placa de coleta contendo meio mantido a 37 graus Celsius.

Para coletar oócitos em estágio GV, use uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 27 para liberar os complexos cumulus-oócitos puncionando manualmente os grandes folículos antrais. Para coletar oócitos em estágio MII, faça um orifício na ampola do oviduto para liberá-los, em vez de simplesmente fazer uma punção. Agora colete os oócitos usando uma pipeta de vidro ou capilar operada pela boca, ou use uma seringa micrométrica operada manualmente.

Alguns oócitos podem estar cercados por células do cumulus, outros não. Para os oócitos MI, prepare hialuronidase fresca em MEM-alfa / BSA para desnudar os oócitos das células do cumulus circundantes. Para cada coleta de oócitos, trate-os em uma incubadora com 2,5 mililitros de hialuronidase preparada por três minutos.

Em seguida, transfira os oócitos MI para o meio MEM-alfa / BSA quente recém-feito. Lá, use uma pipeta de vidro operada pela boca para fornecer a força de cisalhamento necessária para separar completamente as células do cumulus. Em geral, o sucesso desse procedimento requer o domínio da coleta e manipulação de oócitos com pipetas de vidro operadas por boca ou capilares.

Permita que os oócitos se recuperem na incubadora. Enquanto isso, em uma placa de vidro aquecida de nove poços, coloque 300 microlitros de solução quente de Tyrode. Carregue dois poços com 300 microlitros de MEM-alfa/BSA quente e carregue um poço com 300 microlitros de meio Waymouth quente.

Para remover a zona pelúcida, transfira de cinco a 10 oócitos em estágio MII ou MII para o banho da solução de Tyrode por apenas 30 a 45 segundos enquanto os observa sob um microscópio de dissecação. Quando a zona pelúcida estiver visivelmente dissolvida, transfira imediatamente os oócitos para o meio usando uma pipeta pré-umedecida com meio MEM-alfa / BSA. Em seguida, transfira os oócitos para um segundo banho de meio aquecido.

Após o segundo banho, transfira os oócitos para o meio de Waymouth quente e deixe-os recuperar em uma incubadora por 30 minutos. Para se preparar para uma propagação de cromatina, use uma caneta PAP para desenhar um retângulo de 11 por 44 milímetros em uma lâmina de vidro. Em seguida, cubra a lâmina com uma fina camada de 1% PFA com 0,2% de Triton X-100 em água e, em seguida, balance a lâmina para frente e para trás para espalhar a solução.

Em seguida, toque no slide para remover o excesso. Agora sifão entre cinco e 10 oócitos com uma quantidade mínima de meio. Em seguida, transfira os oócitos para a lâmina preparada, arrastando simultaneamente uma ponta de pipeta através da solução fixadora e soltando os oócitos na lâmina cerca de um centímetro acima.

Os oócitos devem estourar imediatamente, espalhando cromatina na lâmina. Agora incube as lâminas à temperatura ambiente em uma câmara umidificada fechada. Deixe-os assentar durante a noite para que a cromatina adira à lâmina.

A coleção de cromatina embrionária descrita foi usada para analisar quantitativamente a formação de cruzamento em oócitos colhidos de embriões C57 pretos/6J. As preparações de disseminação da cromatina da prófase foram imunomarcadas para detectar SYCP3, SYCP1 e MLH1 e coradas com DAPI. Os cromossomos do estágio paquiteno tinham 27 focos MLH1 distribuídos ao longo de 20 estruturas SC totalmente montadas.

Quando a preparação de propagação era abaixo do ideal e os cromossomos individuais eram indistinguíveis, a preparação não foi incluída na avaliação. Em boas preparações, o SMC6 foi enriquecido na região da heterocromatina pericentromérica e ao longo dos braços cromossômicos, e os focos de MLH1 distribuídos ao longo do SC no estágio de paquiteno. O número de cruzamentos positivos para MLH1 de 15 boas preparações do tipo selvagem foi de cerca de 24.

O método de coleta de oócitos foi utilizado para avaliar a morfologia da cromatina em oócitos após a retomada meiótica. A localização de proteínas, bem como a ploidia, foi facilmente avaliada, expondo possíveis causas de erros de segregação cromossômica. A topoisomerase II-alfa pode ser vista ao longo dos braços cromossômicos e da heterocromatina pericentromérica.

Nos oócitos MII, as cromátides irmãs pareadas podem ser distinguidas pela morfologia cromossômica e do centrômero. Uma vez dominadas, essas técnicas sem ou após a cultura podem ser concluídas em uma ou duas horas por camundongo. Após este procedimento, outros métodos complementares, como imunomarcação de oócitos de células inteiras e imagens de células vivas, podem ser realizados para avaliar cromossomos homólogos e cromátides irmãs dentro do contexto da célula.

Coletivamente, os métodos de disseminação da cromatina descritos aqui podem ser facilmente aplicados para avaliar a oogênese de mamíferos e as características sexualmente dimórficas da dinâmica cromossômica e proteica durante a meiose.