Name: Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprenda a preparar espalhamentos de cromatina em oócitos de camundongo para visualizar proteínas ligadas à cromatina e analisar a morfologia cromossômica durante a oogênese. Este método permite imunomarcação clara e avaliação da ploidia.

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Este trabalho foi financiado pelo NIGMS (R01GM11755) para P.W.J e por uma bolsa de subsídio de formação do Instituto Nacional de câncer (NIH) (CA009110) para G.H. e J.H.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Johns Hopkins. Experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6J de tipo selvagem.
1. colheita de ovários Fetal ou Neonatal e preparação da prófase cromatina se espalha
<ol><li>Para extrair os embriões em 14,5 – 19,5 dias post-coitum (dpc) sacrificar as fêmeas grávidas através do deslocamento cervical ou CO2 asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC. Nota: Para os ovários de 1 – 5 dia pós-natal, pule para a etapa 1.3. A Figura 1 resume as fases de prófase meiótica enriquecidas em diferentes idades embrionárias e pós-natal.</li>
	<li>Abra a cavidade abdominopelvic usando uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Dissecar para fora o corno uterino materno, separar os embriões da placenta e transferir os embriões em 35mm placas de Petri contendo 3 mL de pré-aquecido 1x salino de tampão fosfato (PBS) a 37 ° C. Nota: Uma incubadora fliptop definir a 37 ° C pode ser usada para manter a temperatura. Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também pode ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do ovário.</li>
	<li>Com uma tesoura cirúrgica de 3,5 polegadas, sacrifica embriões ou filhotes através de decapitação de acordo com as diretrizes IACUC. Coloque embriões decapitados ou filhotes em PBS pré-aquecido antes da dissecação mais.</li>
	<li>Dissecar um embrião ou filhote de cada vez em um prato de petri 35mm separado contendo 3 mL de PBS pré-aquecido a 37 ° C. Prossiga por corte ao longo da linha mediana ventral da parte posterior do embrião, ao longo da metade anterior abaixo os membros dianteiros e diretamente acima do-patas e cauda, conforme descrito na Figura 2A–B.</li>
	<li>Abra o abdômen com uma tesoura cirúrgica de 3,5 polegadas. Usando pinças de ponta fina deslocar ou remover o fígado e loops de intestino, expondo os ovários em um prato de petri 35mm nova contendo 3 mL de PBS pré-aquecido a 37 ° C (consulte guia Figura 2B). Os ovários estão localizados imediatamente abaixo e atrás do rim em direção à parede posterior da cavidade peritoneal (Fig. 2B-C). Um guia para a diferenciação entre machos e fêmeas gônadas é fornecido na Figura 2D. Nota: Para condições ideais, rapidamente disse para fora dos ovários após a fêmea grávida é sacrificada.</li>
	<li>Remover os dois ovários de cada feto feminino usando um par de pinças de ponta fina sob um escopo de dissecação e coloque em vidros de um relógio ou poços separados de um poço multi placa contendo 0,5 a 1,0 mL de PBS pré-aquecido e mantêm a 37 ° C.</li>
	<li>Coloque cada par de ovários em 0,5 mL hipo-solução tampão (17mm citrato trissódico dihidratado, sacarose 50 mM, 5 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inibidor de protease, pH 8,2) em um vidro de relógio limpo ou um pequeno poço de uma placa de 9-bem, certificando-se de imergir o comp de ovários activaçã. Incube durante pelo menos 15 minutos, mas não mais de 30 min. Nota: Fazer hipo-solução tampão fresco e usar até 2 horas após a adição de TDT.</li>
	<li>Durante a incubação, usando uma barreira hidrofóbica PAP caneta, desenhe dois quadrados de2 22 x 22 mm em um vidro limpo 25 x 75 mm2, 1mm espessura de microscópio como mostrado na Figura 3A. Nota: Os Slides podem ser preparados antes do tempo.</li>
	<li>Pipetar 45 a 50 µ l de sacarose 100 mM numa lâmina limpa e um par de ovários de transferência para a gota.</li>
	<li>Usando as extremidades afiadas de duas agulhas 27 G, arreliar os ovários separados para liberar as células para a solução de sacarose. Com a pinça, Retire pedaços grandes de ovário e pipetar cuidadosamente a solução de sacarose para dispersar as células.</li>
	<li>Lugar de 40 µ l de solução fixador (1% paraformaldeído (PFA), 0,2% de detergente (veja Tabela de materiais), pH 9,2) em cada quadrado do slide preparado. Com uma ponta de pipeta 200 µ l, espalhe a solução fixador uniformemente sobre a superfície do slide.</li>
	<li>Pipete 20 µ l da mistura de sacarose para cada Praça do slide contendo o fixador. Observação: Isso equivale a usar um par de ovários por slide.</li>
	<li>Incube os slides em uma câmara fechada e úmido durante a noite em temperatura ambiente. Nota: A incubação durante a noite pode variar em torno de (12-15 hrs) à temperatura ambiente.</li>
	<li>Abra a tampa da câmara e permitir que os slides secar completamente.</li>
	<li>Lave os slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de solução de PBS agente umectante 0,4% (ver Tabela de materiais) por 2 min, secar ao ar e proceder ao protocolo encontrava (etapa 6). Nota: Pode ser possível armazenar as lâminas a-80 ° C para uso posterior, mas isso varia dependendo da proteína de interesse. Para obter melhores resultados imediatamente no protocolo encontrava (etapa 6).</li>
</ol>2. metáfase eu oócito coleção
<ol><li>Para maximizar o número de folículos antrais isoladas de cada mouse, intraperitonealmente injete camundongos fêmeas virgens sexualmente maduros com 5 UI de gonadotrofina de soro de égua grávida (PMSG, também conhecido como equinos gonadotrofina coriônica (eCG)). Nota: Para o rendimento ideal do oócito, ratos devem ser 1 a 3 meses de idade, como o número de oócitos colhidos irá diminuir com a idade. Para preparar a PMSG, dissolver garrafa de 5.000 UI em 100 mL de PBS estéril (5ml de U/0.1) loja alíquotas de uso único de 600 µ l a-20 ° C.</li>
	<li>Depois de 44 – 48 h, prepare o suporte de coleção, mínimo essencial médio alfa (MEMα) suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS) e 3 mg/mL albumina de soro bovino (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Esterilize a mídia através de um filtro de poro de 0,2 µm. Decante a 2,5 mL de MEMα/BSA/FBS médio em um prato de vidro por rato e aquecido a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 . Nota: Outros coleção e meios de cultura que estão comercialmente disponíveis (M2 e M16) também são comumente usados. Atenção: Recomendamos retirar pratos de cultura 5% CO2 incubadora uma em uma hora de duração limitada minimizar a exposição de ar ambiente durante as etapas de manipulação.</li>
	<li>Sacrifica os ratos através do deslocamento cervical ou CO2 asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC.</li>
	<li>Abra a cavidade abdominopelvic com uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Usando fórceps, deslocar os intestinos na direcção da cabeça do rato. Localize cada corno uterino; os ovários são apresentar proximal para a caixa torácica. Segure o oviduto com pinça fina e cortar a gordura superior para o ovário usando tesouras de dissecação (Figura 4). Continue a segurar o oviduto e com outro conjunto de pinças bem libertar o ovário da bursa e coloque no prato de coleção contendo meio de MEMα/BSA/FBS. Nota: Como na etapa 1, é imperativo a manter os ovários a 37 ° C e em 5% CO2. Uma incubadora de fliptop ligada a 5% CO2 mistura pode ser usada para permitir a manutenção ideal de temperatura e os níveis de CO2 . Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também deve ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do oócito.</li>
	<li>Utilizando uma seringa de 1 mL com agulha de calibre 27 (ou tamanho similar), liberar complexos de cumulus oócito por punção manualmente os grandes folículos antrais.</li>
	<li>Observando-se através de um microscópio de dissecação, recolha ovócitos GV-encenado utilizando uma pipeta de vidro boca-operado ou capilar ou uma manual micrômetro-seringa (Figura 5). Apenas recolha ovócitos que são liberados de folículos antrais. Ovócitos GV tem um diâmetro de aproximadamente 90 µm. ovócitos GV pode ser rodeados por 2-3 camadas de células da granulosa e ter um diâmetro total de cerca de 200 µm.</li>
	<li>Cultura de oócitos em um vidro de relógio limpo ou uma placa de 9 contendo meio de FBS/MEMα/BSA para 6 h chegar a metáfase eu a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 .</li>
	<li>Prossiga para a etapa 4.</li>
</ol>3. metáfase II (MII) oócito coleção
<ol><li>Para maximizar os oócitos isolados de cada mouse, intraperitonealmente injete camundongos fêmeas virgens sexualmente maduros com 5 IU de PMSG. Depois de 44 – 48 h, injete intraperitonealmente com 5 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG). Nota: Para o rendimento ideal do oócito, ratos devem ser 1 a 3 meses de idade, como o número de oócitos colhidos irá diminuir com a idade. Para preparar o hCG, dissolver uma garrafa de 10.000 U em 200 mL de PBS (5ml de U/0.1). Armazenar em alíquotas de uso único de 600 µ l a-20 ° C.</li>
	<li>Após 12-14 hrs, prepare o suporte de coleção de MEMα/BSA/FBS, conforme descrito no passo 2.2, acima.</li>
	<li>Sacrifica os ratos através do deslocamento cervical ou CO2 asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC.</li>
	<li>Abra a cavidade abdominopelvic com uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Usando fórceps, deslocar os intestinos na direcção da cabeça do rato. Localize cada corno uterino, os ovários estão presentes proximal para a caixa torácica. Segure o oviduto com pinça fina e cortar a gordura superior para o ovário usando tesouras de dissecação (Figura 4). Em seguida, remover o ovário e o oviduto e coloque no prato de coleção contendo meio de MEMα/BSA/FBS. Nota: Como nas etapas 1 e 2, é imperativo a manter os ovários a 37 ° C e em 5% CO2. Uma incubadora de fliptop ligada a 5% CO2 mistura pode ser usada para permitir a manutenção ideal de temperatura e os níveis de CO2 . Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também deve ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do oócito.</li>
	<li>Usando uma seringa de 1 mL com um 27 G (ou tamanho similar) ou fórceps em ponto, abrir um buraco da ampola do oviduto para liberar os oócitos MII. Nota: Tenha cuidado para não danificar os oócitos na ampola. A ampola aparecerá inchadas e translúcido, tal que os oócitos são visíveis (Figura 4).</li>
	<li>Colheita MII oócitos da ampola do oviduto para uma nova placa com meio de coleção usando uma pipeta de vidro boca-operado ou capilar ou uma manual micrômetro-seringa (Figura 5).</li>
	<li>Prossiga para a etapa 4.</li>
</ol>4. oócito desnudamento e remoção da Zona pelúcida
<ol><li>Prepare 300 UI/mL de hialuronidase em meio MEMα suplementado com 3 mg/mL BSA para DDE oócitos de em torno de células do cumulus (2.5 mL/mouse) em um vidro de relógio e manter a 37 ° C, 5% de CO2. Nota: Eficácia de hialuronidase diminui acentuadamente após 1h de preparação. Para oócitos MII, hialuronidase tratamento não é necessário.</li>
	<li>Expor a complexos de célula cumulus-oócito a 300 UI/mL de hialuronidase em MEMα/BSA para 3 min para DDE oócitos de em torno de células do cumulus. Cuidado: Não exceda 3 min exposição a hialuronidase, que danificará os ovócitos.</li>
	<li>Para lavar os oócitos, transferência de oócitos para um fresco aquecido prato médio MEMα/BSA. Usando uma pipeta de vidro pequena boca-operado ou capilar (um pouco maior que o diâmetro do ovócito, que é aproximadamente 90 µm), pipetar os complexos acima e para baixo para separar completamente as células do cumulus. Permitir que os oócitos recuperar na incubadora, enquanto se prepara para a próxima etapa.</li>
	<li>Aquecer a solução do ácido Tyrode, MEMα/BSA e mídia do Waymouth a 37 ° C (500 µ l/mouse). Lugar de 300 µ l em cada poço de placas de vidro 9-bem pequeno.</li>
	<li>Para remover a zona pelúcida (ZP) transferi oócitos de 5 – 10 para solução de Tyrode. Expor os oócitos para apenas 30-45 s para a solução. Nota: Muito pouca exposição à solução não irá remover o ZP completamente, que impedirá os oócitos estourando e cromossomos de espalhar. Demasiada exposição irá danificar e matar o oócito. Assistindo o dissolver ZP sob o microscópio de dissecação pode auxiliar na otimização do tempo de exposição. Cuidado: Usando a solução de Tyrode fresco é fundamental, como sua função declina com a idade. Uso um bem fresco de solução de Tyrode para cada grupo de oócitos tratados para garantir a digestão uniforme da ZP.</li>
	<li>Imediatamente após a remoção de ZP, lave os oócitos pela transferência para aquecido médio MEMα/BSA/FBS. Repita essa etapa de lavagem. Nota: Tenha cuidado ao transferir, como oócitos facilmente vão ficar juntos e a pipeta de vidro ou remoção seguinte capilar da ZP. Pre-molhando a pipeta de vidro ou capilar em meio do Waymouth minimizará oócitos coladas.</li>
	<li>Transferência e permitir que os oócitos recuperar durante 30 minutos no meio do Waymouth a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 .</li>
	<li>Prossiga para a etapa 5.</li>
</ol>5. MI e MII oócito cromatina Spreads
<ol><li>Usando uma caneta PAP, desenhe um retângulo de2 de 11 x 44 mm sobre a lâmina de vidro, como mostrado na figura 6A.</li>
	<li>Revestir o slide com uma fina camada de fixador (1% paraformaldeído, 0,2% Triton-X100 em H2O, pH 9,2) por Pipetar 100 µ l de fixador para o slide e balançando o slide e para trás. Toque o slide para se livrar do excesso fixador.</li>
	<li>Buscar entre 5-10 ovócitos com uma agulha de pipeta de boca pequena com como pouco mídia quanto possível e arraste a agulha em linha através do slide fixador-revestido enquanto depositando os oócitos de 1 cm acima do slide na solução de fixador. Execute esta etapa usando um microscópio de dissecação para garantir que os oócitos foram depositados e que eles tem estourado. Nota: Os oócitos devem estourar imediatamente no slide. A altura em que os oócitos são depositados impacto o grau da cromatina se espalhando. Ver resultados representativos na Figura 6 para mais detalhes.</li>
	<li>Incube à temperatura ambiente em uma câmara fechada umidificada durante a noite para permitir que a cromatina aderir.</li>
	<li>Permitir que os slides secar completamente e enxágue slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de 0,4% agente umectante-H2O, pH 8.0.</li>
	<li>Prossiga para a etapa 6.</li>
</ol>6. encontrava
<ol><li>Prepare o tampão de diluição de anticorpo (ADB) descrito na tabela 1.</li>
	<li>Preparar duas Coplin frascos contendo 50 mL de solução-tampão (WB) lavagem (10% ADB diluído em PBS) e uma jarra de Coplin contendo solução de detergente WB e 0,05% 50 mL (por exemplo, adicionar 250 µ l de 10% de detergente para 50ml WB).</li>
	<li>Lave os slides que foram preparados em seção 1 e 5 do presente protocolo por 10 min em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de WB. Atenção: Não seque os slides em qualquer ponto durante a encontrava.</li>
	<li>Lave os slides para 10 min no Coplin frasco contendo 50 mL WB e 0,05% de solução de detergente. Em seguida, lave os slides no restante Coplin frasco contendo 50 mL de solução de WB por 10 min.</li>
	<li>Toque fora slide excesso de líquido e a tampa com 100 µ l de anticorpos primários selecionados diluído em ADB. Incube a 4 ° C durante a noite em uma câmara fechada e úmida. Nota: A incubação pode ser encurtada para 2 a 3 horas a 37 ° C. Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm.</li>
	<li>Lave os slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-PBS, pH 8.0.</li>
	<li>Repita as etapas de 6,2 a 6,5.</li>
	<li>Toque fora slide excesso de líquido e a tampa com 100 µ l de anticorpos secundários selecionados diluído em ADB. Incubar 1 a 2 horas a 37 ° C em uma câmara fechada e úmida.</li>
	<li>Lave slides 2 vezes por 10 min em Coplin frascos contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-PBS, pH 8.0.</li>
	<li>Lave slides 2 vezes por 5 min em Coplin frascos contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-H2O, pH 8.0.</li>
</ol>7. montagem slides
<ol><li>Para prófase cromatina se espalha preparada no passo 2, adicionar 100 µ l de meio de montagem, contendo 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Para MI e MII cromatina se espalha preparado no passo 5, adicionar 50 µ l de meio de montagem contendo DAPI (1.5µg / mL). Delicadamente borre fora excesso de líquido.</li>
	<li>Coloque uma lamela de 22 x 60 mm na parte superior e selar com esmaltes claros. Armazenar em uma caixa de slides em 4 ° C ou a-20 ° C até avaliação através de microscopia de fluorescência. Nota: Toque levemente no deslizamento da tampa para livrar-se de meio de montagem em excesso antes de vedação com esmalte.</li>
</ol>

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<li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocyte+microinjection%2C+maturation+and+ploidy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Preparações de propagação de cromatina permitem aos pesquisadores estudar cronologicamente fêmea mamífera meiose e a localização dinâmica das proteínas envolvidas. Os spreads de cromatina embrionário e neonatal permitem a análise detalhada dos eventos durante a prófase meiótica. Metáfase I e metáfase II propagações de cromatina podem ser usadas para distinguir a única irmã cromátides irmãs de emparelhado irmãs e cromossomos homólogos emparelhados, bem como avaliar a ploidia. Em comparação, o protocolo descrito aqui pode ...

Durante a espermatogênese, grandes ondas semisíncronas de meiose células germinativas são uma reposta rápida e continuamente, no testículo no início da puberdade e ao longo da vida adulta1. Em contraste com os machos, meiose em fêmeas é iniciada somente durante o desenvolvimento fetal. Após o nascimento, oócitos permanecem presos em um estágio de Dictióteno prolongada da prófase I com uma intacta vesícula germinal (GV; envelope nuclear) até a puberdade. No início da puberdade, um subconjunto de ovócitos ciclicamente são selecionados para sofrer o crescimento e maturação, marcando o início da retomada meiótica. Meiótica retomada em oócitos já crescidos manifesta-se pelo desaparecimento do GV em um processo conhecido como vesícula germinal avaria (GVBD). O oócito então sofre condensação cromossomo e segregação, seguido por extrusão de corpo polar. Oócitos tornar-se preso em cima de progressão para MII e são estimulados para completar a segunda e última divisão meiótica somente após a fertilização.
Fertilidade feminina é altamente dependente do sucesso da prófase meiótica eu progressão. Chave para isso é a formação de uma ligação física entre cromossomos homólogos, conhecido como o chiasmata, que é mediada pela reparação de quebras da cadeia dupla induzidas DNA (DSBs) através de de recombinação de cruzamento2. Este processo ocorre dentro do contexto de um andaime ricos em proteínas dinâmico, conhecido como o complexo de synaptonemáticos (SC) que se forma entre os cromossomos homólogos para facilitar sua sinapse3. A SC é uma estrutura tripartida do zipper-como que consiste de dois elementos laterais paralelos conectados por proteínas da região central que detém homologs juntos ao longo de reparo de ADN em curso. Antes da sinapse, precursores dos elementos laterais, chamados de elementos de axiais, formam-se entre irmã cromátides irmãs. Synaptonemáticos complexo proteínas tais como SYCP2 e SYCP3 formam elementos axiais que colocalize para os eixos de coesão cromátide-irmã durante a prófase inicial. Estes mais tarde serve como ligação locais para a proteína de filamento transversal, SYCP1, o que facilita a montagem do elemento central e sinapse entre homologs alinhado4. Em oócitos de rato, synapsis completa é indicado pela presença de 20 completamente sobreposição de trechos de SYCP3 e SYCP1, que podem ser visualizados usando cromatina espalhar os preparativos. Sinapse é concluído com a entrada no subestágio paquíteno, segundo o qual os crossovers maduros que estão destinados a chiasmata forma entre homologs estão decorados com mutL dímeros de homólogo (MLH1/3) para promover sua transformação precisos5,6 , 7. a manutenção estrutural dos complexos de cromossomos (SMC), incluindo cohesin, nÃ e o SMC5/6 complexos, são importantes para a regulação da dinâmica do cromossomo e estrutura em toda a meiose8,9, 10,11,12. Coletivamente, esses eventos garantir bi-orientação correta dos cromossomos homólogos para opostas polos do eixo após a desmontagem do SC.
O ciclo celular meiótico é um poderoso modelo para examinar os papéis de várias proteínas na manutenção do genoma devido a indução programada e subsequente reparação de DNA DSBs. Além disso, a meiose mamíferos é também um modelo relevante para o estudo das alterações epigenéticas e imprinting genômico13. No entanto, é tecnicamente difícil de avaliar esses eventos durante a meiose feminina, que terá lugar nos ovários fetais e Neonatais em mamíferos (Figura 1). Prófase, que pode ser dividida em 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema e Dictióteno. Aqui, descrevemos como isolar e distinguir entre fetais e Neonatais ovários e testículos (Figura 2). Adaptado de métodos anteriormente descritos, este manuscrito também descreve um protocolo (etapa 1), com vídeo de demonstração para a preparação da prófase meiótica feminino eu cromatina espalha14,15,16,17 . Quando acoplado com encontrava, como descrito nos passos 6-7, este protocolo permite análise microscópica detalhada da prófase eu eventos em oócitos.
A ovogênese é propenso a erros e eventos de missegregation do cromossomo durante a primeira divisão meiótica representam a fonte mais comum de doença genética na descendência18,19. Este manuscrito (etapa 2 do protocolo), descrevemos um protocolo no qual oócitos maduros GV-encenado são extraídos aprontados ovários de camundongos fêmeas adultos. Sob condições de apoia, já crescidos oócitos submeter-se independente de hormônio luteinizante retomada da meiose após isolamento e cultura20. Após retomada meiótica, oócitos progridem através da meiose, em seguida, prendam na metáfase II. Oócitos permanecem presos em metáfase II, a não ser fertilizado. Nas etapas 2 a 5, adaptamo-nos protocolos anteriormente relatados com vídeo de demonstração para descrever como coletar, cultura e preparar MI e MII oócitos por cromatina espalhar preparações21. Esta cromatina espalhando técnica permite encontrava clara de proteínas associadas com cromossomos. Além disso, esse protocolo também pode ser usado para distinguir entre cromossomos bivalentes e univalentes e ainda mais pode resolver a única irmã cromátides irmãs para facilitar a avaliação da ploidia de ovócitos. Portanto, além de revelar os padrões de localização de proteínas meióticas, esse protocolo também pode servir como uma ferramenta inestimável para elucidar as causas potenciais de missegregation do cromossomo durante MI e MII.

<table><tbody><tr><td>10X Phosphate tamponed salina (PBS) pH 7.4</td><td>Qualidade Biológica</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm placas de Petri</td><td>Denville</td><td>T1106</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 12mm</td><td></td><td>Pinças finas VWR</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de micro dissecação</td><td>Ted Pella</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Dissecando&nbsp; tesoura, ponta afiada, 41/2"</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de relógio quadrado 1 5/8</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>742300</td><td>Autoclave antes de cada uso</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Citrato Trissódico Di-hidratado</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>Adicionar ao tampão hipotônico imediatamente antes do uso</td></tr><tr><td>50x Inibidor de Protease</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Adicionar ao tampão hipotônico imediatamente antes do uso</td></tr><tr><td>Seringa de turberculina com agulha (1cc, 27 G x 1/2 pol)</td><td>Becton, Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de vidro ultra frost com selo dourado (25X75mm, 1mm de espessura)</td><td>Thermo</td><td>3063-002</td><td></td></tr><tr><td>Caneta Super PAP, grande (bloqueador de líquidos)</td> <td>Microscopia Eletrônica Ciências (EMS)</td> <td>71310</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído aquoso</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências (EMS)</td> <td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergente no manuscrito</td></tr><tr><td>Câmara de umidade de manchas imunológicas</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Coplin</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Photo-flo 200</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>74257</td><td>Agente umectante em manuscrito</td></tr><tr><td>Gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>Armazenar alíquotas a -20C</td></tr><tr><td>Gonadotrofina coriônica humana (HCG)</td><td>Sigma</td><td>C0434</td><td>Armazenar alíquotas a -20C</td></tr><tr><td>Placas de ponto PYREX com nove cavidades côncavas</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>Autoclave antes de cada uso</td></tr><tr><td>Capilar de vidro</td><td>Fisher</td><td>22260943</td><td>Para fazer agulhas de coleta de oócitos</td></tr><tr><td>Marca Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>BR701501</td><td>Para fazer agulhas de coleta de oócitos</td></tr><tr><td>Tubo de borracha de látex (3,2 mm de diâmetro interno x 6,4 mm de diâmetro externo)</td> <td>Fisher</td><td>14-178-5B</td><td>Para fazer agulhas</td></tr> <tr><td>de coleta de oócitosTubo de borracha de látex (6,4 mm de diâmetro interno x 11,1 mm de diâmetro externo)</td> <td>Fisher</td><td>14-178-5D</td><td>Para fazer agulhas de coleta de oócitos</td></tr><tr><td>Porta-objetivas de borracha de silicone flexível, bocal de plástico rígido e 15 polegadas de tubo de látex</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>Para fazer agulhas de coleta de oócitos</td></tr><tr><td>Cabeça micrométrica Mitutoyo</td><td>Mituoyo</td><td>150-208</td><td>Para fazer agulhas de coleta de oócitos</td></tr><tr><td>Seringa 5 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td>Para fazer agulhas de coleta de oócitos</td></tr><tr><td>Filtro de seringa 0.45 &mu; m filtro</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>Para fazer agulhas de coleta de oócitos</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de vidro 5 3/4 "</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Para fazer agulhas de coleta de oócitos</td></tr><tr><td>83 x 0,5 mm ponta de pipeta</td><td>Denville</td><td>P3080</td><td>Para fazer agulhas de coleta de oócitos</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>mídia de Waymouth</td> Life <td>Technologies</td><td></td><td></td>11220035</tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Fisher</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A3311</td><td>Para meios de cultura de oócitos</td></tr><tr><td>500ml unidades de filtro 0.22um</td><td>Denville</td><td>F5227</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode ' s solução</td><td>Sigma</td><td>T1788</td><td>Armazene alíquotas a -20C</td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td>Para ADB/tampão de lavagem</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td>Para ADB/tampão de lavagem</td></tr><tr><td>Meio de montagem anti-desbotamento VECTASHIELD com DAPI</td><td>Lâminas de cobertura de microscópio Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>(22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte transparente</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número do Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Microscópios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Anticorpos Primários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MLH1</td><td>Life Technologies</td><td>MA5-15431</td><td>Fator de diluição- 1:100</td></tr><tr><td>Coelho anti-SYCP1</td><td>Life Technologies</td><td>PA1-16763</td><td>Fator de diluição - 1:1000</td></tr><tr><td>Cabra anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>Fator de diluição - 1:50</td></tr><tr><td>Proteína anticentrômero humana</td><td>Anticorpos incorporados</td><td>15-235</td><td>Fator de diluição - 1:100</td></tr><tr><td>Coelho anti- TOPOII</td><td>Abcam</td><td>ab109524</td><td>Fator de diluição - 1:100</td></tr><tr><td>Camundongo anti-histona H4 (di metil K20, tri metil K20)</td><td>Abcam</td><td>ab78517</td><td>Fator de diluição - 1:500</td></tr><tr><td>Coelho anti-Rec8</td><td>Cortesia da Dra. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>Fator de diluição - 1:10.000</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Anticorpos secundários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-cabra IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugado</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11057</td><td>Fator de diluição - 1:500</td></tr><tr><td>Burro anti-rato IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>Fator de diluição - 1:500</td></tr><tr><td>Burro anti-coelho IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugado</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-31573</td><td>Fator de diluição - 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra (H + L) Alexa Fluor 568 conjugado</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td>Fator de diluição - 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-humano de cabra (H + L) Anticorpo secundário de adsorção cruzada, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11013</td><td>Fator de diluição - 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra (H + L) Alexa Fluor 568 conjugado</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>Fator de diluição - 1:500</td></tr></tbody></table>

preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase ii

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Técnicas de propagação de cromatina foram amplamente utilizadas para avaliar a localização dinâmica de várias proteínas durante a gametogênese, particularmente para a espermatogênese. Essas técnicas permitem para visualização dos padrões de localização de DNA e proteína durante eventos meióticos como cromossomos homólogos emparelhamento, synapsis e DNA de reparação. Enquanto alguns protocolos têm sido descritos na literatura, técnicas de propagação de cromatina geral usando oócitos mamíferos prófase são limitadas e difícil devido a hora de início da meiose em ovários fetais. Em comparação, espermatócitos prófase podem ser coletados de ratos machos juvenis com rendimentos mais elevados, sem a necessidade de microdissection. No entanto, é difícil obter uma população sincronizada pura de células em estágios específicos devido à heterogeneidade das populações meiótica e pós meiótica de células germinativas do testículo de jovens e adulto. Para fases posteriores da meiose, é vantajoso para avaliar oócitos passando por meiose I (MI) ou meiose II (MII), porque grupos de oócitos maduros podem ser colhidos em ratos fêmeas adultos e estimulados a retomar a meiose em cultura. Aqui, métodos para preparações de cromatina meiótica espalhar usando oócitos dissecado de fetal, neonatal e adultos ovários são descritos com demonstrações em vídeo de acompanhamento. Eventos de missegregation cromossomo em oócitos mamíferos são frequentes, particularmente durante MI. Estas técnicas podem ser usadas para avaliar e caracterizar os efeitos de mutações diferentes ou exposições ambientais durante várias fases da oogénese. Como existem diferenças distintas entre a ovogênese e espermatogênese, as técnicas descritas dentro são de valor inestimáveis para aumentar nossa compreensão da oogénese mamíferos e as características sexualmente dimórficas de cromossomo e proteína dinâmica durante a meiose .

Descrevemos duas técnicas para visualizar e avaliar os cromossomos meióticos em oócitos. A primeira técnica é servida para avaliar a progressão da prófase em ovários embrionários e Neonatais. Prófase cromatina propagação preparações são incrivelmente valiosas para a visualização de numerosos processos dinâmicos durante a meiose, incluindo cromossomo emparelhamento, synapsis e desynapsis, recombinação homóloga e epigenético cromossomo remodelação. Aqui, temos demonstrado a utilidade desse ...

Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

O objetivo geral desta preparação de propagação da cromatina é visualizar cronologicamente os padrões de localização dinâmica de proteínas ligadas à cromatina e morfologia cromossômica de oócitos ao longo da oogênese de mamíferos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia reprodutiva feminina, como emparelhamento cromossômico homólogo, sinapse, reparo de DNA e segregação cromossômica meiótica. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a imunomarcação clara e a visualização de proteínas associadas aos cromossomos e a avaliação da ploidia oocitária.A oogênese é propensa a erros e a segregação incorreta dos cromossomos geralmente resulta em doenças genéticas. Este método pode ser usado para melhorar nossa compreensão das causas maternas de aneuploidia e infertilidade. Depois de sacrificar um camundongo fêmea de 14 a 19 dias após o coito, faça uma abertura em forma de V na cavidade abdominopélvica.Em seguida, remova o corno uterino materno. Em seguida, separe os embriões da placenta e sacrifique os embriões por decapitação. Em seguida, transfira-os para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo três mililitros de PBS a 37 graus Celsius.Em s

chromatin-spread-preparations-for-analysis-mouse-oocyte-progression

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Aqui apresentamos um protocolo para a caracterização de oócitos antrais de rato com base na organização nucleolar.

Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

Apresentamos protocolos para coleta, preparação e imagem de oócitos maduros de Drosophila. Esses métodos permitem a visualização do comportamento cromossômico e da montagem e função do fuso durante a meiose.

Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; oócitos

Este manuscrito descreve uma abordagem experimental para caracterizar morfologicamente e bioquimicamente ovócitos de cavalo. Especificamente, o presente trabalho ilustra como recolher ovócitos de equídeos imaturos e maduros por captação de óvulos guiados por ultra-som (OPU) e como investigar a segregação cromossómica, a morfologia do fuso, a acetilação das histonas globais ea expressão de mRNA.

Análise da segregação cromossômica, acetilação de histona e morfologia do fuso em ovócitos de cavalo

Meiose é o processo de desenvolvimento pelo qual gâmetas são formadas através de uma única rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação do cromossomo. Mamíferos meiose pode ser examinado, utilizando uma técnica para preparar os cromossomas se espalha. Aqui, vamos demonstrar um método de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.

Preparação de cromossomas se espalha a partir do Mouse espermatócitos

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar o impacto físico do citoesqueleto na forma nuclear e nas organelas sem membrana interna no sistema oócito de camundongos. A estrutura pode ser adaptada para uso em outros tipos de células e contextos.

Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais

Erros meióticos nas sinapses e recombinação são comuns aos oócitos de mamíferos. A análise rigorosa das proteínas envolvidas nesses processos é essencial para entender como e por que a oogênese geralmente dá errado. As técnicas apresentadas aqui permitem o monitoramento abrangente da recombinação e sinapses para avaliar a qualidade do oócito em camundongos.

Preparação de Spreads Cromossômicos Meióticos de Oócitos de Camundongos para Avaliação de Sinapse e Recombinação

Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.

Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

Aprenda a preparar espalhamentos de cromatina em oócitos de camundongo para visualizar proteínas ligadas à cromatina e analisar a morfologia cromossômica durante a oogênese. Este método permite imunomarcação clara e avaliação da ploidia.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

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