Um método eficiente em Vitro transposição por um sistema de beleza dormindo Transcriptionally regulado empacotado em um vetor de Lentivirus defeituoso de integração

O objetivo geral deste método é alcançar a integração estável de um gene de interesse no genoma humano de células primárias pelo sistema da Bela Adormecida regulado transcricionalmente empacotado em vetores lentivirais defeituosos de integração. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da terapia genética, como a integração do gene de interesse em células primárias usando o sistema Sleeping Beauty. As principais vantagens dessa técnica é que o sistema hiperativo induzível da Bela Adormecida está fornecendo células primárias resistentes a vários métodos de transfecção.

Demonstrando o procedimento estará Daniela Benati, pós-doutoranda em meu laboratório. Antes do dia da transdução, os queratinócitos primários humanos são cultivados conforme descrito no protocolo de texto. Para separar queratinócitos subconfluentes em cultura, remova o meio, lave as células com 1X PBS e adicione um mililitro de solução de trabalho de tripsina pré-aquecida a cada poço.

Incubar a 37 graus Celsius por 15 minutos na incubadora de cultura de células. Ressuspenda completamente as células de um poço e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga contendo dois mililitros de meio contendo soro. Enxágue o poço uma vez com três mililitros de PBS 1X e adicione a solução enxaguada ao tubo da centrífuga com a suspensão da célula.

Centrifugar a 580 vezes g durante cinco minutos e rejeitar o sobrenadante. Lave as células com cinco mililitros de PBS 1X, centrifugue a 580 vezes g por cinco minutos e descarte o sobrenadante. Em um tubo de polipropileno de 15 mililitros, diluir 1,6 vezes 10 até o quinto queratinócitos em um mililitro de meio CFAD.

Preparar uma diluição para cada condição. Os três vetores Lentivirais Defeituosos de Integração ou IDLV foram preparados anteriormente, conforme descrito no protocolo de texto. O IDLVTKSB carrega as transposições SB100X hiperativas reguladas por TET.

IDLVrtTA codifica o modulador e IDLVT2 carrega o gene de interesse. GFP neste exemplo ladeado por repetições invertidas de transposon. Diluir os vetores lentivirais em um mililitro de meio CFAD na presença de 20 microlitros de polibreno, conforme indicado nesta tabela.

Um, dois e três são controles negativos sem vetores. Quatro e cinco contêm IDLVTKSB e IDLVrtTA. Seis, sete, oito e nove contêm todos os três vetores lentivirais.

Transduzir as células em suspensão adicionando cada diluição do vetor lentiviral à suspensão de queratinócitos correspondente. Remova o meio das células alimentadoras 3T3-J2 letalmente irradiadas que recuaram há um dia e coloque os queratinócitos transduzidos nelas. Depois de transduzir um poço, prossiga com o próximo.

Incube a 25 graus por 30 minutos. Em seguida, transfira as células para 37 graus por seis horas. Após seis horas, adicione um mililitro de meio CFAD a cada poço.

Adicione um micromolar de doxiciclina aos poços cinco, oito e nove. Retorne as células a 37 graus Celsius. Em seguida, processe as células em cada poço conforme descrito no protocolo de texto.

Para análise citofluorimétrica, os queratinócitos primários transduzidos destacados no terceiro e sexto dia devem ser discriminados da camada de alimentação 3T3-J2, marcando as células com anticorpo antialimentador conjugado APC monoclonal de camundongo. Prepare quatro mililitros de tampão de coloração para cada amostra combinando 5% de FBS, 500 milimolares de EDTA e 1X PBS. Lave as células destacadas com um mililitro de tampão de coloração.

Centrifugar a 580 vezes g durante cinco minutos e rejeitar o sobrenadante. Em um tubo para aquisição de citometria de fluxo, ressuspenda cinco vezes 10 até a quarta célula em 100 microlitros de tampão de coloração. Adicione dois microlitros de anticorpo antialimentador na diluição de um a 50 e misture bem.

Incube no gelo no escuro por 30 minutos. Após 30 minutos, lave com dois mililitros de tampão de coloração. Centrifugar a 580 vezes g durante cinco minutos.

Descarte o sobrenadante e ressuspenda em 200 microlitros de tampão de coloração. Use um citômetro de fluxo configurado com um laser azul, um laser vermelho e filtros para detecção de fluorescência GFP e APC para adquirir sinais APC e GFP. A fração de células GFP positivas da população de células negativas da APC indica queratinócitos transduzidos.

Para realizar a PCR em tempo real, configure as reações em triplicado em uma placa de 96 poços em um volume final de reação de 25 microlitros. Cada reação contém um microlitro de cDNA, 12,5 microlitros de mistura principal 2X, 1,25 microlitros de primers em mistura de sonda 20X e 10,25 microlitros de água estéril. Execute PCR em tempo real de acordo com este programa de PCR, um ciclo a 95 graus Celsius por 10 minutos, depois 40 ciclos de 95 graus Celsius por 15 segundos e 60 graus Celsius por um minuto e mantenha a quatro graus Celsius.

Por fim, analise os dados de PCR em tempo real conforme descrito no protocolo de texto. A análise da expressão de células HeLa transduzidas com doses crescentes de transposições em vetores moduladores mais ou menos doxiciclina mostrou que altas doses de ambos os IDLVs foram necessárias para induzir fortemente a expressão de SB100X. A análise quantitativa da expressão de SB100X em células HeLa transduzidas com o vetor transposto na presença ou ausência do vetor modulador revelou uma ativação oito vezes maior sobre o fundo na presença de doxiciclina.

O sistema da Bela Adormecida regulado transcricionalmente também pode ser usado em células primárias. A expressão de SB100X em queratinócitos transduzidos com transposições e vetores moduladores mostrou uma ativação de 15 vezes no estado desligado. O experimento de transposição realizado em queratinócitos transduzidos com os três vetores IDLV mais ou menos doxiciclina indicou que 12% das células tratadas com doxiciclina integraram de forma estável pelo menos uma cópia de GFP em seu genoma.

Uma vez dominada, a transdução vital em células primárias pode ser feita em oito horas, a análise citofluorimétrica em duas horas e a análise de expressão em três horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar a combinação de dose de vetor usada para transduzir células primárias e atingir o nível de expressão mais alto das transposições induzíveis da Bela Adormecida. Após este procedimento, outros métodos, como PCR quantitativo e PCR mediado por ligante, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como número de cópias de transposon por célula e integração para arquivamento do genoma.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o pesquisador no campo da terapia gênica explorar a aplicação do sistema da Bela Adormecida na engenharia de células clinicamente relevantes. Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transduzir primeiro os queratinócitos primários com os vetores IDLV. Em segundo lugar, medir a expressão de transposições hiperativas na condição de doxiciclina e, finalmente, seguir a transposição por citometria de fluxo.

Não se esqueça de que trabalhar com vetores virais pode ser extremamente perigoso, portanto, precauções como BCL para conter o nível e o suprimento descartável devem sempre ser levadas com você durante a execução desses procedimentos.