Visualizando intracelular SNARE tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem

O objetivo geral deste experimento é visualizar a formação complexa de proteínas SNARE em células vivas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de tráfego de membrana, como identificar os conjuntos de proteínas SNARE que catalisam as etapas específicas de tráfego de organela. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização direta de locais celulares onde os SNAREs se envolvem em formação complexa.

Neste experimento, 900.000 células HeLa divididas entre três tubos Eppendorf são usadas para transfecção. Transfecte as células conforme descrito no protocolo de texto com as seguintes construções. Amostra número um com a construção mCitrine da sintaxinina-4, amostra número dois com a sintaxinina-4 mCitrine e VAMP3-mCherry e amostra número três com sintaxinina-3 fundida a mCitrine e mCherry.

Cultive as células transfectadas em DMEM com alto teor de glicose fornecido com 10% FCS e antibiótico antimicótico 1% a 37 graus Celsius com 5% de CO2 em uma incubadora de cultura de células durante a noite. No dia seguinte, aspirar o meio e lavar as células uma vez com meio de imagiologia de células vivas durante dois minutos. Depois disso, coloque as células em meio de imagem fresco.

Para iniciar este procedimento, coloque a amostra número dois a 37 graus Celsius, em um estágio aquecido, sob um microscópio confocal de imagem de fluorescência no domínio do tempo com uma fonte de excitação pulsada para o fluoróforo doador e aquisição de dados resolvida no tempo. Antes de cada microscopia de imagem de fluorescência ou medição FLIM, selecione uma célula com expressão visível das proteínas SNARE marcadas com mCitrine e mCherry e registre uma imagem confocal de 256 por 256 pixels com excitação simultânea de ambos os fluoróforos. Grave uma imagem FLIM clicando em executar FLIM com a imagem FLIM sendo gravada com as mesmas dimensões e resolução espacial da imagem confocal gravada anteriormente.

Registre a imagem com pelo menos 50.000 fótons para análise FLIM de célula inteira ou pelo menos 400 fótons por pixel. É importante registrar as medições FLIM a pelo menos um micrômetro de distância da superfície do vidro para evitar uma visão de reflexão. Repita a imagem de várias células na amostra número dois e para células na amostra número um e na amostra número três.

Em seguida, coloque uma lamínula de vidro limpa na platina do microscópio para registrar uma função de resposta do instrumento ou IRF. Sintonize o monocromador do detector de emissão para o comprimento de onda de excitação e clique no botão executar FLIM para gravar uma imagem FLIM com o retroespalhamento da lamínula de vidro. As gravações de fotos serão convertidas em imagens FLIM com o software de conversão PT32ICS.

Configure o software. Defina a saída como ImageJ para gerar imagens FLIM. Defina o tamanho da imagem para 256 por 256 pixels e o canal para dois.

Pressione convert e carregue um ou mais traços de fótons. Mantenha a tecla de controle pressionada para selecionar vários traços de fótons. As imagens FLIM devem ser geradas na mesma pasta onde os traços de fótons são salvos.

Comece abrindo o programa de software de análise de dados capaz de se adequar à deconvolução. Importe o arquivo de texto que contém o histograma para cada traço de fóton. Reorganize a tabela de forma que o IRF fique na segunda coluna da tabela, ao lado dos valores de tempo na coluna A.Determine a qualidade dos traços de fótons gravados selecionando todas as colunas.

Não analise traços de fótons com um pico de reflexão alto. Um exemplo é mostrado aqui. Use a tecla control para selecionar todas as colunas que contêm os histogramas de tempo de vida com controle de qualidade que serão ajustados, bem como o IRF na coluna B, e carregue o ajuste não linear.

Carregue a função de ajuste descomplicado adicionando-a ao software de análise. Selecione o arquivo de função de ajuste. Esta função se ajusta aos histogramas de tempo de vida de fluorescência com uma função de decaimento exponencial mono deconvoluta com o IRF.

Execute o dimensionamento do eixo X das curvas ajustadas. Ajuste as curvas pressionando ajustar. Isso converterá o ajuste e gerará uma folha de relatório na matriz com a tabela contendo os deslocamentos e amplitudes de vida de fluorescência.

Ele também gerará uma folha de dados com as curvas ajustadas e os resíduos do ajuste. São mostradas imagens confocais representativas de helocélulas que expressam apenas a sintaxina quatro mCitrine, snytaxin quatro mCitrine com VAMP3 mCherry ou a sintaxina três mCitrine mCherry construção tandem. Nessas imagens de tempo de vida de fluorescência que acompanham, a cor indica o tempo de vida fluorescente aparente médio.

As imagens foram então contorcidas com as intensidades de fluorescência do fluoróforo doador mCitrino. A seguir estão as mesmas imagens com ajuste com funções de decaimento bi-exponencial. As cores dos pixels indicam as frações estimadas da sintaxina quatro em complexo com VAMP3.

A função de resposta do instrumento da configuração foi medida usando o retroespalhamento na interface de água de vidro. Os histogramas de tempo de vida de células inteiras são mostrados para células que expressam apenas a sintaxina quatro mCitrine, co-expressando a sintaxina quatro mCitrine com VAMP3 mCherry e expressando a sintaxina três mCitrine mCherry construção em tandem. O painel E mostra uma sobreposição das curvas de decaimento dos painéis B, C e D. Os inlays mostram os mesmos gráficos, mas com escala logarítmica do eixo Y.

Um histograma fluorescente de vida útil registrado muito perto da superfície da lamínula do microscópio resultou em um grande pico de reflexão, representado pela área sombreada em amarelo. Por fim, é mostrado um histograma de tempo de vida com ajuste representativo com função de decaimento bi-exponencial. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a quatro horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de registrar várias células, enquanto os níveis de expressão do doador e do interceptor SNARES podem influenciar o tempo de vida. Seguindo este procedimento, as células podem ser ativadas para responder a perguntas específicas do tipo de célula relacionadas ao reenraizamento do tráfego de membrana mediado por SNARE. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do tráfego de membranas explorarem as vias intercelulares do tráfego de organelas em todas as células eucarióticas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como registrar e analisar os dados FLIM. Não se esqueça de que trabalhar com organismos geneticamente modificados e lasers de alta potência pode ser extremamente perigoso e precauções, como luvas e protetores oculares, devem sempre ser tomadas ao tentar este procedimento.