Name: Visualizando intracelular SNARE tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprenda a visualizar a formação de complexos de proteínas SNARE em células vivas usando microscopia FLIM. Esta técnica permite observar diretamente os locais celulares onde ocorre o tráfego de membranas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Hypatia da Radboud University Medical Center, um prêmio de desenvolvimento de carreira do programa ciência humana da fronteira, a gravitação Programa 2013 da organização de países baixos para a investigação científica (NWO; ICI-024.002.009), um VIDI conceder da NWO (ALW VIDI 864.14.001) e uma bolsa a partir do Conselho Europeu de investigação (CEI), no âmbito do sétimo programa-quadro da União Europeia (Grant acordo número 336479).

1. preparação das amostras, microscópio
<ol>
	<li>Expressão de Qa-SNARE syntaxin 4 fundido ao mCitrine (syntaxin 4-mCitrine; fluoróforo dador) e o R-SNARE VAMP3 fundido ao mCherry (VAMP3-mCherry) Nota: Também podem ser usadas outras armadilhas com proteínas fluorescentes fundidas para suas hélices transmembranares do C-terminal. Em vez de mCitrine-mCherry, outros pares doador-aceitador de fluorophores espectralmente separado também podem ser usado (por exemplo, PCP-YFP).<ol>
		<li>Desenvolvem-se células HeLa e dividir 900.000 células HeLa sobre três 35 mm de diâmetro vidro inferior pratos para microscopia. Nota: Em princípio, este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de células eucarióticas e pratos de microscopia.<ol>
			<li>Manter as culturas de células HeLa T75 frascos com 10 mL de glicose alta Dulbecco é suplementado da águia modificado (DMEM), com 10% de soro fetal bezerro (FCS) e 1% antibiótico antimicótico (contendo anfotericina B, penicilina e estreptomicina) a 37 ° C e 5% CO 2 em uma incubadora de cultura de células.</li>
			<li>Reabastecer o médio duas vezes por semana e dividir as células 01:10, uma vez por semana ou quando as células atingem 85-90% de confluencia de novos frascos T75 (500.000 células/balão, em média).</li>
			<li>Retire o DMEM e lave as monocamadas de HeLa duas vezes com 8 mL de tampão fosfato solução salina estéril (PBS) por 3 min.</li>
			<li>Remover a PBS e adicionar 2 mL de PBS com ácido de 2mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).</li>
			<li>Incube as celulas por 5 min a 37 ° C e 5% CO2 incubadora de cultura celular e posteriormente levemente agitar o frasco para separar as células HeLa da parte inferior do frasco.</li>
			<li>Expulsar as células com 10 mL de meio, transfira a suspensão para um tubo de 15 mL e retirar uma alíquota de 10 µ l para a contagem.</li>
			<li>Diluir a 1:1 com mancha de azul de Tripan 0,4% alíquota e contar as células com uma Bürker hemocytometer9. Nota: Contar duas 4x4 praças e múltiplas o número de células por 10.000 para o número de células/mL.</li>
			<li>Depois de célula contando, tomar 900.000 células do tubo de 15 mL, dividi-los sobre os pratos de fundo de 3 vidro (consulte a etapa 1.1.1) e prepare-se para transfeccao.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Transfect as células por eletroporação10 (ver Tabela de materiais) com syntaxin 4-mCitrine construção (doador somente, amostra #1), syntaxin 4-mCitrine, juntamente com VAMP3-mCherry (amostra #2) e syntaxin 3 fundido a (ambos mCitrine e mCherry Exemplo #3). Nota: Outros métodos de transfecção celular também podem ser usado11. A construção em tandem na amostra #3 é um controlo positivo para estimar o mais curto tempo de vida expectável (i.e., FRET expectable máxima).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cultura que das células durante a noite em alta glicose DMEM fornecido com FCS de 10% e 1% de antibiótico antimicótico a 37 ° C com 5% CO2 em uma incubadora de cultura de células.</li>
	<li>DMEM de aspirar e lavar as células uma vez com célula viva imagem médio (140 mM de NaCl, 2,5 mM KCl, CaCl2de 1.8 mM, 1 mM MgCl2, 20mm HEPES, pH = 7,4, mOsm = 300; ver Tabela de materiais) por 2 min e posteriormente colocar as células em imagem fresca médio.</li>
</ol>
2. a gravação dos dados FLIM
<ol>
	<li>Colocar amostra #2 no domínio do tempo FLIM confocal microscópio com uma fonte de excitação pulsante para o fluoróforo dador (ou seja, mCitrine) e aquisição de dados tempo-resolvido. Manter as células a 37 ° C, com uma fase aquecida. Nota: O microscópio confocal utilizado neste protocolo é equipado com um objectivo de imersão água at 63 X 1,20, um laser de luz pulsado branco (80 MHz pulsando, &lt; duração do pulso de 100 picosegundo), um tubo de multiplicador de fóton (PMT) e um Time-Correlated único fóton contando (TCSPC ) sistema (consulte Tabela de materiais para instalação específica usada). Outros microscópios FLIM também podem ser usado (por exemplo, diodos de avalanche de fóton único (SPAD) em vez de PMTs, lasers pulsados de single-comprimento de onda em vez de um laser pulsado de luz branca).</li>
	<li>Selecione uma célula com a expressão visível da mCitrine e proteínas SNARE mCherry-labeled e gravar uma imagem confocal de 256 × 256 pixels com excitação simultânea de dois fluorophores antes de cada medição FLIM. Um passo de pixel de cerca 2 dobras menores do que a difração limitada resolução espacial, do microscópio (~ 200 nm) deve ser usado. Para mCitrine, excitar a 516 nm e emissão cobrar de 521-565 nm; para mCherry, excite em 610 nm e coletar a emissão de 613-668 nm. Nota: Fazer não posição o avião de imagens muito perto para o fundo do prato (dentro de ~ 2 µm de distância), pois isso resultará em um pico de reflexão no histograma do tempo de vida de fluorescência. Excitação simultânea do doador e aceptor fluorophores é preferida, como este permite para superar o problema potencial do movimento da amostra. No entanto, a excitação sequencial pode ser usada também.</li>
	<li>Registro de uma imagem FLIM clicando Executar FLIM com a imagem FLIM sendo gravada com as mesmas dimensões e resolução espacial, como a imagem confocal gravada no passo 2.2. Grave os fótons da imagem pelo menos 50.000 para análise FLIM de célula inteira, ou pelo menos 400 fótons/pixel. Só excitar o fluoróforo dador de mCitrine e não o fluoróforo aceitador de mCherry e assim excitar em 516 nm e coletar a emissão de 521-565 nm.</li>
	<li>Repita os passos 2.1-2.3 para várias células e para a outra amostra #1 (doador somente) e amostra #3 (construção de conjunto de mCitrine-mCherry).</li>
	<li>Grave uma função de resposta do instrumento (IRF). Sintonizar o monocromador do detector de emissões para o comprimento de onda de excitação (por exemplo, registro de emissão de 510-550 nm) e em seguida, gravar uma imagem FLIM com o espalhamento volta de uma lamela de vidro limpo, clicando no botão Executar FLIM. Use o mesmo comprimento de onda de excitação (516 nm) e laser de potência, usado para a gravação dos dados célula passos 2.1-2.4. Nota: Se vários picos são visíveis no IRF ou se não pode ser sintonizado a emissão monochromators, IRF pode também ser medido com uma solução de corante fluorescente com vida ultra rápida, por exemplo por fluorescência têmpera de um corante orgânico em um saturado aquoso solução de iodeto de potássio. Além disso, não é estritamente necessário para gravar um IRF, porque a inclinação da decadência dos histogramas de fluorescência também pode ser instalada sem deconvolução de IRF. No entanto, um IRF permite corrigir para as características de sincronismo do detector de fótons utilizado e, assim, faz os ajustes de histogramas a vida mais precisos.</li>
</ol>
3.Conversão das gravações Photon imagens FLIM
<ol>
	<li>Baixe e instale o software de conversão de PT32ICS5. Nota: Os dados de tempo de vida também podem ser analisados por outros softwares, incluindo software de vários fornecedores de microscópio.</li>
	<li>Configure o software de PT32ICS.<ol>
		<li>Definir o tamanho de 256 × 256 pixels imagem tamanho através de configurações | Tamanho.</li>
		<li>Definir o canal 2 por configurações | Tamanho. Nota: O canal das emissões mCitrine é exclusivamente dependente da configuração do microscópio. Um canal errado resultará em uma imagem FLIM com nenhum fótons (i.e., preto, imagem) e como resultado um vazio 'LifetimeTable.txt'-arquivo. O canal correto pode ser identificado por tentativa e erro.</li>
		<li>Defina a saída como ImageJ (xyz) (ou TRI2 (xyt)) para gerar imagens FLIM (passo 3.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pressione converter e carregar um ou mais traços de fótons (os arquivos de .pt3). Para selecionar vários vestígios de fóton, mantenha a tecla Ctrl pressionada. Nota: O formato de .ptu de 64 bits mais recente também pode ser convertido.</li>
	<li>Certifique-se de que o software de PT32ICS gera os seguintes arquivos na mesma pasta onde os arquivos de pt3 são salvos: uma pilha de fótons por rastreamento de fóton .pt3 no formato padrão da citometria de imagem (ICS), arquivo de um bitmap por rastreamento de fóton de .pt3 (. bmp), um arquivo de texto por conversão (_Report.txt) contendo informações sobre as estatísticas de fóton (ou seja, o número total de fótons em cada traço de fóton de .pt3, o tempo de resolução do detector) e um segundo arquivo de texto por conversão (_LifetimeTable.txt) que contém o total histogramas de vida de fluorescência em formato delimitado por tabulação para cada traço de fóton de .pt3. Nota: O arquivo ICS pode ser usado para um único pixel encaixe para gerar imagens FLIM, por exemplo, com TRI2 software12,13 ou a biblioteca em FIJI ImageJ14,15de encaixe de curva para SLIM. Este arquivo pode também ser usado para análise de fasor16, por exemplo com o plugin de tempo Gated fasor para FIJI de Spechron. O arquivo de bitmap não contém nenhuma informação de tempo de vida. O segundo arquivo de texto é usado para a análise FLIM de células inteiras na etapa 4.</li>
</ol>
4. montagem de histogramas de vida de fluorescência para análise de células inteiras FLIM
Nota: Este passo (montagem de IRF deconvoluted) requer o software capaz de caber deconvoluted. Encaixe as encostas dos histogramas de fluorescência sem deconvolução de IRF pode ser feito com outros softwares também.
<ol>
	<li>Abra o programa de software de análise de dados capaz de caber com deconvolução (Tabela de materiais) e importar o arquivo de texto contendo o histograma para cada traço de fóton (_LifetimeTable.txt) através de arquivo | Importação | Único ASCII.</li>
	<li>Reorganize a tabela tal que o IRF é na segunda coluna da tabela (usando copiar e colar). Coloque o IRF na segunda coluna B ao lado os valores de tempo na primeira coluna A.</li>
	<li>Determinar a qualidade dos traços gravados fóton selecionando todas as colunas pressionando Ctrl + A e selecionando enredo | Painel multi | 9 painel. Não analise vestígios de fótons com um pico de alta reflexão (Figura 4F).</li>
	<li>Selecione todas as colunas que contêm os histogramas de controle de qualidade de vida que serão equipados bem como o IRF na coluna B usando Ctrl chave e carregar a montagem não-linear através de análise de | Montagem | Ajuste não linear da curva | Abrir caixa de diálogo.</li>
	<li>Carregar a função de ajuste deconvoluted (disponível no arquivo complementar 1) adicionando essa função para o software de análise (através de categoria | Definidos pelo usuário | Função | Adicionar). Selecione o arquivo de ajuste função 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Esta função se encaixa os histogramas de vida de fluorescência com uma função de decaimento exponencial mono deconvoluted com o IRF (ou seja, a segunda coluna B na tabela) (equação 1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq1.jpg">(Equação 1) com t o tempo, τ a fluorescência aparente vida, A amplitude e y0 o deslocamento. Nota: Outra opção é para caber os histogramas de vida com uma função de ajuste bi-exponencial (equação 2): 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq2.jpg">(Equação 2) Fixando-se o tempo de vida do componente lento (τ1) para a condição de único doador (passo 1.1.2: amostra #1) e que do componente rápido (τ2) para a construção em tandem (amostra #3), isto permite a estimativa da fração de Proteínas SNARE no complexo (F) a partir as amplitudes de lento (A1) e componentes rápidos (A2; ver discussão; Equação 3): 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq3.jpg">(Equação 3) O arquivo de função ajuste de encaixe bi-exponencial deconvoluted 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' está disponível no arquivo complementar 2.</li>
	<li>Selecione cabido curvas | Tipo de dados x como mesmo como dados de entrada. Nota: Isto irá resultar no apropriado x-eixo dimensionamento das curvas do cabido.</li>
	<li>Ajuste as curvas pressionando caber. Nota: Isto irá converter o ajuste e gerar uma folha de' relatório' na matriz com uma tabela que contém o tempo de vida de fluorescência, deslocamentos e amplitudes. Ele também irá gerar uma folha de dados com as curvas cabidas e os resíduos do ajuste.</li>
</ol>

<ol><li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs+-+engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SNAREs - engines for membrane fusion.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).</li>
<li>Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167488905000571">SNAREs and traffic.</a> Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).</li>
<li>van den Bogaart, G., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+the+SNAREs+needed+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Counting the SNAREs needed for membrane fusion.</a> J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).</li>
<li>Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+fusion+upon+SNARE+knockdown+is+maintained+by+residual+SNARE+activity+and+enhanced+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking.</a> Traffic. 10 (10), Copenhagen, Denmark. 1543-1559 (2009).</li>
<li>Verboogen, D. R. J., González Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+reveals+rerouting+of+SNARE+trafficking+driving+dendritic+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dance+of+the+SNAREs%3A+assembly+and+rearrangements+detected+with+FRET+at+neuronal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses.</a> J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/en/filelibrary/cell-culture/neon-protocols.par.0780.file.dat/hela-cervix.pdf">NEON transfection system cell protocols HeLa</a>. , (2017).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://spie.org/Publications/Proceedings/Paper/10.1117/12.590510">Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM.</a> Proc. SPIE. 5700, 171(2005).</li>
<li>Barber, P., et al. <a target="_blank" href="http://rsif.royalsocietypublishing.org/content/6/Suppl_1/S93">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+detection+by+the+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Biosensor Förster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).</li>
<li>Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+extension+of+the+neuronal+SNARE+complex+into+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane.</a> Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).</li>
<li>Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+citrine+structure+by+hydrostatic+pressure+explains+the+accompanying+spectral+shift%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift.</a> PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).</li>
<li>Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chromophores+and+buried+charges+control+color+in+mFruits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel chromophores and buried charges control color in mFruits.</a> Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).</li>
<li>Veale, K. J., Offenhäuser, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VAMP3+regulates+podosome+organisation+in+macrophages+and+together+with+Stx4%2FSNAP23+mediates+adhesion%2C+cell+spreading+and+persistent+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration.</a> Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).</li>
<li>Gómez-Jaramillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin-4+is+implicated+in+the+secretion+of+antibodies+by+human+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells.</a> J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo demonstra o uso do FRET-FLIM para visualização de interações SNARE entre syntaxin 4 e VAMP3 em células HeLa vivas. Syntaxin 4 é uma proteína de Qa-SNARE localização predominantemente na membrana plasmática onde ele Medeia exocitose1,2,20,21. VAMP3 é um R-SNARE, que é descrita principalmente para localizar a reciclagem CDDP compartimentos e Medeia tráfico para outros endossomos, bem como para a membrana plasmática1,2,20. No entanto, o ensaio de FRET-FLIM pode ser facilmente adaptado para estudar outras proteínas SNARE. A única condição é que essas armadilhas contêm uma hélice transmembrana do C-terminal, que é o caso para a maioria das proteínas SNARE por longe1,2. Além disso, o protocolo descrito aqui pode ser adaptado para visualização de complexos SNARE em qualquer tipo de célula eucariótica, incluindo plantas e leveduras. Neste protocolo, usamos o encurtamento do tempo de vida de fluorescência do fluoróforo dador como uma medida de traste. Como uma abordagem complementar, o tempo de vida de fluoróforo o aceitador poderia ser analisado, porque a emissão sensibilizada causa uma fase de ascensão distintas que fornece prova inequívoca essa transferência de energia de ressonância ocorre.
Atualmente, a técnica de FRET-FLIM não poderá visualizar complexos SNARE em compartimentos dos lisossomos. Para a construção de 3-mCitrine-mCherry em tandem syntaxin, a fluorescência de mCherry pode ser encontrada mais acumulada em uma área de juxtanuclear, que provavelmente corresponde a compartimentos de depósito lisossômicas, Considerando que o sinal de mCitrine é mais abundante no celular periferia5. Um acúmulo de juxtanuclear semelhante de mCherry comparado com mCitrine observou-se, quando as mesmas proteínas SNARE fundidas para estas proteínas fluorescentes foram expressas co5. Lisossomos são caracterizados por um extremamente baixo pH (&#60; 4) e uma alta atividade de enzimas proteolíticas. O acúmulo de juxtanuclear de mCherry é provavelmente causado por uma resistência mais elevada do fluoróforo mCherry a degradação lisossomal, em comparação com o fluoróforo mCitrine. Não é devido ao pH-têmpera de mCitrine, como acúmulo de juxtanuclear de mCherry também ocorre após a fixação das células5. Assim, a técnica de FRET-FLIM subestima a quantidade de FRET nas regiões juxtanuclear (lysosomal) e isso exigiria outras proteínas fluorescentes repórter que sobrevivem as condições adversas de lisossomos dentro os lúmens.
FRET-FLIM em princípio permite para obter uma estimativa quantitativa (semi-) da fração de armadilhas em complexo de5. Como explicado no presente protocolo, isto requer a instalação dos histogramas de vida de fluorescência com funções de decaimento exponencial-Duplo (equação 2), onde a amplitude do componente rápido é proporcional a fração de armadilhas no complexo ( Equação 3). No entanto, tal encaixe com um modelo de dois componentes é tecnicamente desafiador. Montagem com vários parâmetros de ajuste livre (dois tempos de vida de fluorescência e duas amplitudes) requer um grande número de fótons, especialmente desde que os parâmetros influenciam uns aos outros e pequenos erros em tempo de vida afetará as amplitudes e vice versa. Para superar estes problemas de montagem, os tempos de vida de fluorescência do componente lento podem ser corrigidos para o tempo de vida da única condição doador (ou seja, não FRET; só mCitrine presente) e que o componente rápido para o tempo de vida do tandem construir ( FRET expectable máxima). No entanto, isto também deve ser interpretado com cuidado, porque os tempos de vida de fluorescência podem não ser o mesmo que esses Estados de controle e podem desviar-se por causa de vários motivos (auto que extingue, orientação do dipolo, variações no microambiente). Vários complexos SNARE nas proximidades (&#60; 10 nm) pode resultar em traste dependente da distância, o mesmo princípio que permite FRET ser usado como uma "régua molecular", mas neste caso, obscurece a quantificação de complexos SNARE. Além disso, uma estimativa quantitativa não é sempre significativa, porque as ciladas rotuladas competem com endógenas SNAREs (sem rótulo). Como consequência, o nível de expressão de mCherry-rotulado SNARE é um determinante principal para o percentual FRET5. Por causa de todas essas advertências, é recomendável para caber os histogramas de vida fluorescente com uma função de decaimento mono-exponencial (equação 1). Isto tem a vantagem que não exige qualquer conhecimento a priori de tempo de vida e a vida fluorescente média aparente resultante fornece uma medida sólida para SNARE complexantes5.
No entanto, espera-se que a imagem de FRET-FLIM quantitativa por modelos de encaixe do dois-componente terá potentes aplicações futuras. LAÇO-codificação de genes dentro do cromossomo podem ser fundidos com proteínas fluorescentes repórter, por exemplo pelo CRISPR/CAS9. Isso resulta na rotulagem fluorescente de endógenas proteínas SNARE, com níveis de proteína endógena e sem fundo de armadilhas sem rótulo e desse modo permite uma estimativa quantitativa significativa da fração de complexos SNARE por FRET-FLIM. Enquanto os níveis de expressão de armadilhas endógenas podem ser bastante baixo e dar relativamente baixos sinais fluorescentes, espera-se que um número suficiente de fótons pode ser obtido, especialmente para a célula inteira FLIM (que requer apenas alguns 1, 000s de fótons). Além disso, estas medições FRET-FLIM podem ser executadas com detectores de fotodiodo avalanche mais sensíveis que também resultará em sinais de fluorescência maiores e melhor estatística de fóton.

Tráfico de membrana é uma característica central das células eucarióticas, onde vesículas de membrana bud fora de uma organela do doador e depois mover para e fundem-se com um alvo Organela1,2. Com exceção de mitocôndrias, todos estes passos de fusão de membrana são catalisados por membros da família1,proteínas SNARE2. A família de proteínas SNARE consiste de cerca de 36 em células de mamíferos e cerca de 20 membros em fermento2. Proteínas SNARE contêm um ou dois ~ 52 longa de resíduos, nativamente não estruturadas de regiões, chamadas SNARE-motivos. Proteínas SNARE frequentemente estão amarradas a membranas por uma hélice transmembrana de C-terminal1,2. Armadilhas podem ser categorizadas com base na centrais resíduos contribuem para a armadilha complexa em arginina (R) e glutamina (Q) armadilhas1,2. Fusão da membrana é impulsionado pela interação de 3 ou 4 armadilhas cognatas que juntos contribuem 4 SNARE-motivos e são distribuídos sobre o doador e o aceptor de membrana1,2. Um complexo SNARE é composto por três motivos de Q-SNARE (denominados Qa, Qb e Qc) e um motivo de R-SNARE. Formação do complexo começa com a N-termini de SNARE-motivos, formando um so-called trans-SNARE-complexo e prossegue em direção a C-termini, formando um apertado bundle coiled-coil α-hélice, chamado um cis-SNARE-complexo. A formação do complexo de nem um único laço complexo arrasta as membranas doador e aceptor juntos e supera a barreira de energia para fusão de membrana3.
Muitas vezes tecnicamente é um desafio atribuir distintos complexos SNARE para rotas de transporte específicos dentro das células. Embora ciladas claramente contribuem para a especificidade da membrana de tráfico, são promíscuos, funcionalmente redundante, e suas funções se sobrepõem1,2. Por causa disso, experiências de perturbação definião ciladas, tais como nocaute do gene, interferência do RNA, a introdução de anticorpos de bloqueio, ou com fragmentos SNARE solúveis atuando como dominantes negativos, frequentemente não resultam em fenótipos claros como outro SNAREs compensar2,4. Além disso, é difícil diferenciar as etapas de fusão de membrana específicas de montante eventos de tráfico, porque armadilhas podem estar envolvidas em várias rotas de transporte2. Estudos de localização de armadilhas por microscopia abordagens, usando immunolabeling ou fusão genética de proteínas fluorescentes repórter, sofrem com os problemas que: (i) armadilhas localizar para várias organelas como eles muitas vezes mediam várias etapas de tráfico e (ii) suas localizações não significam automaticamente que eles funcionalmente estão envolvidos na formação do complexo SNARE. Finalmente, complexos SNARE podem ser identificados usando imunoprecipitação experimentos usando um dos laços como isca e as outras armadilhas como alvos, mas isso não permite a atribuição destes complexos de organelas específicas ou rotas de tráfico. Assim, atualmente, não existe alternativa técnica para visualizar complexos SNARE com resolução organellar. Imunofluorescência não é capaz de provar interações SNARE, mas pode mostrar apenas a presença ou ausência de localização co, enquanto imunoprecipitação só pode mostrar interações SNARE em toda a população de células, mas não atribuir as organelas onde estas interações ocorrem.
Para ultrapassar estas limitações, um novo método que permite a visualização quantitativa de complexos SNARE dentro de células vivas com resolução organellar recentemente foi desenvolvido por Verboogen et al . 5 este método baseia-se na expressão de pares de armadilhas com proteínas fluorescentes espectralmente deslocadas fundidas C-terminal para suas hélices transmembranares. Após a conclusão da fusão da membrana e a formação de uma cis-SNARE complexas, estes fluorophores na C-termini das hélices transmembranares são imediatamente justapostos uns aos outros. Os fluorophores então estão bem dentro da distância de Förster (tipicamente &#60; 5 nm), resultando em FRET do fluoróforo dador verde-deslocado para o avermelhado aceitador fluoróforo5,6. FRET resultados em têmpera do fluoróforo dador e uma emissão maior do fluoróforo aceitador que pode ser medido a partir os rácios da emissão doador e aceptor (ratiometric FRET). No entanto, ratiometric FRET entre duas moléculas diferentes é um desafio, por causa dos níveis de cross-talk e diferente de fluorescência do doador e aceptor laços em organelas diferentes e entre células7,8. FRET pode também ser medido desde o tempo de vida de fluorescência, que é o tempo entre a excitação e a emissão de um fóton. Se o fluoróforo dador pode liberar sua energia por FRET, este resultado processo concorrentes em um aparente encurtamento do tempo de vida de fluorescência. Isto pode ser medido por FLIM7,8. Tempo de vida FRET é muito mais robusto do que o ratiometric FRET para medir as interações entre duas moléculas diferentes, como o tempo de vida de fluorescência é uma propriedade intrínseca de um fluoróforo e é insensível à sua concentração. Além disso, o FRET é por aproximação quantitativa, porque a eficiência do traste é inversamente proporcional à sexta potência da distância entre o doador e aceptor fluorophores (essencialmente uma função de passo). Portanto, encaixando os histogramas de vida de fluorescência gravados por FLIM com um modelo de decaimento do dobro-componente, FRET-FLIM permite a estimativa quantitativa (semi-) da fração de SNARE moléculas exerçam de formação do complexo SNARE5.
Recentemente, este método FRET-FLIM foi usado por Verboogen et al . para visualizar a formação do complexo SNARE em células dendríticas primárias do sistema imunológico,5. Foi demonstrado que, ao encontrarmos um estímulo patogênico, células dendríticas redirecionar sua membrana tráfico acompanhada por um aumento complexantes da proteína de membrana associada a vesículas do R-SNARE (VAMP) 3 com o q-SNARE syntaxin 4 especificamente na membrana plasmática. Esta formação do complexo SNARE aumentada provavelmente é necessária para atender o aumento da capacidade secretora para a secreção de citocinas inflamatórias, tais como a interleucina-65. Este protocolo descreve as etapas experimentais necessárias para a aquisição de dados FLIM-FRET para a medição quantitativa e visualização (semi-) de complexos SNARE.É explicado como encaixar os histogramas de vida de fluorescência de células inteiras com funções de decaimento mono e bi-exponencial, originando o ciclo de vida de fluorescência aparente como uma estimativa quantitativa de interações SNARE. Neste protocolo, a linha de célula HeLa amplamente usada é usada como um exemplo, mas o método pode ser facilmente estendido para estudar complexos SNARE em outras células eucarióticas.

<table><tbody><tr><td>DNA de plasmídeo 'sintaxina 4-mCitrino'Addgene</td><td></td> <td>ID 92422</td><td>Outros SNAREs com proteínas fluorescentes fundidas às suas hélices transmembranares C-terminal também podem ser usados. Em vez de mCitrine-mCherry, outros pares doador-aceitador de fluoróforos separados espectralmente também podem ser usados (por exemplo, CFP-YFP).</td></tr><tr><td>DNA de plasmídeo 'VAMP3-mCherry'Addgene</td><td></td> <td>ID 92423</td><td>Outros SNAREs com proteínas fluorescentes fundidas às suas hélices transmembranares C-terminal também podem ser usados. Em vez de mCitrine-mCherry, outros pares doador-aceitador de fluoróforos separados espectralmente também podem ser usados (por exemplo, CFP-YFP).</td></tr><tr><td>DNA de plasmídeo 'sintaxina 3-mCitrine-mCherry'Addgene</td><td></td> <td>ID 92426</td><td>Controle positivo para FRET máximo alcançável.</td></tr>Pratos de fundo de vidro <tr><td>Hela cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm&nbsp;</td><td>Willco Wells</td><td>HBST-3522</td><td>Outras câmaras de imagem de células vivas funcionarão como substitutos</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Greiner Bio-one</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>Solução antibiótica-antimicótica</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Pen/Strep funcionará como um substituto</td></tr> Imagem <tr><td>de células vivas médio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14291DJ</td><td>Qualquer outra solução de imagem de células vivas funcionará, desde que a fluorescência do meio seja evitada</td></tr><tr><td>Microscópio confocal Leica SP8 com uma objetiva de imersão em água de 63x 1,20 NA</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Outros microscópios confocais capazes de FLIM no domínio do tempo também podem ser usados</td></tr><tr><td>Laser de luz branca pulsada</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Outras fontes de laser pulsado também podem ser usadas</td></tr><tr><td>Sistema de contagem de fótons únicos correlacionados com o tempo (TCSPC)</td><td>PicoQuant</td><td>PicoHarp 300</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> de conversão PT32ICS <td>Disponível na seção 'Software' de www.membranetrafficking.com programa de software de</td></tr><tr><td>análise de dados capaz de deconvolução</td><td>Originlabs</td><td>OriginPro 2016</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macro Fiji ImageJ feita sob medida para convolução da imagem FLIM com Intensity</td><td>Fiji ImageJ</td><td></td><td>Disponível na seção 'Software' do www.membranetrafficking.com</td></tr><tr><td>B&uuml; Hemocitômetro rker</td><td>VWR</td><td>630-1541</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun Melsungen&nbsp; AG</td><td>362 3140</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 2 mM</td><td>Merck</td><td>108417</td><td>CAS: 60-00-4</td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>azul de tripano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td>CAS: 72-57-1</td></tr><tr><td>Dispositivo de eletroporação de célula NEON</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizando intracelular snare tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Solúvel N- proteÃ sensível proteína (NSF) acessório da proteína do receptor (SNARE) proteínas da fusão são chave para tráfico de membrana, como eles catalisam a fusão da membrana dentro das células eucarióticas. A família de proteínas SNARE consiste de cerca de 36 membros diferentes. Rotas de transporte intracelular específico são catalisadas por conjuntos específicos de 3 ou 4 proteínas SNARE que contribuam assim para a especificidade e a fidelidade do tráfico de membrana. No entanto, estudando a função precisa de proteínas SNARE é tecnicamente um desafio, porque armadilhas são altamente abundantes e funcionalmente redundante, com a maioria dos laços tendo múltiplos e sobreposição de funções. Neste protocolo, é descrito um novo método para a visualização da formação do complexo SNARE em células vivas. Este método baseia-se em expressar proteínas SNARE fundidas C-terminal de proteínas fluorescentes e medir sua interação por energia de ressonância de Förster transferir vida de fluorescência (FRET) emprega microscopia (FLIM) de imagem. Encaixando os histogramas de vida de fluorescência com um modelo multicomponente decadência, FRET-FLIM permite (semi-) estimativa quantitativa da fração da formação do complexo SNARE em diferentes vesículas. Este protocolo foi aplicado com sucesso para visualizar a formação do complexo SNARE na membrana plasmática e no CDDP compartimentos em linhas de células de mamíferos e principais células do sistema imunológico e pode ser facilmente estendido para estudar funções SNARE em outras organelas em animal, planta e células fúngicas.

A lógica do ensaio para medir interações SNARE por FRET-FLIM é mostrada na Figura 1. O C-termini das hélices transmembranares de cognatas proteínas SNARE é fundidos a um par de proteínas fluorescentes espectralmente deslocadas (por exemplo, mCitrine e mCherry). A formação de uma cis-SNARE complexo nos resultados da fusão da membrana nestas proteínas fluorescentes, tornando-se imediatamente justapostos uns aos outros e se IRRITE. A Figura 2 mostra imagens confocal representativas de células HeLa expressando proteínas SNARE fluorescente-labeled. Mostrado uma célula, manifestam a syntaxin 4-mCitrine (fluoróforo dador) com VAMP3-mCherry (aceitador fluoróforo), bem como condições de controle de células expressando apenas a syntaxin construção de 4-mCitrine (doador somente; nenhum traste) e syntaxin 3 fundido a ambos os mCitrine e mCherry em tandem (FRET expectable máxima). A Figura 3 mostra o tempo de vida de fluorescência que acompanha e imagens FLIM geradas por encaixe os histogramas de vida de cada pixel com funções de decaimento mono-exponencial (Figura 3A–.B) e bi-exponencial de decaimento funções ( Figura 3 - D). a figura 4A mostra o IRF de nossa configuração medida por dispersão de trás de um vidro de tampa de microscópio. Na Figura 4B–E, histogramas de vida representativo da fluorescência da célula toda análise FLIM junto com ajuste de acompanhamento são mostradas curvas para funções de mono-exponencial de decaimento. Figura 4F mostra um histograma de vida fluorescente de um experimento cuja imagem muito próximo à superfície do vidro para cobrir microscópio, resultando em um pico de reflexão proeminente. A Figura 4 mostra um histograma do tempo de vida com representante que se encaixam com uma função de decaimento bi-exponencial.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg"> 
Figura 1: esquema da justificativa para a visualização de complexos SNARE por FRET. (A) modelo estrutural da proteína neuronal SNAREs (proteína de banco de dados 3HD717) associada a vesículas de membrana (VAMP) 2 (azul; R), syntaxin 1 (vermelho; Qa-SNARE) e SNAP25 (verde; contém ambos um motivo Qb e Qc-SNARE). O C-terminal da hélice transmembrana de syntaxin-1 é conjugado com mCitrine (fluoróforo dador; banco de dados de proteínas 3DQ118). O C-terminal da hélice transmembrana de VAMP2 é conjugado com mCherry (aceitador fluoróforo; banco de dados de proteínas 2H5Q19). (B) esquema de SNARE mediada por fusão da membrana resultando em FRET. Após a fusão da membrana pela formação de uma cis-complexo SNARE, as armadilhas são imediatamente justapostos uns aos outros resultando em FRET. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg"> 
Figura 2: expressão de proteínas SNARE fundidos para proteínas fluorescentes. Primeira coluna: fluoróforo dador, animado com 516 nm. Segunda coluna: aceitador fluoróforo, animado com 610 nm. (A) doador somente condição. Imagem confocal representativa de uma célula HeLa expressando syntaxin 4-mCitrine (fluoróforo dador; verde em direta). O canal de aceitador (segunda coluna) mostra a fluorescência cross-talk. (B) controle negativo (sem traste). Imagem confocal representativa de uma célula HeLa expressando ambos syntaxin 4-mCitrine com VAMP3-mCherry (aceitador fluoróforo; magenta em direta). (C) controle positivo (FRET expectable máxima). Construir uma imagem confocal representativa de uma célula HeLa expressando o tandem de 3-mCitrine-mCherry syntaxin. Note que o sinal de fluorescência do mCitrine e mCherry sinais faz não completamente sobreposição, provavelmente por causa de uma baixa resistência de mCitrine a degradação lisossomal comparada com mCherry (consulte a seção de discussão). BF: campo claro. Escala de bares, 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg"> 
Figura 3: imagens FLIM de formação do complexo SNARE. (A) imagens de vida representativo da fluorescência das células mostradas na Figura 2. As imagens foram geradas pelo primeiro converter os vestígios de fóton gravados por um sistema TCSPC (.pt3) para a imagem cytometry padrão (ICS) utilizando o software PT32ICS. Único pixel equipado imagens então foram geradas usando o software de TRI212,13 com limites de 15-100% de intensidade, pixel binning circular 7 e algoritmo de ajuste de monoexponential (Marquardt) tempo de vida de fluorescência. A cor indica a média aparente vida fluorescente. (B) FLIM imagens onde as imagens do tempo de vida de fluorescência (mostrado no painel A) foram complicadas com as intensidades de fluorescência do fluoróforo dador de mCitrine (mostrado na Figura 2). A convolução foi realizada com FIJI ImageJ usando uma macro sob medida (consulte Tabela de materiais). (C) tempo de vida de fluorescência e FLIM imagens da célula HeLa expressando tanto syntaxin 4-mCitrine e VAMP3-mCherry de painéis A-B, mas agora com encaixe com curvas de decaimento bi-exponencial (com vidas que fixa as condições de controle; ver passo em 4,4 Protocolo). As cores de pixel indicam as frações estimadas F de syntaxin 4 em complexo com VAMP3 (equação 3). (D) caber igual painel B, mas para o bi-exponencial. A convolução foi realizada com FIJI ImageJ usando uma macro sob medida (consulte Tabela de materiais). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg"> 
Figura 4: toda célula análise FLIM. (A) a função de resposta do instrumento (IRF) da instalação. O IRF foi medido utilizando o espalhamento volta na interface água-de-vidro (usando um prato de microscopia limpa vidro contendo água).(B–E) Toda célula histogramas de vida para as células, mostradas na Figura 2 e Figura 3. Todos os fótons presentes nas imagens foram agrupados. As curvas foram deconvoluted com o IRF e equipadas com funções de decaimento mono-exponencial (equação 1). Para essas células, vidas de fluorescência foram obtidas de 2,82 ns (células expressando apenas syntaxin 4-mCitrine; doador somente; painel B), 2.09 ns (células expressando co syntaxin 4-mCitrine com VAMP3-mCherry; painel C) e 2,08 ns (células expressando a syntaxin 3 - mCitrine-mCherry em tandem construir; controle FRET expectable máxima; painel D). Os embutimentos mostram os mesmos gráficos, mas agora com escala logarítmica do eixo y. Painel E mostra uma sobreposição das curvas de decaimento de painéis B-D. (F) exemplo de um histograma do tempo de vida fluorescente gravado perto demais para a superfície de deslizamento da tampa do microscópio. Isso resulta em um pico de grande reflexão (representado pela área sombreada amarela). (G) mesmo que painel C, mas agora encaixe com uma curva de decaimento bi-exponencial com vidas fixa as condições de controle (consulte a etapa 4.4 no protocolo). As amplitudes de jejum (A1) e lento (A2) componentes foram 14,42 e 0,01, respectivamente, resultando em uma fração de estimado de armadilhas no complexo F de 0,99 (equação 3). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Complementar arquivo 1. Arquivo de função FLIM_convoluted_IRF <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">por favor clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementar arquivo 2. Arquivo de função FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">por favor clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo descreve um método novo, permitindo a visualização quantitativa da formação do complexo de proteínas SNARE, baseado na transferência de energia de ressonância de Förster e vida de fluorescência, microscopia de imagem.

Visualizando intracelular SNARE tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

O objetivo geral deste experimento é visualizar a formação complexa de proteínas SNARE em células vivas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de tráfego de membrana, como identificar os conjuntos de proteínas SNARE que catalisam as etapas específicas de tráfego de organela. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização direta de locais celulares onde os SNAREs se envolvem em formação complexa.Neste experimento, 900.000 células HeLa divididas entre três tubos Eppendorf são usadas para transfecção. Transfecte as células conforme descrito no protocolo de texto com as seguintes construções. Amostra número um com a construção mCitrine da sintaxinina-4, amostra número dois com a sintaxinina-4 mCitrine e VAMP3-mCherry e amostra número três com sintaxinina-3 fundida a mCitrine e mCherry.Cultive as células transfectadas em DMEM com alto teor de glicose fornecido com 10% FCS e antibiótico antimicótico 1% a 37 graus Celsius com 5% de CO2 em uma incubadora de cultura de células durante a noite. No dia seguinte, aspirar o meio e lavar as células uma vez com meio de imagiologia de células vivas durante dois minutos. Depois disso, coloque as células em meio de imagem fresco.Para iniciar este procedimento, coloque a amostra número dois a 37 graus Celsius, em um estágio aquecido, sob um microscópio confocal de imagem de fluorescência no domínio do tempo com uma fonte de excitação pulsada para o fluoróforo doador e aquisição de dados resolvida no tempo. Antes de cada microscopia de imagem de fluorescência ou medição FLIM, selecione uma célula com expressão visível das proteínas SNARE marcadas com mCitrine e mCherry e registre uma imagem confocal de 256 por 256 pixels com excitação simultânea de ambos os fluoróforos. Grave uma imagem FLIM clicando em executar FLIM com a imagem FLIM sendo gravada com as mesmas dimensões e resolução espacial da imagem confocal gravada anteriormente.Registre a imagem com pelo menos 50.000 fótons para análise FLIM de célula inteira ou pelo menos 400 fótons por pixel. É importante registrar as medições FLIM a pelo menos um micrômetro de distância da superfície do vidro para evitar uma visão de reflexão. Repita a imagem de várias células na amostra número dois e para células na amostra número um e na amostra número três.Em seguida, coloque uma lamínula de vidro limpa na platina do microscópio para registrar uma função de resposta do instrumento ou IRF. Sintonize o monocromador do detector de emissão para o comprimento de onda de excitação e clique no botão executar FLIM para gravar uma imagem FLIM com o retroespalhamento da lamínula de vidro. As gravações de fotos serão convertidas em imagens FLIM com o software de conversão PT32ICS.Configure o software. Defina a saída como ImageJ para gerar imagens FLIM. Defina o tamanho da imagem para 256 por 256 pixels e o canal para dois.Pressione convert e carregue um ou mais traços de fótons. Mantenha a tecla de controle pressionada para selecionar vários traços de fótons. As imagens FLIM devem ser geradas na mesma pasta onde os traços de fótons são salvos.Comece abrindo o programa de software de análise de dados capaz de se adequar à deconvolução. Importe o arquivo de texto que contém o histograma para cada traço de fóton. Reorganize a tabela de forma que o IRF fique na segunda coluna da tabela, ao lado dos valores de tempo na coluna A.Determine a qualidade dos traços de fótons gravados selecionando todas as colunas.Não analise traços de fótons com um pico de reflexão alto. Um exemplo é mostrado aqui. Use a tecla control para selecionar todas as colunas que contêm os histogramas de tempo de vida com controle de qualidade que serão ajustados, bem como o IRF na coluna B, e carregue o ajuste não linear.Carregue a função de ajuste descomplicado adicionando-a ao software de análise. Selecione o arquivo de função de ajuste. Esta função se ajusta aos histogramas de tempo de vida de fluorescência com uma função de decaimento exponencial mono deconvoluta com o IRF.Execute o dimensionamento do eixo X das curvas ajustadas. Ajuste as curvas pressionando ajustar. Isso converterá o ajuste e gerará uma folha de relatório na matriz com a tabela contendo os deslocamentos e amplitudes de vida de fluorescência.Ele também gerará uma folha de dados com as curvas ajustadas e os resíduos do ajuste. São mostradas imagens confocais representativas de helocélulas que expressam apenas a sintaxina quatro mCitrine, snytaxin quatro mCitrine com VAMP3 mCherry ou a sintaxina três mCitrine mCherry construção tandem. Nessas imagens de tempo de vida de fluorescência que acompanham, a cor indica o tempo de vida fluorescente aparente médio.As imagens foram então contorcidas com as intensidades de fluorescência do fluoróforo doador mCitrino. A seguir estão as mesmas imagens com ajuste com funções de decaimento bi-exponencial. As cores dos pixels indicam as frações estimadas da sintaxina quatro em complexo com VAMP3.A função de resposta do instrumento da configuração foi medida usando o retroespalhamento na interface de água de vidro. Os histogramas de tempo de vida de células inteiras são mostrados para células que expressam apenas a sintaxina quatro mCitrine, co-expressando a sintaxina quatro mCitrine com VAMP3 mCherry e expressando a sintaxina três mCitrine mCherry construção em tandem. O painel E mostra uma sobreposição das curvas de decaimento dos painéis B, C e D. Os inlays mostram os mesmos gráficos, mas com escala logarítmica do eixo Y.Um histograma fluorescente de vida útil registrado muito perto da superfície da lamínula do microscópio resultou em um grande pico de reflexão, representado pela área sombreada em amarelo. Por fim, é mostrado um histograma de tempo de vida com ajuste representativo com função de decaimento bi-exponencial. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a quatro horas se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de registrar várias células, enquanto os níveis de expressão do doador e do interceptor SNARES podem influenciar o tempo de vida. Seguindo este procedimento, as células podem ser ativadas para responder a perguntas específicas do tipo de célula relacionadas ao reenraizamento do tráfego de membrana mediado por SNARE. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do tráfego de membranas explorarem as vias intercelulares do tráfego de organelas em todas as células eucarióticas.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como registrar e analisar os dados FLIM. Não se esqueça de que trabalhar com organismos geneticamente modificados e lasers de alta potência pode ser extremamente perigoso e precauções, como luvas e protetores oculares, devem sempre ser tomadas ao tentar este procedimento.

visualizing-intracellular-snare-trafficking-fluorescence-lifetime

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra como as vesículas neuronais são marcadas com proteínas fluorescentes específicas para visualizar seu movimento. Primeiro, um plasmídeo que codifica uma proteína fluorescente é incubado com um agente de transfecção e, em seguida, introduzido em uma cultura de neurônios. Posteriormente, imagens dos neurônios são adquiridas e analisadas para rastrear o movimento das vesículas.

Visualização da Motilidade da Vesícula em Neurônios Usando Imagem de Fluorescência

Fonte: Pigazzini, M. L., et. al. Caracterização de estruturas amilóides no envelhecimento C. Elegans Usando imagens de fluorescência ao longo da vida. J. Vis. exp. (2020). Este vídeo demonstra o uso da microscopia de imagem de fluorescência (FLIM) para avaliar a agregação de proteínas poliQ em C. elegans}, comparando vermes deficientes em proteínas controle e chaperonas. O aumento da agregação em vermes deficientes em chaperonas promove a transferência de energia entre fluoróforos agrupados,...

Imagem de fluorescência ao longo da vida da agregação de proteínas PolyQ em neurônios de Caenorhabditis elegans

endocitose mediada por clatrina, um processo rápido e altamente dinâmico internaliza muitas proteínas, incluindo receptores de sinalização. O protocolo descrito aqui visualiza diretamente a cinética de eventos endocíticos individuais. Isso é essencial para entender como os membros centrais da maquinaria endocítica se coordenam entre si e como a carga de proteínas influencia esse processo.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Este artigo fornece um método para investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma, usando uma construção de sinaptobrevin2-pHluorina e Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total. A estratégia desenvolvida para processamento de imagens e análise de dados também é relatada.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar eventos individuais, mediada por SNARE fusão entre lipossomas e bicamadas suportados em canais microfluídicos usando TIRFM polarizada, com sensibilidade única molécula e ~ 15 resolução de tempo ms. Lipídico e liberação de cargas solúveis podem ser detectados simultaneamente. o tamanho do lipossoma, de difusividade lípido, e propriedades de fusão dos poros são medidos.

Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Um procedimento é apresentado para visualizar as atividades da proteína quinase A em ratos cabeça-fixados, comportando-se. Um repórter melhorado da atividade da um-quinase, tAKARα, é expressado em neurônios corticais e tornado acessível para A imagem latente através de uma janela craniana. A microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão é usada para visualizar atividades de PKA in vivo durante a locomoção forçada.

Visualizando proteína quinase uma atividade na cabeça-corrigido ratos comportando-se usando in vivo microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão

A análise de deslocamento quadrado médio (iMSD) derivada de imagem é aplicada a macropinossos para destacar sua natureza intrínseca em termos de propriedades estruturais e dinâmicas. Os macropinossomos são então comparados aos grânulos secretos de insulina (ISGs) como referência para estruturas subcelulares com propriedades estruturais/dinâmicas médias invariantes.

Sondagem de Propriedades Estruturais e Dinâmicas de Nanoestruturas Subcelulares de Tráfico por Espectroscopia de Flutuação Espiotemporal

O artigo descreve a otimização dos parâmetros de aquisição da microscopia de fluorescência para visualizar o transporte axonal de cargas marcadas endógenas com resolução de neurônio único em um nematóide vivo.

Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos

Aprenda a visualizar a formação de complexos de proteínas SNARE em células vivas usando microscopia FLIM. Esta técnica permite observar diretamente os locais celulares onde ocorre o tráfego de membranas.

Visualizando intracelular SNARE tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem

Explorar mais vídeos