Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

O objetivo geral da combinação de reticulação com espectrometria de massa nativa é obter informações estruturais complementares sobre conjuntos de proteínas de múltiplas subunidades que ajudem a elucidar seu arranjo tridimensional. A reticulação química e a espectrometria de massa nativa ajudam a responder a questões-chave em biologia estrutural, como composição, conectividade e estequiometria. A principal vantagem da combinação de várias técnicas é que são obtidas informações complementares que não estão disponíveis com apenas uma técnica.

Nosso fluxo de trabalho pode ser aplicado a qualquer outro complexo proteico. Pode ser purificado a partir de sais ou tecidos ou pode ser reconstituído a partir de proteínas purificadas. Primeiro, aplique 7,5 microlitros de tampão simples quádruplo e três microlitros de agente redutor de 10 vezes no complexo proteico desejado.

Gire a amostra por um minuto a 16, 200 vezes a gravidade. Após a centrifugação, aqueça a amostra por 10 minutos a 70 graus Celsius. Prepare um gel de quatro a 12% de gradiente para eletroforese e coloque o gel na câmara de eletroforese.

Diluir 20 vezes com água o tampão de corrida previamente preparado e encher a câmara de eletroforese. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de antioxigênio à câmara interna. Carregue um marcador de proteína adequado na primeira cavidade do gel e as amostras de proteína nas cavidades restantes.

Em seguida, separe as proteínas pelo período de tempo apropriado a 200 volts. Para corar as bandas de proteína, transfira o gel para uma caixa de coloração de gel e cubra o gel com uma solução de Coomassie à base de água. Incube o gel durante a noite em temperatura ambiente em um agitador de gel horizontal.

No dia seguinte, remova a coloração do gel substituindo a solução de coloração por água. Repita a etapa anterior aproximadamente três a cinco vezes até que o fundo do gel pareça claro. Agora, corte as bandas de proteína que são visualizadas pela coloração azul de Coomassie dos géis usando um bisturi.

Corte cuidadosamente as bandas de proteína em pequenos pedaços de aproximadamente um mililitro. Em seguida, lave as bandas de proteína com água e acetonitrila. Reduza as ligações dissulfeto com DTT e, em seguida, alquile os resíduos de cisteína com iodoacetamida.

Em seguida, digerir as proteínas com tripsina conforme descrito no protocolo de texto. Para extrair os peptídeos, incube os pedaços de gel com bicarbonato de amônio e acetonitrila e colete o sobrenadante contendo peptídeos. Em seguida, incube os pedaços de gel com ácido fórmico a 5% e acetonitrila e colete o sobrenadante contendo peptídeos.

Depois de coletar o sobrenadante contendo peptídeos, combine os dois sobrenadantes e seque os peptídeos extraídos evaporando os solventes em uma centrífuga a vácuo. Quando os peptídeos estiverem secos, misture-os com 20 microlitros de solução de acetonitrila a 2% e ácido fórmico a 0,1%. Dissolva os peptídeos com um banho de sonicação por dois a três minutos.

Em seguida, gire a amostra em uma centrífuga a 16, 200 vezes a gravidade por 30 minutos. Depois de transferir a amostra para um frasco de amostrador automático, injete cinco microlitros em um sistema nano LC-MS/MS e carregue a mistura de peptídeos em uma pré-coluna C18 de fase reversa para dessalinizar e concentrar os peptídeos online. Remover o tampão de armazenamento de uma coluna de centrifugação de exclusão de tamanho por centrifugação a 1 000 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius durante um minuto.

Depois de descartar o fluxo, lave a coluna três vezes adicionando 500 microlitros de acetato de amônio 200 milimolar seguido de centrifugação. Após a centrifugação, carregue 20 microlitros da amostra de proteína na coluna e centrifugue a 1.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por quatro minutos. Agora, coloque um capilar revestido de ouro previamente preparado em um suporte capilar.

Abra a ponta de uma agulha e encha o capilar com um a quatro microlitros de amostra de proteína. Conecte o suporte capilar com a fonte de nano eletrospray do espectrômetro de massa e posicione a ponta do capilar em 0.5 a 1.5 centímetros em relação ao orifício do cone. Use gás nanofluxo de 80 a 150 litros por hora para iniciar a pulverização e ajustar o fluxo de gás para manter uma pulverização estável.

Ajuste os parâmetros e a página de sintonia do instrumento Q-TOF. Em seguida, inicie a aquisição clicando no botão Adquirir e combine o maior número possível de varreduras para obter um bom espectro de massa. Dissolva 1,43 miligramas de BS3 e 100 microlitros de água para preparar uma solução estoque de 25 milimolares.

Em seguida, adicione BS3 ao complexo proteico. Use quantidades variadas de BS3 para identificar a concentração ideal de reticulador. Incubar as misturas de reação a 25 graus Celsius por uma hora em um termomixer.

Agora, execute a página SDS das proteínas reticuladas com um gel de gradiente de quatro a 12%. Corte as bandas de gel e digerir a proteína por digestão em gel, conforme descrito anteriormente. Após a obtenção dos peptídeos da digestão em gel, realize a espectrometria de massa acoplada à cromatografia líquida conforme descrito anteriormente.

Todas as subunidades proteicas dos complexos heterododecâmero RvB1/B2 e heterooctamérico CPS foram identificadas com alta confiança. O espectro de massa de RvB1/RvB2 revela duas espécies que correspondem aos anéis duplos hexamérica e dodecâmrico. Uma estrutura cristalina para o complexo RvB1 / B2 mostra o arranjo do anel duplo.

A adição de BS3 ao complexo RvB1 / RvB2 causa ligação covalente das proteínas, resultando em bandas de proteínas com maior peso molecular. E quantidades crescentes de BS3 produzem quantidades maiores de espécies reticuladas, enquanto as subunidades de proteínas não reticuladas são reduzidas. O espectro de dipeptídeos reticulados mostra séries de íons Y de ambos os peptídeos, confirmando essa interação proteica.

Os resultados da reticulação BS3 são visualizados em uma rede de interação mostrando interações intramoleculares, bem como interações entre diferentes subunidades. O espectro de massa nativo do CPS mostra o heterodímero, heterotetrâmero e heterooctâmero. A espectrometria de massa em tandem do CPS tetrômico e octamérico revela dissociação da pequena subunidade CPS.

A reticulação química do CPS com o reticulador BS3 mostra várias ligações cruzadas intramoleculares entre duas cópias da grande subunidade CPS. A estrutura cristalina revela que a superfície de interação entre o núcleo tetrâmico e as pequenas subunidades periféricas é muito pequena, o que pode explicar a ausência de interações entre subunidades. Uma vez dominado, nosso fluxo de trabalho pode ser feito em uma semana se executado corretamente.

Como a montagem da proteína é muito complexa, é necessário tempo adicional para a análise dos dados. Seguindo este procedimento, a modelagem computacional pode ser realizada posteriormente para obter modelos tridimensionais dos complexos de proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de reticulação química e espectrometria de massa nativa até que essas duas técnicas complementares ajudem a elucidar as estruturas dos conjuntos de proteínas.