Name: Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprenda a combinar reticulação química e espectrometria de massa nativa para estudar a arquitetura de complexos proteicos multissubunidades. Este método fornece informações estruturais complementares essenciais para a biologia estrutural.

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Agradecemos nossos colegas para debates úteis. Também agradecemos Ilme Schlichting e Karl-Peter Hopfner fornecendo complexos da proteína. Reconhecemos que o financiamento do Ministério Federal da educação e pesquisa (BMBF, ZIK programa, 03Z22HN22), os fundos europeus de Desenvolvimento Regional (Pedro, ZS/2016/04/78115) e o MLU Halle-Wittenberg a C.S. e financiamento do Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) de A.P.

Os autores não têm nada para divulgar.

Protocolos são fornecidos para análise estrutural de espectrometria de massa base de complexos multi o subunit da proteína. As duas técnicas, descritas no protocolo, principalmente, entregar resultados complementares e são well-suited para obter insights sobre os arranjos estruturais dentro da proteína (-ligante) complexos que são difíceis de estudar por técnicas estruturais convencionais. Espectrometria de massa nativa oferece insights sobre stoichiometries de proteína, bem como interações da proteína através da análise de subcomplexes e módulos de interação estável. Cross-linking, por outro lado, produz informações sobre sites de contato diretos. Dependendo o cross-linker usado, uma certa flexibilidade pode ou deve ser incluída na análise.
Os protocolos fornecidos são em geral fácil de executar e não demorado. O protocolo inteiro pode ser executado dentro de uma semana e pode ser aplicado a quase todos os complexos da proteína, apesar de uma certa quantidade de proteína complexa é necessária para a análise bem sucedida. Preparação da amostra é simples e não requer especificamente os complexos de proteína purificada. No entanto, uma armadilha comum é a contaminação da amostra durante a preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseadas da proteína. Estas contaminações na maioria dos casos incluem a queratina que se originam de pó, pele ou cabelo. Portanto, extra tais como usando luvas e jalecos, filtração buffers de aquosas e usando solventes de alta pureza tenha cuidados durante a preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseadas da proteína. Outras proteínas contaminantes tais como acompanhantes geralmente são introduzidas durante a purificação de proteínas, por exemplo, quando usando marcas de afinidade. Nestes casos, purificação de proteínas deve ser melhorada, por exemplo, aumentando a etapas de lavagem. Em qualquer caso, as contaminações de proteína na amostra são facilmente identificadas durante a pesquisa de banco de dados, omitindo o filtro de taxonomia (i.e., procurando contra proteínas de todas as espécies). Se apenas alguns peptídeos são observados (ou seja, uma cobertura de baixa proteína poderia ser obtida), apesar de amostra suficiente estiver disponível, talvez seja necessário usar uma protease diferente durante a digestão. Em geral a tripsina produz um número suficiente de peptídeos; no entanto, em alguns casos, tais como proteínas de membrana ou membrana domínios de proteínas, é reduzir o número de sítios de clivagem tryptic e outras enzimas como alvo aminoácidos hidrofóbicos são uma escolha melhor.
Em termos de instrumentação, um instrumento particularmente modificado é necessário para espectrometria de massa nativa que mantém interações não covalentes durante a transferência para a fase gasosa. Vários tipos de instrumento foram introduzidos, incluindo instrumentos Q-ToF e orbitrap. Enquanto espectrómetros de massa Q-ToF modificados estão disponíveis comercialmente para espectrometria de massa nativa desde vários anos, este último só recentemente foram introduzido e na maioria dos casos requerem modificação especializados45. No entanto, a aplicação de instrumentos de alta resolução permitiu estudar a ligação de vários ligantes e sua quantificação46,47 e é promissor para aplicações futuras.
Para identificar di-peptídeos reticulados por espectrometria de massa acoplada a cromatografia líquida, podem ser aplicados os procedimentos padrão, com poucas modificações. No entanto, a pesquisa de banco de dados é o fator limitante como software especializado pode raramente lidam com grandes bases de dados e reduzidos bancos de dados contendo as subunidades de proteína dos complexos são necessários. Estudos recentes usados espectrometria de massa-cleavable cross-linkers visando interações da proteína em toda a célula lysates48,49. O uso de cross-linkers químicos que fragmentam em experimentos de espectrometria de massa em tandem principalmente produz peptídeos lineares (modificados pelo cross-linker), que podem ser identificados por mais fragmentação e banco de dados à procura de peptídeos lineares e isso reduz tempo de pesquisa e espaço de pesquisa computacional. No entanto, para realizar estas experiências, um analisador de massa ion trap ou um espectrômetro de massa híbrido com uma armadilha do íon é necessário. Em geral, como falsos positivos são uma questão importante, espectros de massa de reticulado peptídeos são frequentemente validados manualmente pela qualidade dos seus espectros de fragmento que amplia enormemente o tempo de análise de dados. Desenvolvimento de sistemas robustos de pontuação que podem ser aplicados sem mais etapas de validação são, portanto, possíveis aplicações futuras. Uma maneira de melhorar a análise de dados e reduzir o número de falsos positivos foi a introdução de cálculos da taxa falsa da descoberta e sua aplicação para cross-linking de conjuntos de dados50.
Em geral, as técnicas aqui descritas podem ser complementadas com ainda mais técnicas de espectrometria de massa (por exemplo, rotulagem covalente) para aumentar a saída da análise. Outras modificações e melhoramentos dos protocolos podem ser facilmente implementados. Como tal comparativo do cross-linking34 desvenda mudanças conformacionais na Assembleia de proteína. Novos desenvolvimentos em espectrometria de massa nativa hoje em dia permitem a análise de proteínas de membrana51,52 e suas interações com lipídios28,52,53,54 . Novos desenvolvimentos de espectrómetros de massa de alta resolução para espectrometria de massa nativa ter alargado o aplicativo e vinculação de ligante, por exemplo, vinculação de lipídios, proteínas de membrana, agora podem ser incluídos na análise45, 46. em combinação com abordagens de modelagem computacional, estas técnicas podem entregar modelos estruturais de diferentes resolução55. Se não há estruturas de cristal estão disponíveis para as subunidades de complexas ou única intactas, espectrometria de massa pode entregar primeiros insights sobre a topologia do complexo desconhecido e interações da proteína. Dependendo das técnicas utilizadas e os resultados obtidos, modelos de baixa resolução do complexo desconhecido podem ser obtidos56,57,58. Se homologia modelos ou estruturas de cristal estão disponíveis, as informações estruturais recebidas de espectrometria de massa podem render até quase nativo modelos59.
Em comparação com outras técnicas estruturais, espectrometria de massa tem a vantagem que requer quantidades de amostra baixa, ele pode lidar com amostras heterogêneas e é aplicável a complexos de proteínas de tamanho ilimitado. Além disso, a espectrometria de massa permite a investigação de sistemas dinâmicos da proteína. Populações diferentes da proteína ou proteína complexa que existem em solução geralmente são analisadas em conjunto e, portanto, ao contrário com outras técnicas estruturais que requerem a seleção de determinadas populações, todas as conformações são mantidas durante análise e são tributáveis em um experimento. Abordagens do cross-linking quantitativas foram recentemente introduzidas34,60,,61 e são promissoras para futuros aplicativos descrevendo mudanças conformacionais em condições diferentes.

A investigação estrutural de assemblies de proteína tornou-se particularmente importante para a compreensão dos processos celulares. Consequentemente, muitos, técnicas foram desenvolvidos e melhorados em biologia estrutural1. No entanto, essas técnicas às vezes são limitadas na sua aplicação devido ao tamanho, flexibilidade ou heterogeneidade dos complexos proteína sob investigação. Espectrometria de massa pode lidar com esses desafios e, portanto, surgiu como uma poderosa ferramenta na biologia estrutural2,3,4,5. A maior vantagem de espectrometria de massa, no entanto, é a capacidade de identificar inequivocamente proteínas mesmo em misturas complexas e heterogêneas6. Para este fim, as proteínas geralmente são digeridas com endoproteinases e a mistura resultante do peptídeo é separada por cromatografia líquida e eluída diretamente para o espectrômetro de massa. Massas de peptídeo são posteriormente determinadas e íons precursor são selecionados para maior fragmentação dos peptides. Proteínas são então identificadas por busca do peptide e massas de fragmento correspondente contra um banco de dados conhecido. Este procedimento não só permite a identificação de peptídeos/proteínas, mas também suas modificações borne-translational que causar uma mudança em massa de peptídeos o precursor e os íons de fragmento carregando a modificação7. Algumas das muitas técnicas de espectrometria de massa estrutural se baseiam neste princípio4,8. Por exemplo, rotulagem técnicas tais como o hidrogênio deutério troca9,10, química rotulagem estratégias11,12, ou o radical hidroxilo pé impressão13,14 , dar insights sobre a acessibilidade de superfície das proteínas sob certas condições.
Outra técnica é (química) cross-linking envolvendo a ligação covalente de aminoácidos nas proximidades através de seus grupos funcionais. Por isso, reagentes químicos, reagentes UV-ativável ou ácidos aminados são independentes de15,16. Depois do cross-linking, as proteínas geralmente são hidrolisadas com proteases e reticulados di-peptídeos são analisados por espectrometria de massa acoplada a cromatografia líquida. A identificação dos produtos do cross-linking por banco de dados de pesquisa, no entanto, requer o uso de software especializado que concatenar sequências peptídicas de várias proteínas e regiões díspares17,18,19. O uso de cross-linkers químicas tem a vantagem que podem ser empregada para quase todos os complexos de proteína de interesse e não exige a incorporação de aminoácidos UV-ativável, que só pode ser alcançado quando expressar a proteína de interesse em células hospedeiras. Como tal, cross-linking é uma ferramenta versátil e foi empregado com sucesso em muitos estudos estruturais de proteínas grandes módulos (assemblies)20.
Espectrometria de massa de proteína intacta complexos (às vezes chamado de 'nativa' espectrometria de massa), por outro lado, envolve a análise de proteínas intactas e complexos sem hidrólise de proteínas em peptídeos. Ele revela a composição, heterogeneidade, estequiometria, topologia e subunidade interações da proteína complexos21,22. Em combinação com a mobilidade do íon, espectrometria de massa nativa mais permite a determinação da sua conformação23,24. Isso o torna uma ferramenta poderosa para a investigação estrutural de complexos de proteínas que são difíceis de avaliar por técnicas estruturais convencionais. No entanto, espectrometria de massa nativa requer buffers de análise que mantêm interações da proteína não-covalente durante a ionização electrospray. Isto geralmente é conseguido usando amortecedores aquosas, voláteis, tais como acetato de amônio25. Além disso, o instrumento modificações são necessárias para evitar a dissociação durante a transmissão em fase gasosa, o espectrômetro de massa26. Aplicado desta forma, muitos complexos de proteína (grande) foram analisados. Exemplos impressionantes são os estudos de ribossomas intacta27, ATP sintases28ou vírus29.
A combinação de espectrometria de massa nativa e cross-linking provou ser particularmente bem sucedida em estudos anteriores. Por exemplo, os stoichiometries de complexos de acompanhante, incluindo um inesperado dímero de Hsp70, poderiam ser obtidos experimentos de espectrometria de massa dos complexos proteína intacta, enquanto cross-linking química revelou o regime das proteínas na módulos (assemblies)30,31. Em um estudo diferente, foram estudados os efeitos das modificações borne-translational sobre uma intacta ATP sintase complexo. Espectrometria de massa nativa forneceu insights sobre a estabilidade de complexos de proteína na presença ou ausência de fosforilação ou acetilação de32,33. Então, um comparativo do cross-linking estratégia34 revelou mudanças conformacionais da proteína complexa sob diferentes condições.
Aqui, nós fornecemos os protocolos para identificação de proteínas por espectrometria de massa, cross-linking (química) e espectrometria de massa nativa, incluindo a análise dos dados e interpretação (Figura 1). A combinação de resultados complementares obtidas a partir desses métodos com a ajuda de dois complexos de proteína bem caracterizadas é demonstrada35. Nosso protocolo pode ser aplicado a qualquer conjunto de proteína que pode ser purificado em determinados pureza e concentração. A abordagem é em alguns casos limitados pela análise dos dados dos dados, ou seja, o tamanho do banco de dados do cross-linking empregada, que determina a necessária busca espaço e tempo. Além disso, a validação manual de ligações cruzadas identificadas é muitas vezes necessária e reduz ainda mais a saída. Espectrometria de massa nativa é limitada principalmente pela qualidade da amostra, por exemplo, amortecedores e adutos usado durante a purificação e a possibilidade de trocá-los por buffers aquosos e volátil. No entanto, complexos da proteína purificados para análise estrutural geralmente têm a qualidade necessária para análise de sucesso com nossos protocolos.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos químicos, reagentes, consumíveis</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]ácido etanossulfônico (HEPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>tampão</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>pH</td></tr><tr><td>Acetonitrila Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A955-1</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Amicon Ultra centrífugo dispositivos (MWCO diferente)</td> <td>Millipore</td>, <td>ou seja, UFC500396</td><td>troca de tampão, concentração</td></tr><tr>Solução de<td>acetato de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2706</td><td>MS nativo</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td>digestão em gel</td></tr><tr><td>Solução de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9859</td><td>pH</td></tr><tr><td>Bis (Sulfosuccinimidil) suberato-d0 (BS3-d0)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>21590</td><td>reticulador</td></tr><tr><td>Bis (Sulfosuccinimidil) suberato-d4 (BS3-d4)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>21595</td><td>reticulador</td></tr><tr><td>iodeto de césio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>calibração 203033</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de cálcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>digestão em gel</td></tr><tr><td>Capilares (1,0 OD &vezes; 0,78 ID &vezes; 100 L mm)</td> <td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>MS nativo</td></tr><tr><td>Suberato de disuccinimidil (DSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21655</td><td>reticulador</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545</td><td>digestão em gel</td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>solvente Etanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP2818</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Ácido fórmico Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>solução de</td></tr><tr><td>coloração Instant Blue Coomassie</td> para <td></td><td>eletroforese</td><td>em</td> gel</tr><tr><td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris géis (1 mm, 10 bem)</td><td>tecnologias de vida</td><td>NP0323BOX</td><td>eletroforese em gel</td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Digestão em gel</td></tr><tr><td>Álcool isopropílico, grau HPLC</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P750717</td><td>solvente</td></tr><tr><td></td><td>Metanol Fisher Chemicals</td><td>A456-212</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Micro BioSpin 6 colunas</td><td>BioRad</td><td>732-6222</td><td>troca de tampão</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidante</td><td>invitrogen</td><td>NP0005</td><td>tampão de execução, eletroforese em gel</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4 &vezes;)</td>buffer de carregamento de amostra <td>invitrogen</td><td>NP0007</td><td>(não redutor) para eletroforese em gel</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Tecnologias de vida útil do buffer em execução</td><td></td><td>NP0001</td><td>eletroforese em gel</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Tecnologias de vida útil do buffer em execução</td><td></td><td>NP0001</td><td>eletroforese em gel</td></tr><tr><td>Agente redutor de amostra NuPAGE (10 &vezes;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0004</td><td>agente redutor para eletroforese em gel</td></tr><tr><td>PBS - tampão salino tampolado com fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>tampão</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Marcador de proteína padrão prestained</td><td>invitrogen</td><td>LC5925</td><td>para eletroforese em gel</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>precipitação de etanol</td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil)tampão de 252859 aminometano (Tris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td><td>digestão em gel</td></tr><tr><td>Dispositivos centrífugos Vivaspin (MWCO diferente)</td><td>Sartorius</td>, ou seja<td>, troca de tampão</td><td>VS0101</td>, concentração</tr><tr><td>Água para HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>solvente</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td>Company</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Instrumentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Heraeus Fresco 21, centrífuga de bancada</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Flaming / Brown Extrator de micropipetas Modelo P-1000</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de geleletroforese Xcell SureLock MiniCell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Gold Coater Quorum Q150R S</td><td>Quorum Technologies Ltd.</td><td>Q150RS</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de gel horizontal Rotamax 120 T</td><td>Heidolph Instruments</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa Q-TOF Ultima, atualização de alta massa MS Vision</td><td>Waters (Micromass)</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>fase reversa C18 coluna analítica Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, tamanho de poro de 3 mm)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td></td></tr><tr><td>pré-coluna C18 de fase reversa (C18, 150 mm de diâmetro interno, 2 cm, tamanho de poro de 5 mm)</td><td>Bisturi</td><td>de 164213</td><td></td>Thermo Scientific</tr><tr><td>Centrífuga</td><td>a vácuo SPD121P</td><td>Fisher Scientifc</td> 10463989 <td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD121DP-230</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Pinça 5382000015</td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>AA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z680184-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico USC-TH, banho de sonicação</td><td>VWR</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>Sistema UltiMate Dionex 3000 nano-LC, acoplado ao espectrômetro de massa híbrido Q-Exactive plus (fonte nano-ESI)</td><td>Thermo Scientific</td><td>0726030+</td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software, Ferramentas de Software, Pesquisa de banco de dados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>www.matrixscience.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massign</td><td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Micromass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassMatrix</td><td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLink</td><td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ferramenta de conversão pXtract</td><td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UniDec</td><td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCalibur</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XiNET</td><td>http://crosslinkviewer.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XLinkX</td><td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xQuest</td><td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvis</td><td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Proteínas interagem com seus ligantes de forma ativa e dinâmica módulos (assemblies) que realizam várias funções celulares. Portanto, é fundamental para a compreensão dos processos celulares elucidar essas interações. No entanto, muitos complexos de proteína são assemblies dinâmicos e não são acessíveis por técnicas estruturais convencionais. Espectrometria de massa contribui para a investigação estrutural destes conjuntos, e particularmente a combinação de várias técnicas de espectrometria de massa fornece insights valiosos sobre seu arranjo estrutural.
Neste artigo, descrevemos a aplicação e a combinação de duas técnicas complementares de espectrometria de massa, ou seja cross-linking química juntamente com espectrometria de massa e espectrometria de massa nativa. Cross-linking química envolve a ligação covalente de aminoácidos nas proximidades usando reagentes químicos. Após digestão com proteases, reticulado de di-peptídeos são identificados por espectrometria de massa e sites de interações proteína são descobertos. Espectrometria de massa nativa por outro lado é a análise de conjuntos de proteína intacta na fase gasosa de um espectrômetro de massa. Ele revela que stoichiometries de proteína, bem como interações proteína e ligante. Ambas as técnicas, portanto, fornecer informações complementares sobre a estrutura da proteína-ligante assemblies e sua combinação provada poderosa em estudos anteriores.

A análise estrutural de proteínas e os complexos que formam é fundamental para a compreensão de sua função. Espectrometria de massa contribui consideravelmente para a investigação estrutural em que ele pode ser aplicado a quase todos os complexos turísticos, independentemente da dimensão ou heterogeneidade da amostra. Podemos exemplificar o protocolo usando dois complexos de proteína bem caracterizadas; Primeiro, a hetero-dodecamer RvB1/B2 de c. thermophilum e segundo, o CPS de hetero-octameric complexo de e. coli.
Primeiro, nós identificamos os componentes de proteína dos dois complexos. Para isso, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE (Figura 2) e gel de bandas foram cortadas do gel. Depois de em-gel a digestão das proteínas, a mistura de peptídeo foi analisada por espectrometria de massa acoplada a cromatografia líquida e massas do peptide e fragmento foram submetidas à pesquisa de banco de dados. Seguindo este fluxo de trabalho, identificamos todas as subunidades de proteína dos dois complexos com alta confiança, ou seja, um número elevado de peptídeos com golo de peptídeo razoável observou-se rendendo a cobertura alta sequência para todas as subunidades de proteína (tabela 1 ).
Então analisamos o intacto RvB1/B2 complexo por espectrometria de massa nativa (Figura 3A). O espectro de massa revelou duas espécies, uma em aproximadamente 8.000 m/z e outra espécie em aproximadamente 11.000-12.000 m/z. As massas calculadas para essas espécies correspondem o hexamérica (RvB1)3(RvB2)3 anel (aproximadamente 310 kDa) e o dodecameric duplo-anel (RvB1)6(RvB2)6 (cerca de 620 kDa). Ambas as séries de pico mostram duas populações; Estas originam uma mistura de subunidades de RvB2 sua marcados e não marcas na complexos. Uma estrutura de cristal para o complexo RvB1/B2 foi obtida anteriormente36 e mostra o arranjo do duplo-anel (Figura 3B). O espectro de massa nativo confirma, portanto, a estequiometria do dodecamer intacto e além disso, revela um complexo estável de sub. Além disso, as populações co existentes são identificadas.
Para identificar sites de interação da proteína no complexo RvB1/B2, nós quimicamente reticulado o complexo purificado com cross-linker BS3. Nós primeiro titulado a quantidade de BS3 durante a reação do cross-linking para determinar a concentração ideal. BS3 é amina específicos e covalentemente cadeias de laterais de lisina de ligações, bem como o N-termini de proteínas. A reação do cross-linking foi seguida por SDS-PAGE (Figura 2A). O complexo de non-cross-linked mostrou subunidades tanto RvB1 e RvB2. Adicionar BS3 a mistura de reacção causada ligação covalente das proteínas resultando em bandas de proteína no peso molecular mais elevado. O gel de SDS mostra que quantidades crescentes de BS3 produzem quantidades mais elevadas de reticulado espécie enquanto subunidades proteicas Cruz não-vinculadas são reduzidas. Em seguida, corte as bandas de proteínas do gel e seguiram o protocolo fornecido acima para identificar sites de interação de proteínas. Um espectro de exemplo de um reticulado di-peptídeo é mostrado (Figura 3). O espectro mostra série y de iões de ambos os peptídeos confirmando essa interação de proteínas. No total, obtivemos 14 interações da proteína, incluindo quatro ligações cruzadas entre subunidades RvB1 e RvB2 e duas ligações cruzadas entre duas cópias do RvB2 (tabela 2). Os resultados de BS3 cross-linking são visualizados em uma rede de interação (Figura 3D) mostrando interações intra moleculares, bem como interações entre diferentes subunidades. Ligações cruzadas intra moleculares sugerem que tanto RvB1 como RvB2 subunidades dobram de uma forma que domínios N - e C-terminal estão em estreita proximidade. Note, que interações intra moleculares não podem ser distinguidas de interacções inter moleculares de subunidade mesma neste caso. Inter moleculares ligações cruzadas entre as duas subunidades também foram observadas. Destas, duas ligações cruzadas inter moleculares entre RvB1 e RvB2 podem ser visualizadas na estrutura validando a abordagem do cross-linking. As outras ligações inter moleculares cruzadas estão localizadas em loops flexíveis que não estejam incluídos na estrutura de cristal. Também identificamos duas ligações cruzadas em RvB2 que contém as mesmas sequências peptídicas. Estas ligações cruzadas sem ambiguidade podem ser classificadas como inter molecular como eles devem ser provenientes de duas cópias da mesma proteína (Figura 3D). Nossos experimentos do cross-linking revelaram sites de interação da proteína dentro do complexo, mas também dentro as subunidades de proteína, fornecendo insights sobre seu arranjo estrutural que também pode ser confirmado pela estrutura existente de cristal (Figura 3B).
O segundo complexo de proteína que estudamos foi CPS. O espectro de massa nativo (Figura 4A) revelou três complexos de proteína entre 6.000 e 12.000 m/z. O maior complexo de 640 kDa corresponde a hetero-octamer intacto. Os complexos menores representam dois sub complexos; o dímero das pequenas e grandes subunidades de CPS (160 kDa) e um hétero-tetrâmero contendo duas cópias de cada subunidade (320 kDa). Estes complexos sub entregam primeiros insights sobre o conjunto de proteínas; ou seja, as grandes e pequenas subunidades estão em contato direto (como revelado por hetero-dímero) e o tetrâmero pode ser um produto de dois dímeros. Para obter mais informações sobre o arranjo estrutural no complexo de CPS intacto, realizamos a espectrometria de massa em tandem (MS/MS) da hetero-octamer e o hétero-tetrâmero. Em ambos os casos, a subunidade pequena dissociada do precursor, sugerindo que a subunidade pequena está localizada na periferia da Assembleia (Figura 4B). Com efeito, a subunidade pequena é periférica no cristal disponível estrutura (Figura 4)44.
Química do cross-linking usando o cross-linker BS3 também foi realizado. A ligação covalente das subunidades CPS usando quantidades crescentes, foi reforçada. Após a digestão das proteínas e análise dos peptides como descrito acima, muitas interações da proteína dentro da subunidade grande e uma ligação transversal na subunidade pequena foram obtidas (tabela 2). Além disso, semelhante do complexo RvB1/B2, encontramos duas ligações cruzadas inter moleculares entre duas cópias de grande subunidade CPS. Estas ligações cruzadas Coloque as duas subunidades grandes frente para o outro em seus lados C-terminal. Em um estudo anterior, combinando a espectrometria de massa estrutural e modelagem computacional35, nós identificamos três interações adicionais na grande subunidade que provavelmente se originam a partir da interface de duas cópias de grande subunidade validado pelo a estrutura de cristal e o modelo obtido (Figura 4 e tabela 2). Essas interações permitem que o arranjo do núcleo CPS complexo constituído por quatro subunidades grandes. No entanto, não há ligações de subunidade inter cruzadas entre subunidades grandes e os pequenos foram observadas. Inspecionando a estrutura de cristal disponível (Figura 4), torna-se aparente que a superfície de interação entre o núcleo tetramérica do complexo, consistindo a subunidade grande e as subunidades periféricas pequenas é muito pequena, o que pode explicar a ausência de interações inter subunidade. Isto é confirmado por espectrometria de massa nativa que mostrou que a subunidade pequena prontamente dissocia-se dos complexos intactos provavelmente devido a uma interface de ligação pequena. Não obstante, interações da proteína no CPS complexo combinado do cross-linking química e espectrometria de massa nativa permitem deduzir seu arranjo estrutural (Figura 4).
Tomados em conjunto, a combinação de espectrometria de massa nativa e química do cross-linking acoplada com espectrometria de massa identificação de peptídeos reticulados, permite a reconstituição do arranjo estrutural dos dois complexos de exemplo. Enquanto o cross-linking química revelou o arranjo das subunidades da proteína, por exemplo, as interações entre RvB1 e RvB2 ou dentro do núcleo tetramérica da CPS, espectrometria de massa nativa entregue stoichiometries de proteína dos complexos intactos e subcomplexes predominantes. No caso de CPS, para os quais não há interações inter moleculares entre as duas subunidades poderiam ser observadas pela química do cross-linking, espectrometria de massa nativa sugere que cada subunidade grande interage com uma subunidade pequena (Figura 4). Espectrometria de massa em tandem propôs a localização periférica de subunidade pequena no complexo e uma pequena interface entre as duas subunidades.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> Figura 1: fluxo de trabalho de espectrometria de massa nativa e cross-linking. Ambas as técnicas resultados complementares. Enquanto a espectrometria de massa nativa revela stoichiometries e módulos de interação, cross-linking dá insights sobre os sites de interação da proteína dentro dos complexos. Observe que cross-linking química só revela interações binárias. (A), o primeiro passo na espectrometria de massa nativa é troca de buffer para um buffer de voláteis e aquosa, usando unidades de filtro ou colunas de gel filtração. Espectrometria de massa dos complexos proteína intacta então revela sua estequiometria. Em experimentos de espectrometria de massa em tandem, subunidades periféricas são dissociadas. (B) para cross-linking química, o complexo de proteínas é incubado com um reagente do cross-linking. As proteínas reticuladas são então digeridas em peptídeos, que são posteriormente analisados por espectrometria de massa acoplada a cromatografia líquida. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> Figura 2: SDS-PAGE de reticulado RvB1/B2 (A) e CPS (B) complexos. (A) 2,5 µM RvB1/B2 foram carregados por gel de raia. A concentração de BS3 era variada. Non-Cruz-lig RvB1/B2 mostra as subunidades de dois proteína em cerca de 50 kDa. Adição de BS3 causou enlace covalente das subunidades da proteína resultando em bandas de proteína no peso molecular mais elevado. A quantidade de espécies reticulados é aumentada com altas concentrações de BS3. Condições óptimas do cross-linking são destaque (vermelho). (B) 10 µM CPS foram carregados por gel de raia. O grande (90 kDa) e pequeno (40 kDa) subunidades CPS são obtidas. Adição de BS3 causou enlace covalente das subunidades da proteína resultando em bandas de proteína no peso molecular mais elevado. Condições óptimas do cross-linking são destaque (vermelho). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> Figura 3: espectrometria de massa nativa e cross-linking química do complexo RvB1/B2. (A), o espectro de massa nativa revela duas espécies de RvB1/B2; o dodecamer intacto (ou seja, de6(RvB2) (RvB1)6) em aproximadamente 11.000 a 12.000 m/z e o hexamérica anel (RvB1)3(RvB2)3 em aproximadamente 8.000 m/z. Ambas as espécies mostram duas populações resultantes de RvB2 sua marcados e não marcados. O espectro foi modificado de35. (B) o cristal estrutura de RvB1/B2 é mostrada (PDB ID 4WVY). Alternância de RvB1 e RvB2 subunidades formam dois anéis hexamérica. (C) espectro de fragmentação de um reticulado di-peptídeo. O N-terminal da RvB1 foi reticulado com K23 de RvB1... série de y-íon foram obtido para ambos os peptídeos (vermelho e ciano). (D) Intra e inter protein interações obtidas no complexo RvB1/B2. Intra-cross-links são mostrados em vermelho, inter-cross-links são mostrados em azul. A inserção mostra duas ligações cruzadas inter moleculares entre subunidades RvB1 e RvB2, que podem ser visualizadas na estrutura de cristal (verde, inserção). Interações que se originam de duas cópias de RvB2 são mostradas como azuis linhas pontilhadas. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> Figura 4: espectrometria de massa nativa e cross-linking química dos CPS. (A), o espectro de massa nativa do CPS mostra três complexos. O hetero-dímero (160 kDa), hétero-tetrâmero (320 kDa) e a hetero-octamer (640 kDa). O espectro foi modificado de35. (B) espectrometria de massa em Tandem da tetramérica e octameric CPS complexo revelou dissociação de pequena subunidade CPS. (C) o cristal estrutura do CPS é mostrada (PDB ID 1BXR). As grandes subunidades formam um núcleo tetramérica e as pequenas subunidades estão localizadas na periferia do complexo. Inter moleculares ligações cruzadas entre duas cópias de grande subunidade são mostradas (verdes). (D) interações das grandes e pequenas subunidades CPS. Espectrometria de massa nativa revelou subcomplexes e sugere uma localização periférica de subunidade pequena. Ligações químicas cruzadas indicam arranjos no núcleo tetramérica da CPS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: resultados de pesquisa de banco de dados. As proteínas foram identificadas através da espectrometria de massa acoplada a cromatografia líquida e banco de dados. Os nomes de proteína, número e descrição, bem como a proteína de adesão em massa são dadas. A pontuação de proteína, número dos espectros observados por proteína e o número de sequências peptídicas observados estão listados. Os cinco peptídeos com maior pontuação de peptídeos de mascote estão listados para cada subunidade de proteína. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela 2: ligações cruzadas observaram em RvB1/B2 e CPS. As subunidades dos complexos e os resíduos de reticulado são dadas. O tipo de ligação cruzada (intra ou inter molecular) revelou-se de sequências de peptídeo sobreposição ou um anterior estudo35. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

A arquitetura de complexos de proteínas é essencial para a sua função. Combinar várias técnicas de espectrometria de massa provou poderosa para estudar seu assembly. Nós fornecemos protocolos para cross-linking química e espectrometria de massa nativa e mostrar como essas técnicas complementares ajudam a elucidar a arquitetura de assemblies multi o subunit da proteína.

Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

O objetivo geral da combinação de reticulação com espectrometria de massa nativa é obter informações estruturais complementares sobre conjuntos de proteínas de múltiplas subunidades que ajudem a elucidar seu arranjo tridimensional. A reticulação química e a espectrometria de massa nativa ajudam a responder a questões-chave em biologia estrutural, como composição, conectividade e estequiometria. A principal vantagem da combinação de várias técnicas é que são obtidas informações complementares que não estão disponíveis com apenas uma técnica.Nosso fluxo de trabalho pode ser aplicado a qualquer outro complexo proteico. Pode ser purificado a partir de sais ou tecidos ou pode ser reconstituído a partir de proteínas purificadas. Primeiro, aplique 7,5 microlitros de tampão simples quádruplo e três microlitros de agente redutor de 10 vezes no complexo proteico desejado.Gire a amostra por um minuto a 16, 200 vezes a gravidade. Após a centrifugação, aqueça a amostra por 10 minutos a 70 graus Celsius. Prepare um gel de quatro a 12% de gradiente para eletroforese e coloque o gel na câmara de eletroforese.Diluir 20 vezes com água o tampão de corrida previamente preparado e encher a câmara de eletroforese. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de antioxigênio à câmara interna. Carregue um marcador de proteína adequado na primeira cavidade do gel e as amostras de proteína nas cavidades restantes.Em seguida, separe as proteínas pelo período de tempo apropriado a 200 volts. Para corar as bandas de proteína, transfira o gel para uma caixa de coloração de gel e cubra o gel com uma solução de Coomassie à base de água. Incube o gel durante a noite em temperatura ambiente em um agitador de gel horizontal.No dia seguinte, remova a coloração do gel substituindo a solução de coloração por água. Repita a etapa anterior aproximadamente três a cinco vezes até que o fundo do gel pareça claro. Agora, corte as bandas de proteína que são visualizadas pela coloração azul de Coomassie dos géis usando um bisturi.Corte cuidadosamente as bandas de proteína em pequenos pedaços de aproximadamente um mililitro. Em seguida, lave as bandas de proteína com água e acetonitrila. Reduza as ligações dissulfeto com DTT e, em seguida, alquile os resíduos de cisteína com iodoacetamida.Em seguida, digerir as proteínas com tripsina conforme descrito no protocolo de texto. Para extrair os peptídeos, incube os pedaços de gel com bicarbonato de amônio e acetonitrila e colete o sobrenadante contendo peptídeos. Em seguida, incube os pedaços de gel com ácido fórmico a 5% e acetonitrila e colete o sobrenadante contendo peptídeos.Depois de coletar o sobrenadante contendo peptídeos, combine os dois sobrenadantes e seque os peptídeos extraídos evaporando os solventes em uma centrífuga a vácuo. Quando os peptídeos estiverem secos, misture-os com 20 microlitros de solução de acetonitrila a 2% e ácido fórmico a 0,1%. Dissolva os peptídeos com um banho de sonicação por dois a três minutos.Em seguida, gire a amostra em uma centrífuga a 16, 200 vezes a gravidade por 30 minutos. Depois de transferir a amostra para um frasco de amostrador automático, injete cinco microlitros em um sistema nano LC-MS/MS e carregue a mistura de peptídeos em uma pré-coluna C18 de fase reversa para dessalinizar e concentrar os peptídeos online. Remover o tampão de armazenamento de uma coluna de centrifugação de exclusão de tamanho por centrifugação a 1 000 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius durante um minuto.Depois de descartar o fluxo, lave a coluna três vezes adicionando 500 microlitros de acetato de amônio 200 milimolar seguido de centrifugação. Após a centrifugação, carregue 20 microlitros da amostra de proteína na coluna e centrifugue a 1.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por quatro minutos. Agora, coloque um capilar revestido de ouro previamente preparado em um suporte capilar.Abra a ponta de uma agulha e encha o capilar com um a quatro microlitros de amostra de proteína. Conecte o suporte capilar com a fonte de nano eletrospray do espectrômetro de massa e posicione a ponta do capilar em 0.5 a 1.5 centímetros em relação ao orifício do cone. Use gás nanofluxo de 80 a 150 litros por hora para iniciar a pulverização e ajustar o fluxo de gás para manter uma pulverização estável.Ajuste os parâmetros e a página de sintonia do instrumento Q-TOF. Em seguida, inicie a aquisição clicando no botão Adquirir e combine o maior número possível de varreduras para obter um bom espectro de massa. Dissolva 1,43 miligramas de BS3 e 100 microlitros de água para preparar uma solução estoque de 25 milimolares.Em seguida, adicione BS3 ao complexo proteico. Use quantidades variadas de BS3 para identificar a concentração ideal de reticulador. Incubar as misturas de reação a 25 graus Celsius por uma hora em um termomixer.Agora, execute a página SDS das proteínas reticuladas com um gel de gradiente de quatro a 12%. Corte as bandas de gel e digerir a proteína por digestão em gel, conforme descrito anteriormente. Após a obtenção dos peptídeos da digestão em gel, realize a espectrometria de massa acoplada à cromatografia líquida conforme descrito anteriormente.Todas as subunidades proteicas dos complexos heterododecâmero RvB1/B2 e heterooctamérico CPS foram identificadas com alta confiança. O espectro de massa de RvB1/RvB2 revela duas espécies que correspondem aos anéis duplos hexamérica e dodecâmrico. Uma estrutura cristalina para o complexo RvB1 / B2 mostra o arranjo do anel duplo.A adição de BS3 ao complexo RvB1 / RvB2 causa ligação covalente das proteínas, resultando em bandas de proteínas com maior peso molecular. E quantidades crescentes de BS3 produzem quantidades maiores de espécies reticuladas, enquanto as subunidades de proteínas não reticuladas são reduzidas. O espectro de dipeptídeos reticulados mostra séries de íons Y de ambos os peptídeos, confirmando essa interação proteica.Os resultados da reticulação BS3 são visualizados em uma rede de interação mostrando interações intramoleculares, bem como interações entre diferentes subunidades. O espectro de massa nativo do CPS mostra o heterodímero, heterotetrâmero e heterooctâmero. A espectrometria de massa em tandem do CPS tetrômico e octamérico revela dissociação da pequena subunidade CPS.A reticulação química do CPS com o reticulador BS3 mostra várias ligações cruzadas intramoleculares entre duas cópias da grande subunidade CPS. A estrutura cristalina revela que a superfície de interação entre o núcleo tetrâmico e as pequenas subunidades periféricas é muito pequena, o que pode explicar a ausência de interações entre subunidades. Uma vez dominado, nosso fluxo de trabalho pode ser feito em uma semana se executado corretamente.Como a montagem da proteína é muito complexa, é necessário tempo adicional para a análise dos dados. Seguindo este procedimento, a modelagem computacional pode ser realizada posteriormente para obter modelos tridimensionais dos complexos de proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de reticulação química e espectrometria de massa nativa até que essas duas técnicas complementares ajudem a elucidar as estruturas dos conjuntos de proteínas.

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Biologia

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Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

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