Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

O objetivo geral deste procedimento é isolar e cultivar células estromais da medula óssea, ou BMSCs. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos ósseo e adiposivo sobre células progenitoras. A principal vantagem dessa técnica é que as BMSCs podem ser isoladas de maneira relativamente rápida, repetível e barata.

A demonstração visual desse método é útil, pois as etapas de dissecação podem ser difíceis de explicar apenas com texto. Antes de iniciar o procedimento de coleta óssea, adicione 100 microlitros de meio de cultura de células-tronco da medula óssea em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada três ossos a serem colhidos. E corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 200 microlitros por tubo de microcentrífuga, de modo que cada ponta possa caber em um único tubo com as tampas fechadas.

Em seguida, coloque o primeiro camundongo eutanasiado de 78 semanas de idade em decúbito dorsal em uma placa de dissecção e borrife o animal com etanol a 70%. Use uma pinça para criar uma tenda de pele no abdômen e use uma tesoura de dissecção estéril para fazer uma incisão na pele de aproximadamente um centímetro. Retire a pele para expor a parte inferior do abdômen e as pernas.

Corte ao longo da crista ilíaca de cada quadril para separar as cabeças do fêmur da pelve e faça uma incisão na linha média da pelve para separar os ossos ilíacos e corte abaixo das articulações do tornozelo para remover os pés. Em seguida, separe a tíbia do fêmur cortando a articulação do joelho. Em seguida, use lenços sem fiapos para remover cuidadosamente o músculo dos fêmures, tíbias e ossos ilíacos.

Quando todos os ossos tiverem sido coletados, coloque as amostras em PBS no gelo e transfira as amostras para uma capela de cultura estéril. Usando a técnica estéril, faça cortes de um a dois milímetros nas extremidades proximal e distal de cada osso antes de colocar três ossos em cada ponta de micropipeta modificada nos tubos de microcentrífuga. Colha a medula óssea dos ossos por centrifugação, confirmando se a medula foi completamente peletizada para o fundo de cada tubo de microcentrífuga no final da centrifugação.

Se toda a medula tiver sido coletada, os ossos parecerão brancos. Remova as pontas da micropipeta e os ossos dos tubos de coleta para descarte adequado de biossegurança. Para plaquear as células da medula óssea, primeiro use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 25 para ressuspender lentamente os pellets e quebrar quaisquer aglomerados, e agrupe as amostras em um único tubo cônico de 15 mililitros.

Adicione 10 mililitros de meio de cultura de células-tronco da medula óssea por 500 microlitros de amostra e filtre a suspensão celular através de um filtro de 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros para remover quaisquer fragmentos ósseos. Após a contagem, semeie as células da medula óssea em uma vez 10 elevado à sexta células por centímetro quadrado de densidade em meio de cultura fresco para uma incubação de 72 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2. No terceiro dia, substitua o sobrenadante por meio fresco, trocando o meio a cada dois dias até que as células atinjam 80% a 100% de confluência.

Para plaquear uma cultura populacional de células de medula óssea dividida, coloque as células de medula óssea colhidas de um camundongo em uma placa de cultura de células de 10 centímetros por 48 horas em meio de cultura fresco em uma incubadora de cultura de células. No segundo dia de cultura, remova o sobrenadante contendo células-tronco hematopoiéticas não aderentes e lave cuidadosamente a placa com PBS, sem perturbar as células da medula óssea aderentes. Substitua o PBS por 0,25% de tripsina.

Após um a três minutos a 37 graus Celsius, extinguir a reação com meio de cultura de células frescas e contar as células na suspensão celular resultante. Centrifugue o número apropriado de células para o revestimento e ressuspenda o pellet em meio de cultura fresco suficiente para a densidade de revestimento desejada. Em seguida, coloque as placas na incubadora de cultura de células até a confluência.

Para induzir a diferenciação de osteoblastos de células-tronco da medula óssea, substitua o meio de cultura celular por meio de diferenciação a cada dois dias, até que as células comecem a produzir nódulos brancos de mineralização que possam ser observados macroscopicamente. Para induzir a diferenciação de adipócitos de células-tronco da medula óssea, substitua o meio de cultura de células de uma cultura de células de medula óssea confluente por meio de indução de adipócitos. Após dois dias de cultura, substitua o sobrenadante por meio de indução de adipócitos fresco, mudando para meio de base de adipócitos no quarto dia.

No sétimo dia, confirme se as células acumularam gotículas lipídicas e se exibem um fenótipo semelhante aos adipócitos maduros. Para diferenciar as células-tronco hematopoiéticas em osteoclastos, quando uma cultura de células da medula óssea total ou cultura de células não aderentes se tornar aderente, substitua o meio de cultura de células pelo meio de diferenciação de osteoclastos. Troque o meio a cada dois dias e verifique a diferenciação dos osteoclastos diariamente sob um microscópio óptico com ampliação de 10x até que os osteoclastos se fundam e formem células multinucleadas, normalmente por volta dos dias cinco a sete de diferenciação.

Culturas confluentes de BMSCs podem ser diferenciadas em osteoblastos usando um meio osteogênico composto de ácido ascórbico e betaglicerofosfato. Após alguns dias de diferenciação, os osteoblastos começam a expressar fosfatase alcalina. E uma diferenciação adicional desencadeará a produção da matriz osteóide e, finalmente, a mineralização dessa matriz.

Curiosamente, apenas uma proporção das células se diferenciará em osteoblastos in vitro, conforme revelado pela coloração violeta de cristal. Quer sejam usadas populações mistas ou populações de células da medula óssea divididas, apenas uma proporção das células se diferenciará em adipócitos, que aparecem como células redondas com vários vacúolos lipídicos que podem ser corados com corante O vermelho óleo. As culturas de células-tronco humanas suplementadas com fator estimulante de células murinas e RANKL se fundirão rapidamente para formar células multinucleadas que coram positivo para TRAP.

Esses osteoclastos são capazes de reabsorver a matriz mineral in vitro e podem ser usados para avaliar a atividade osteoclástica. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em menos de uma hora, se for executada corretamente, dependendo do número de camundongos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de esterilizar as ferramentas e preparar os meios com antecedência, para poder trabalhar o mais rápido e assepticamente possível.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e cultivar células estromais da medula óssea.