Name: Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar células do estroma da medula óssea de ratos com este protocolo rápido e reprodutível. Este método permite diferenciar osteoblastos, adipócitos e osteoclastos para pesquisa em biologia óssea.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (AR061164-01A1 R01).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso para o Maine Medical Center Research Institute e institucional Cuidado Animal.
1. coleção tubos de preparação
<ol><li>Fazer os meios de cultura BMSC, completando meio essencial mínimo α (α MEM) com 10% de soro Fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Coloque 100 µ l de BMSC de meios de cultura em tubos de 1,5 mL microcentrifuge. 3 ossos geralmente vão caber em um único tubo então preparar conformemente.</li>
	<li>Corte as extremidades das pontas de pipetas da 200 µ l de suficiente para que eles se encaixam em tubos de centrífuga. Insira as pontas dentro dos tubos e certifique-se de que as tampas podem fechar antes de colocar os tubos no gelo. Nota: Como alternativa, tubos de microcentrifuga 0,75 mL com o corte de pontas podem ser inseridos no tubo microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
</ol>2. colheita de ossos de ratos
<ol><li>Eutanásia em animais usando CO2 , seguido por deslocamento cervical e pulverizá-los com etanol a 70%. Nota: Certifique-se que são utilizados animais de mesmo sexo e, de preferência, da mesma idade. Rotineiramente usamos animais com idades entre 7 a 8 semanas. Recomendamos que o pool de células pelo menos 3 animais por grupos experimentais para produzir uma população de células representativas e reprodutíveis a melhor.</li>
	<li>
Coloque o mouse euthanized em suas costas num tabuleiro de dissecação. Use fórceps para criar uma tenda de pele no abdômen. Faça uma pequena incisão (cerca de 1 cm) com uma tesoura estéril de dissecação. Descasca a pele para os membros e os pés do corte para expor a parte inferior do abdome e as pernas.
	<ol>
<li>Corte abaixo do tornozelo conjunta para remover o pé. Corte ao longo da crista ilíaca no quadril para separar a cabeça do fêmur do osso ilíaco. Enquanto o mouse está ainda em suas costas, fazer uma incisão no meio do osso ilíaco para separar os dois ossos ilíacos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando lenços fiapos, cuidadosamente remova o músculo os fêmures, tíbias e ossos ilíacos. Nota: Corte o máximo dos tendões e músculos do osso como torna possível a limpeza mais rápida e mais fácil com as toalhitas de fiapos (por exemplo, kimwipes). Tenha cuidado ao manipular os ossos como eles tendem a quebrar facilmente e sua fragilidade pode ser aumentada com determinados genótipos.</li>
	<li>Uma vez que todas as amostras têm sido dissecadas, colocá-los em PBS no gelo e mover-se para uma capa de cultura estéril para as etapas restantes de isolamento. Nota: Trabalhar assepticamente possível reduzirá o potencial de contaminação nas culturas.</li>
	<li>Faça pequenos cortes (cerca de 1 a 2 mm) em ambas as extremidades proximais e distais dos ossos antes de colocá-los em dicas seccionadas dentro dos tubos de centrífuga. Nota: Certifique-se para cortar uma quantidade suficiente para que a medula pode ser centrifugada para fora; no entanto, deve ter cuidado para evitar cortar demais como populações de células tendem a variar com base na proximidade dentro do espaço de medula.</li>
	<li>Centrifugação a 10.000 x g por 15 s à temperatura ambiente. Certifique-se que todo o tutano é liberado e peletizado na parte inferior do tubo de 1,5 mL, enquanto que os ossos estão dentro as inserções (ou 200 µ l pipeta ponta ou 0,75 mL microcentrifuga tubo). Depois de toda a medula é recolhida, remova as inserções com os ossos dos tubos de coleta. Nota: Se é liberada toda a medula, os ossos aparecerá brancos. No entanto, se a medula permanece em certos ossos, tente extremidades de corte novamente e centrifugar.</li>
</ol>3. suspensão
<ol><li>Usando uma agulha 25g, puxe a célula pelotas acima e para baixo lentamente para separar grupos e combinar todas as amostras em um tubo cônico único 15 mL. Adicione 10 mL de meio de cultura BMSC por 500 µ l de amostras.</li>
	<li>Coloque um filtro de 70 µm em cima de um tubo cónico de 50 mL e a suspensão de células atravessam este filtro para retirar fragmentos de osso possível.</li>
</ol>4. chapeamento e cultura das populações mistas de células da medula óssea (BMCs Total)
Nota: As células são cultivadas a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO2.
<ol><li>Calcular o número de células e placa-los em 1.0 x 106 células/cm2 em meios de cultura. Permita a 72 h de cultura mista de células anexar. Nota: Recomendamos diluir a suspensão de célula 20 x em meios de cultura e diluir novamente em trypan azul antes de contar as células usando um hemocytometer. Para camundongos C57Bl6/J machos de 7 semanas de idade, nós rotineiramente ceder um número de celular de cerca de 50 x 106 células mas idade, sexo e tensão podem afetar o número de celular grandemente. Nota: Uma população de mistura das pilhas deve anexar na parte inferior da cultura bem.</li>
	<li>Depois de 72 h, remova a mídia e substituí-lo com a nova mídia. Continue mudando os meios de comunicação cada outro dia e verificar se há confluência. Quando as células atingem 80-100% confluência, eles estão prontos para a diferenciação. Nota: Porque esta cultura é misturada com BMSCs e linfócitos, isso pode ser usado diretamente para osteoblastogenesis, adipogenesis, bem como osteoclastogenesis.</li>
</ol>5. chapeamento e cultura da população de Split de BMSCs (BMSCs aderentes)
Nota: As células são cultivadas a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO2.
<ol><li>Placa de todas as células coletadas dos fêmures, tíbias e ilíacos ossos de um rato em um prato de cultura de 10 cm (55 cm2 de área de cultura). Nota: Quando o pool de camundongos C57BL/6J de 2-3, nós tipicamente placa esta população 'total' da medula óssea em um balão de2 a 150 cm.</li>
	<li>Após 48 h de cultura mista, remova a mídia de cultura (que contém o linfócitos não-aderente). Se osteoclastogenesis experiências devem ser executadas, definir esta população de células não-aderente à parte (veja seção 7), se não, aspirado e descartar essas células.</li>
	<li>Lave o placa/frasco com PBS como cuidadosamente para não perturbar as células anexadas.</li>
	<li>Remover o PBS e levantar as células adicionando tripsina 0,25% e incubar a 37 ° C, durante 1-3 min Quench a tripsina adicionando mídia celular à suspensão de células. Neste ponto, o BMSCs, que agora é levantado, que podem ser contado (como feito anteriormente no passo 4.1) e chapeado para experiências futuras.</li>
	<li>Calcule o número de células necessárias para o chapeamento. Centrifugue o volume necessário de suspensão de células a 1.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Nota: As células normalmente são banhadas com base em experiências de ponto de extremidade. Por exemplo, se deve ser isolado da proteína/RNA nós tipicamente chapear em uma densidade mais elevada (~1.0-2.0 x 106 células/poço em placa de 6).</li>
	<li>Remova a mídia e ressuspender as células no volume de meios de cultura necessário para o chapeamento. As células em meios de cultura, de acordo com as experiências da placa e lhes permitem anexar por alguns dias. Quando os BMSCs chegarem a confluência, dirijam-se para realizar a diferenciação.</li>
</ol>6. diferenciação de BMSCs
<ol><li>
Osteoblastos
	<ol>
<li>Faça mídia de diferenciação osteoblástica adicionando 800 µ l de 1m β-glicerol fosfato em PBS e 200 µ l de ácido ascórbico de 0,5 M em PBS a 99 mL de meios de cultura BMSC (consulte a etapa 1.1 para a composição dos meios de cultura a BMSC).<ol>
<li>Uma vez que as culturas de BMSCs (BMCs totais da etapa 4.3) ou aderente BMSCs da etapa 5.6 são confluentes, diferenciá-los em osteoblastos alternando-se os meios de cultura para mídia de diferenciação osteoblástica.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Substitua a mídia diferenciação todos os dias. Células começam a produzir nódulos brancos de mineralização. Visualizá-las a olho nu no fundo do poço; Este processo pode ocorrer dentro de alguns dias a 3 semanas.<ol>
<li>Para avaliar osteoblastogenesis, realize a coloração da fosfatase alcalina e/ou Von Kossa coloração sobre os poços, conforme descrito na seção 8. Nota: Altere a mídia cuidadosamente pela inclinação das placas em um ângulo ligeiro para evitar perturbações da monocamada a célula.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipócitos
	<ol>
<li>Faça mídia base adipócito pela mistura de 90 mL de meio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM) glicose alta, 10ml de soro Fetal bovino, 1 mL de penicilina/estreptomicina, 100 µ l 20mm Rosiglitazona e 100 µ l de 2 mM de insulina. Se necessário, armazene essa mídia a 4 ° C para a semana durante o experimento de diferenciação.</li>
		<li>Faça mídia de indução dos adipócitos adicionando-se 200 µ l de 62,5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) e 25 µ l de 1mm dexametasona a 25 mL de mídia de Base dos adipócitos.</li>
		<li>Uma vez que as culturas de BMSCs (BMCs totais da etapa 4.3) ou aderente BMSCs da etapa 5.6 são confluentes, altere os meios de comunicação para mídia de indução dos adipócitos. Considere este dia 0 de diferenciação.</li>
		<li>Após 48 h, remova a mídia e atualizar a cultura com mídia de indução dos adipócitos.</li>
		<li>No dia 4, alterne para a mídia de base dos adipócitos. Nota: Gotículas lipídicas podem começam a aparecer tão cedo quanto dia 2 ou 4 dias.</li>
		<li>No dia 7, observe que as células acumularam gotículas lipídicas máxima e exibir um fenótipo semelhante a dos adipócitos maduros. Não cultura por esse ponto, como pode resultar morte/destacamento de célula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. diferenciação dos linfócitos em osteoclastos
<ol><li>Faça Osteoclast diferenciação mídias pela adição de 50 µ l de 25 µ g/mL de Receptor ativador de VHC ligante (RANKL) e 15 µ l de 25 µ g/mL de macrófagos (mCSF) fator estimulante da colônia para 25 mL de meio de cultura BMSC.</li>
	<li>Depois os BMCs totais (da etapa 4.3) ou as células não-aderente (da etapa 5.2) são anexadas ao poço, meios de cultura pode ser alternado para mídia de diferenciação do Osteoclast. Repor os meios de diferenciação todos os dias.</li>
	<li>Observe as culturas osteoclast cada dia sob um microscópio com ampliação de 10x. Observe que osteoclastos se fundem e formam células multinucleadas, tipicamente em torno de 5-7º dia de diferenciação.</li>
</ol>8. coloração
<ol><li>
Osteoblastos Nota: Para a coloração da fosfatase alcalina (AP), que muitas vezes usam uma coloração AP kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com as orientações.<ol>
<li>Execute AP coloração, seguindo as orientações do fabricante do kit.<ol>
<li>Aspirar a mídia e enxágue células com PBS. Consertar as células com 4% paraformaldeído (PFA) em PBS por 12 min à temperatura ambiente.</li>
			<li>Entretanto, fazer a solução de AP usando os reagentes do kit de coloração adicionando 500 µ l do AP nitrito de sódio, solução alcalina-FRV 500 µ l e misturando delicadamente; deixe descansar por 2 min. Adicione 22.5 mL dH2O e 500 µ l naftol AS-BI alcalina. Misture suavemente. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.</li>
			<li>Uma vez que as células são fixos, enxaguar com PBS e adicionar solução de AP a cada poço (1 a 2 mL por bem). Cubra com papel alumínio e deixe a mancha por 30 min em temperatura ambiente protegida da luz. Aspirar a solução, lavar com água destilada e deixar a placa secar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adquira imagens de colônias manchadas usando uma câmera para observar células positivas de fosfatase alcalina.</li>
		<li>Como alternativa, execute Von Kossa em vez de coloração da fosfatase alcalina. Por isso, poços de lavagem com água destilada como qualquer restantes PBS precipitará com nitrato de prata.
		<ol>
<li>Consertar as células com 4% PFA em PBS por 12 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicione o suficiente solução de nitrato de prata 5% para cobrir o poço e expor à luz forte por 1h à temperatura ambiente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Remova a solução de nitrato de prata e lave cada poço com água destilada. Adicionar a solução de tiossulfato de sódio a 5% para as células e deixar repousar durante 3 min.</li>
		<li>Aspirar o tiossulfato de sódio e lave com água destilada. Deixe a placa secar e observar o depósito mineral corado em marrom escuro/preto com olho nu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipócitos
	<ol>
<li>Para a mancha de óleo vermelho O (ORO), consertar as células usando a 10% neutro tamponado formol por 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Entretanto, fazer a solução de estoque ORO pela dissolução de 0,035 g em 10 mL de isopropanol. Isto é suficiente para uma placa de 6. Misturar e transferir a solução usando um filtro de papel (poros tamanho 11 µm).</li>
		<li>Fazer a solução de trabalho de ORO diluindo 9 mL de solução-mãe de ORO com 6 mL de água destilada. Deixe a solução em um roqueiro até que esteja pronto para uso.</li>
		<li>Preparar o isopropanol 60% em água destilada (suficiente para cobrir cada um fazer bem).</li>
		<li>Uma vez que as células são fixos, remova o fixador e lave uma vez com água destilada. Substitua a água com a solução de isopropanol 60% por 1 min. Nota: Adicione o líquido lentamente enquanto derrubando a placa; adipócitos desalojar muito facilmente.</li>
		<li>Remover o isopropanol e adicionar solução de trabalhar bastante ORO para cobrir todas as células. Incube durante 15 min em um balancim de baixa velocidade à temperatura ambiente. Remover ORO e lavar duas vezes com água destilada. Nota: neste ponto, gotículas lipídicas ORO-manchadas podem ser visualizadas sob o microscópio.</li>
		<li>Para quantificar o ORO, destain o ORO, adicionando 1 mL de isopropanol 100% a cada poço e agite-o lentamente por 10 min.</li>
		<li>Entretanto, preparar uma série de diluição para criar uma curva padrão baseada nos seguintes 8 padrões usando solução de trabalho de ORO (2.100 µ g/mL) e isopropanol como diluente: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 e 0 µ g/mL.</li>
		<li>Carregar a 200 µ l das normas e as amostras destained em triplica em um prato e ler a absorvância a 490 nm.<ol>
<li>Determine a concentração de ORO para cada amostra com base na curva padrão. Nota: Recomendamos que normalizar a concentração ORO para o celular. Número do celular pode ser quantificado pela coloração violeta cristal ou a quantidade de DNA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoclastos Nota: Quando estiver pronto, nós sugerimos coloração osteoclastos para kit de resistente ao tartarato ácido fosfatase (armadilha) usando a coloração de armadilha (ver Tabela de materiais).<ol>
<li>Armadilha de coloração, corrigi células por 30 min à temperatura ambiente com glutaraldeído 2,5% em PBS. Entretanto, fazer a solução de armadilha pela mistura de 50 µ l da solução de Base rápido granadas, 50 µ l de nitrito de sódio, 4,55 mL de água destilada, 50 µ l de Napthol AS-Biphosphate, 200 µ l de solução de acetato e solução de tartarato de 100 µ l.</li>
		<li>Aspire o fixador e lave as células com PBS duas vezes antes de adicionar a solução de armadilha para 1 h a 37 ° C.</li>
		<li>Lavar com água destilada antes da contagem de osteoclastos sob um microscópio (ampliação 10x). As células de armadilha+ aparecem roxas com 3 ou mais núcleos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li>
<li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li>
<li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li>
<li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9(2015).</li>
<li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60(2008).</li>
<li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li>
<li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li>
<li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li>
<li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li>
<li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li>
<li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40(2012).</li>
<li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li>
</ol>

Os autores divulgar que eles têm não financeiro conflito de interesses.

Neste artigo, apresentam-se dois métodos de cultura de BMSCs com suas vantagens e limitações. Isolar as células provenientes da medula óssea é um processo relativamente fácil. No entanto, a obtenção de uma população de células representativa dos progenitores osteoclástica ou células-tronco mesenquimais pode ser um desafio devido ao ambiente celular diverso da cavidade da medula.
Cultivo a totalidade do conteúdo da medula óssea fornece uma representação perto do microambiente no vivo ....

BMSCs murino primárias são comumente usados como um modelo in vitro de células-tronco mesenquimais, desde a sua descoberta no início dos anos 19801. Na verdade, culturas de células de plástico aderente liberadas da cavidade da medula óssea dos ossos longos mantêm a capacidade de ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos, condrócitos ou adipócitos em muitos estudos2,3, 4 , 5. no entanto, a medula óssea é um tecido exclusivo composto de muitas populações de células diferentes, incluindo, mas não limitado a, BMSCs, linfócitos, células endoteliais e imunes. Assim, o isolamento e as técnicas de cultura podem render populações de células com diferente homogeneidade. Usando essas técnicas para testar a potencial de diferenciação de células pode ser um desafio. Por exemplo, ao comparar células de ratos com diferentes genótipos, começando com uma população de célula mista limita a interpretação dos dados. Inversamente, a obtenção de populações homogêneas de BMSCs e linfócitos pode ser tecnicamente difícil e pode não ser tão representativa de um modelo ex vivo .
Em nosso laboratório, nós estamos principalmente interessados na utilização de BMSCs devido ao seu potencial a ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos. Aqui, apresentamos técnicas de isolamento BMSCs e linfócitos e cultura usada para avaliar osteoblastogenesis ou adipogenesis em vitro, assim como culturas de linfócitos de se diferenciarem em osteoclastos. Um método utiliza uma população mista de células da medula óssea (BMCs) contendo BMSCs e linfócitos diretamente apropriados para adipogenesis, osteoblastogenesis e osteoclastogenesis (chamado BMCs Total). Este método é uma representação de ex vivo perto da heterogeneidade encontrada entre as células do microambiente da medula óssea. Outro método separa aderente de células não-aderentes na tentativa de populações "puras" de cultura de BMSCs e linfócitos (chamados BMSCs aderente). O método posterior permite a cultura de pilha experimentos para iniciar com um número mais exato de BMSCs ou linfócitos e reduz o potencial de complexos efeitos indiretos de outras populações de células que permanecem na cultura. Ambos os métodos foram previamente publicados e usados para tratar diferentes pesquisas perguntas6,7,8,9.

<table><tbody><tr><td>200&mu; Pontas de pipeta em L</td><td>Tubos</td> de centrífuga <td>Rainin 17014401</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL USA</td><td>Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Tampão com fosfato salino (PBS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Science</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr>Ferramentas <td></td><td></td><td></td>de<td>dissecação</td></tr><tr><td>70 &mu; Filtros M</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0,25% de tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Microscopia Eletrônica Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Fosfatase Alcalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de Prata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Tiossulfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Vermelho O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina Tamponada Neutra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filtro Grau 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>Kit de fosfatase ácida resistente ao tartarato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Elétron</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&alfa;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerol fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Alta Glicose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman Chemical</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer microscópio inversor</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Células do estroma da medula óssea (BMSCs) constituem uma população de células rotineiramente utilizada como uma representação de células-tronco mesenquimais in vitro. Eles residem dentro da cavidade da medula óssea, ao lado de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos), que pode dar origem a células vermelhas do sangue, progenitores imunes e osteoclastos. Assim, extrações de populações de células resultados da medula óssea em uma mistura muito heterogénea de diferentes populações de células, que pode apresentar desafios em delineamento experimental e confundir a interpretação dos dados. Várias técnicas de cultura e isolamento foram desenvolvidas em laboratórios a fim de obter mais ou menos homogêneas populações de BMSCs e linfócitos in vitro. Aqui, apresentamos dois métodos para isolamento de BMSCs e linfócitos de ossos longos de rato: um método que produz uma população mista de BMSCs e linfócitos e um método que tenta separar as populações de duas células com base em aderência. Ambos os métodos fornecem células apropriadas para osteogênico e adipogenic diferenciação dos experimentos de ensaios, bem como funcionais.

Visão geral das culturas de células As técnicas de duas cultura permitem a avaliação da diferenciação em uma população mista de BMCs composto de BMSCs e linfócitos (BMCs Total, figura 1A) ou de uma população de BMSCs separou-se linfócitos (BMSCs aderente, figura 1B). 48 horas depois que as células da medula são isoladas e chapeado (Figura 1), eles rapidamente anexar a parte inferi...

Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e cultivar células estromais da medula óssea, ou BMSCs. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos ósseo e adiposivo sobre células progenitoras. A principal vantagem dessa técnica é que as BMSCs podem ser isoladas de maneira relativamente rápida, repetível e barata.A demonstração visual desse método é útil, pois as etapas de dissecação podem ser difíceis de explicar apenas com texto. Antes de iniciar o procedimento de coleta óssea, adicione 100 microlitros de meio de cultura de células-tronco da medula óssea em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada três ossos a serem colhidos. E corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 200 microlitros por tubo de microcentrífuga, de modo que cada ponta possa caber em um único tubo com as tampas fechadas.Em seguida, coloque o primeiro camundongo eutanasiado de 78 semanas de idade em decúbito dorsal em uma placa de dissecção e borrife o animal com etanol a 70%. Use uma pinça para criar uma tenda de pele no abdômen e use uma tesoura de dissecção estéril para fazer uma incisão na pele de aproximadamente um centímetro. Retire a pele para expor a parte inferior do abd

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Neste vídeo, demonstramos o isolamento e a cultura de células estromais da medula óssea dos ossos longos de camundongos. Os BMSCs aderentes isolados podem ser usados para análise posterior.

Isolamento e cultura de células estromais da medula óssea de uma tíbia de camundongo

Este vídeo demonstra a diferenciação das células estromais da medula óssea (BMSCs) em adipócitos. No processo de duas etapas, na presença de fatores de crescimento e hormônios específicos, as BMSCs indiferenciadas primeiro se diferenciam em pré-adipócitos. A segunda etapa envolvendo o tratamento com glicose e insulina leva à formação de adipócitos maduros com múltiplas gotículas lipídicas.

Diferenciação de células estromais da medula óssea de camundongos in vitro em adipócitos

Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

A sinalização Notch é uma forma de comunicação celular que depende do contato direto entre as células. Para induzir adequadamente a sinalização Notch in vitro, os ligantes Notch devem ser apresentados às células em estado imobilizado. Este protocolo descreve métodos para estimulação in vitro da sinalização Notch em precursores de osteoclastos de camundongos.

Estimulação da sinalização Notch no mouse osteoclastos Precursores

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Os osteoclastos são polykaryons tecido-específicos do macrófago derivados da linhagem do monocyte-macrófago de pilhas de haste hematopoietic. Este protocolo descreve como isolar pilhas da medula de modo que as grandes quantidades de osteoclastos sejam obtidas ao reduzir o risco de acidentes encontrados em métodos tradicionais.

Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos.  Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Aprenda a isolar e cultivar células do estroma da medula óssea de ratos com este protocolo rápido e reprodutível. Este método permite diferenciar osteoblastos, adipócitos e osteoclastos para pesquisa em biologia óssea.

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

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