Name: Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a criar modelos ex vivo de explantes e culturas dissociadas de gânglios da raiz dorsal em ratos para investigar neuroplasticidade e respostas neuronais a patógenos.

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Agradecemos sinceramente o Imaging-facilidade do núcleo na Universidade do centro-oeste (UTH) e o grupo de estudantes [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo e Casey Sigerson] por suas contribuições no trabalho de imagem e cultura de células. Este trabalho de pesquisa foi apoiado pelo UTH intramuros conceder financiamento para fundos de start-up M.F. e pesquisa para V.T.

Todos os procedimentos, incluindo o uso dos animais foram aprovados pelos protocolos de aprovado Conselho de revisão institucional (IACUC-Midwestern University).
1. colheita DRG de embriões do rato
<ol><li>
Eutanásia de ratos adultos pelo método de asfixia (CO2) seguidos por decapitação. Seguir para a coluna vertebral de remover cirurgicamente.
	<ol>
<li>Expor a coluna vertebral, reduzindo a camada de pele dorsalmente, usando tesouras bem. Isole a coluna vertebral, cortando através das costelas de cada lado da coluna e Sacro separando a coluna vertebral do resto do animal.</li>
		<li>Monte a coluna vertebral (lado ventral para cima) para uma esteira cirúrgica usando agulhas/pinos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando uma tesoura fina faça um duplo corte em ambos os lados dos corpos vertebrais para expor o lado ventral do canal vertebral.</li>
	<li>Sob um microscópio cirúrgico (ampliação definido como 4 X), use a tesoura para mover suavemente a medula espinhal do lado para expor as raízes na espinha dorsais contralaterais e localize o DRG, junto as raízes dorsais dos nervos periféricos. Cada gânglio é parcialmente escondido dentro do Forame intervertebral.</li>
	<li>Para colher o DRG, comprima a raiz dorsal (entre a medula espinhal e o DRG) com uma pinça e puxe delicadamente para fora o DRG do Forame intervertebral.</li>
	<li>Coloque a segunda pinça no nervo espinhal periféricas para o DRG e puxe o DRG juntamente com o nervo espinhal e a raiz da coluna vertebral.</li>
	<li>Coloque o DRG coletado em uma placa de Petri contendo 3 mL de soro gelado mídia livre (SFM)34de 35 mm.</li>
	<li>Transferir cada DRG individual em um vidro seco de Petri e, sob um microscópio cirúrgico, limpe e retire as fibras em excesso e ainda ligado ao DRG usando uma lâmina de tecido conjuntivo. A DRG é facilmente identificável como uma barrigudo estrutura transparente ao longo da nervo espinhal/raiz branca. Os vasos sanguíneos muitas vezes encontram-se em torno da DRG.</li>
	<li>Coloque o DRG limpo em uma nova placa de Petri contendo mídia gelada de SFM.</li>
	<li>Dilua a mistura gelatinosa de proteína (ver Tabela de materiais) em gelada SFM (1:1).</li>
	<li>Placa da DRG ex vivo em placas boas 12 pré-revestido com 10/20 µ l de mistura gelatinosa da proteína e defini-las dentro da incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por 30-60 min.</li>
	<li>Delicadamente adicione 1,5-2 mL de SFM no sistema de cultura para cobrir o explante inteiro e manter os explantes em cultivo condições (37 ° C e 5% CO2). Nota: Este é um passo crítico porque DRG é ancorado para os pratos de vidro apenas pela mistura polimerizada proteína gelatinoso. Tempo de polimerização e pipetagem habilidades são essenciais para evitar flutuação.</li>
	<li>Alterar o meio de cultivo DRG cada 72 h e deixar o DRG crescer para contanto que precisava.</li>
</ol>2. isolar neurônios única célula de DRG
<ol><li>Lugar o DRG todos coletados em um tubo estéril de 1,5 mL com 1,2 mL de F12 mídia contendo 1,25 mg/mL de colagenase IV e -incubar a 37 ° C e 5% de CO2 por 45 min. Repita este passo para mais 45 minutos após a primeira incubação.</li>
	<li>Trate de explantes com 2 mL de F12 mídia contendo tripsina (0.025%) durante 30 minutos imediatamente após o tratamento de colagenase IV em 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Incube com 2 mL de F12 mídia contendo soro bovino fetal (FBS; 33%) a 37 ° C e 5% CO2 por 15 min.</li>
	<li>Lave explantes três vezes com 2 mL de mídia F12 e prossiga para dissociar--los mecanicamente com uma pipeta de vidro até que a mídia se transforma nublada. Nota: Este procedimento envolve a coleta de DRG limpar/aparada do animal como explicado na seção anterior. Ao executar a dissociação mecânica de explantes, seja gentil e não exerça força excessiva, uma vez que pode levar a derrames e perda de material de trabalho.</li>
	<li>A cultura de células dissociadas do filtro através de um filtro de 0,22 µm para remover quaisquer impurezas e o excesso de tecido conjuntivo. Centrifugue o filtrado celular lisado a (2.500 x g) por 2 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de neurobasal mídia que contém o suplemento para cultura neuronal (1x), mistura de antibiótica (1x), L-glutamato (0,5 mM) e fator de crescimento (5 µ g/mL) do nervo (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>As células dissociadas em slides capa laminina-revestido (50 µ g/mL; ver Tabela de materiais) da placa em uma densidade de celular preferido. Determine a densidade de células usando um contador de célula. Nota: Nós chapeado células no slide de células/tampa 25.000. Esta técnica permite a dissociação de neurônios e células gliais do satélite. O componente glial co cultivado com os neurônios pseudounipolar desempenha um papel crítico para a sobrevivência neuronal.</li>
</ol>3. HSV-1 infecção de explantes DRG e DRG-derivado de células dissociadas
Nota: Este trabalho foi feito seguindo estritamente os requisitos de (BSL-2) de nível 2 de biossegurança a que nós temos um laboratório totalmente equipado que é aprovado pelo Comitê de biossegurança Midwestern University. Neste estudo, utilizou-se uma estirpe de KOS de HSV-1. Por favor tome medidas adequadas e precauções de segurança, conforme orientações de instituições locais se trabalhando com estirpes de vírus.
<ol><li>Determinar e preparar o vírus nas diluições em meios SFM infectar o modelo corretos. O vírus utilizado neste estudo foi KOS estirpe de HSV-1. Quando trabalhando com derivados de DRG dissociada de células, use 1 unidade da multiplicidade de infecção (MOI) para a infecção, o que significa o número de vírus igual o número de células.</li>
	<li>Se infectar DRG explants, use o número de virions (por exemplo, 10.000 virions) porque não é possível determinar um número exato de células em um explante.</li>
	<li>Coloque as explante/células infectadas com o vírus em uma placa de células estéreis ou tubo contendo uma mistura de SFM media e vírus. Nota: Usamos 25.000 virions para um slide de capa contendo 25.000 células (1 MOI). Para infectar um explante, usamos 10.000 virions.</li>
	<li>Coloque a placa de células ou o tubo a 37 ° C para a infecção ocorrer; tempo de exposição viral pode variar dependendo da infectividade viral. Nota: Entrada Viral foi confirmada usando orto-nitrofenil-β-galactoside (ONPG) e 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) ensaios26.</li>
</ol>4. imunofluorescência
<ol><li>Corrigi os explantes e única célula amostras em formol 4%, preparado em tampão fosfato soro fisiológico (PBS). Lave as amostras por 10 min cada por 3 vezes em PBS.</li>
	<li>Incubar as amostras com anticorpos primários desejados (anti-β-tubulina, anti-peripherin, anti-heparan sulfato (HS), e/ou antiglicoproteína anticorpos de D (gD); ver Tabela de materiais para as diluições) diluídos em tampão PBS com 0,3% Triton-X (PBST) e 10 % de soro de cabra normal. Armazenar as amostras em 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Lave as amostras por 10 min cada com PBS por 3 vezes. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 1 h em anticorpo secundário apropriado (488 e/ou Cy3; consulte Tabela de materiais para as diluições) diluído em PBS.</li>
	<li>Lave as amostras por 10 min cada com PBS por 3 vezes. Incube as amostras com corante Hoechst (1,5 µM) em PBS por 20 min antes da etapa de montagem.</li>
	<li>Monte as amostras em lâminas de vidro usando um meio de montagem de fluorescência e lamela.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada de divulgação.

O modelo ex vivo DRG é extremamente útil para investigar um amplo espectro de eventos tais como interação neurônio-glia, bem como o efeito do microambiente em ambos do metabolismo neuronal e glial37. Além disso, a DRG-modelo poderia ser usado como uma ferramenta de baixo custo para abordar questões relevantes referentes ao mecanismo de patogenicidade e associado a marcadores desenvolvendo ex vivo sistemas para fase aguda de crônica e latente da infecção, ou em uma determinada doe...

Neste manuscrito, relatamos um método para obter um modelo ex vivo de organotypic de um sistema de modelo DRG rato derivado como um microambiente de tecido-como preservado para investigar uma ampla gama de respostas biológicas aos insultos PNS variando de neurônio-glia interação, neuroplasticidade, marcadores inflamatórios, a infecção viral. Além disso, temos desenvolvido um protocolo para criar uma cultura co primária de neurônios sensoriais único DRG-derivado e células satélites.
A DRG são cinza-matéria-unidades-satélites localizadas fora do sistema nervoso central (CNS) junto as raízes na espinha dorsais dos nervos espinhais. A DRG, localizado nas proximidades do Forame intervertebral, casa pseudounipolar neurônios sensoriais e por satélite células gliais. Os neurônios pseudounipolar apresentam um único axônio que se divide em um processo periférico transportando insumos somáticos e viscerais de alvos periféricos para o corpo celular e um processo central que envia informações sensoriais do corpo celular para o CNS. Uma cápsula Conectiva define e isola este aglomerado periférico de neurônios e células gliais do SNC. Sem migração celular pós-natal para ou a partir da DRG já foi descrita e um nicho de células-tronco local é responsável por neurogênicos eventos que ocorrem ao longo da vida1. Portanto, este modelo é particularmente adequado para estudar a neurogénese adulta, axonogênese, resposta a lesão traumática e célula morte2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
No campo das Epilepsias, DRG colhidos na vivo e explantados em vitro reproduz axoniotmese, uma condição de lesão na quais axônios são totalmente cortados e o corpo celular neuronal é desconectada o alvo inervado10 ,11. É sabido que lesão de nervo periférico pode causar aumento e diminuição da expressao em DRG e muitas destas alterações são resultado de processos regenerativos, mas muitos também podem ser um resultado da resposta imune ou outra resposta de células não-neuronais. Usando um ex vivo sistema de DRG isolada, um pouco dessa complexidade é removido e vias mecanicistas podem ser investigadas mais facilmente.
Além de seu papel central na transmissão de entradas sensoriais ao SNC, a abundância de receptores para muitos neurotransmissores incluindo GABA12,13,14,15 a nível do soma neuronal, bem como provas de interneuronal Cruz-excitação podem sugerir que DRG são sofisticados integradores preliminares de entradas sensoriais16,17. Estas novas descobertas conferem ao explante DRG as características de um sistema de rede mini-neuronal semelhante a outros modelos de "mini cérebro", que são organoids nervoso-tecido-específica usada para campos experimentais mais amplos de investigação e terapêutica abordagem de doenças neurológicas18,19. Estas evidências juntamente com o facto do DRG um cluster discreto e bem definido de tecido neuronal, rodeado por uma cápsula conectiva, torná-lo um órgão apropriado para transplante ex vivo .
Rato de cultivo DRG apresenta uma opção atraente multicelular para modelar pathophysiologies humanos devido às similaridades estruturais e genéticas entre as espécies. Além disso, um grande repositório de cepas de rato transgénico é muito propício para futuros estudos mecanicistas. Extensão do axônio tanto durante o desenvolvimento e após lesão requer interações mecânicas entre crescimento cone e substrato20,21. Substratos nano e microcom estampas têm sido usados como ferramentas para direcionar a consequência natural do axônio e demonstrar a sua capacidade para responder às características topográficas no seu microambiente. Os neurônios foram mostrados para sobreviver, aderir, migrar e orientar seus axônios para navegar características de superfície tais como sulcos em substratos22,23. No entanto, estes estudos utilizaram tipicamente linhas de células cultivadas e é difícil prever como neuronal primária as células irá responder às sugestões bem definidas e física na vivo ou ex vivo.
O modelo ex vivo explante de rato DRG usado para esta proposta imita a interação célula-célula real e bioquímicas sugestões em torno de axônios crescentes. Entre muitos diferentes paradigmas experimentais variando de regeneração axonal, produção de neurosphere, a neuroinflammation, a DRG explant modelo continua a servir como uma valiosa ferramenta para investigar o aspecto de latência e infecção viral dentro sensorial gânglios24,25,26,27.
Sistema nervoso (NS) em geral é alvo para infecções virais28,29,30. A maioria dos vírus infectam superfícies de células epiteliais e endoteliais e fazer o seu caminho desde a superfície do tecido para o NS através de nervo periférico fibras sensoriais e motoras. Em particular, o vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) após uma infecção inicial nas células epiteliais estabelece uma latência ao longo da vida nos gânglios sensoriais, de preferência, a DRG da PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacidade de infectar o PNS acaba por conduzir a doenças neurológicas33.

<table><tbody><tr><td>Camundongos adultos NIH / Swiss</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm placa de Petri</td><td>Cell Treat</td><td>229635</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel ECM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1270</td><td>mistura de proteínas gelatinosas</td></tr><tr><td>F12 Mídia Gibco</td><td></td><td>11765-054</td> <td>* Parte da mídia SFM</td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de 0,22um</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Mídia neurobasal</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27 Gibco</td><td></td><td>17504-044</td><td>Suplemento para cultura neuronal</td></tr><tr><td>Antibióticos PSN</td><td>Gibco</td><td>15640-055</td><td>*Parte da mídia SFM Mistura antibiótica</td></tr><tr><td>L-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>*Parte do meio SFM</td></tr><tr><td>NGF</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100 Fator de</td><td>crescimento nervoso</td></tr><tr><td>Lâmina de cobertura revestida com laminina</td><td>Neuvitro</td><td>GG-14-Laminina</td><td></td></tr><tr><td>ONPG subtrato</td><td>Pierce</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520034</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-B-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8328</td><td>diluição 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-periferina</td><td>Millipore</td><td>AB1530</td><td>diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Corante Hoechst Thermo</td><td>Fisher</td><td>62249</td><td>1.5 &micro; M concentração final</td></tr><tr><td>Anti-heparano sulfato</td><td>US Biológico</td><td>H1890-10</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>Anti gD anticorpo</td><td>Virostat</td><td>196</td><td>Diluição 1:10</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>*Parte da mídia SFM</td></tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>21010-046</td><td>*Parte da mídia SFM</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>*Parte da mídia SFM</td></tr><tr><td>KIT (Insulina-transferrina-Selênio-A)</td><td>Gibco</td><td>51300-044</td><td>*Parte da mídia SFM</td></tr><tr><td>Vitamina-C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td>*Parte da mídia SFM</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>*Parte da mídia SFM</td></tr><tr><td>488 (anti-rato de cabra)</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 (anti-coelho de cabra)</td><td>Jackson Immunoresearch laboratories</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal&nbsp;</td><td>Solução de formalina vetorial</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5014-120ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector</td><td>H-1500</td><td>Flurescência montagem</td></tr><tr><td>Diamond White Glass Coverslides</td> Globo <td>Científico</td><td>1380-20</td><td></td></tr></tbody></table>

rato adulto drg explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção viral

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

Este protocolo descreve um modelo ex vivo de rato-derivado de raiz de dorsal gânglio (DRG) explante e in vitro DRG-derivado co-cultura de neurônios sensoriais dissociados e células gliais do satélite. Estes são modelos útil e versátil para investigar uma variedade de respostas biológicas, associados a condições fisiológicas e patológicas do sistema nervoso periférico (SNP) variando de interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e infecção viral. O uso de explant DRG é cientificamente vantajoso em relação aos modelos de células únicas simplista, por várias razões. Por exemplo, como uma cultura de organotypic, o explante DRG permite transferência ex vivo de toda uma rede neuronal incluindo o microambiente extracelular que desempenham um papel significativo em todas as funções neuronais e gliais. Além disso, DRG explantes também podem ser mantidas ex vivo por vários dias e as condições de cultura podem ser perturbadas como desejado. Além disso, a DRG colhido pode ser dissociado ainda mais em uma em vitro co-cultura de neurônios sensoriais primários e células gliais satélites para investigar a interação neuronal-gliais, neuritogenesis, interação de cone axonal com o extracelular microambiente e mais geral, qualquer aspecto associado com o metabolismo neuronal. Portanto, o sistema de DRG-explante oferece uma grande flexibilidade para estudar uma grande variedade de eventos relacionados às condições biológicas, fisiológicas e patológicas em uma maneira cost-effective.

Múltiplos aspectos da interação neuroplasticidade e neurônio-ambiente podem ser investigados usando DRG e um modelo de cultura única célula dissociada. Começamos os estudos isolando um explante DRG e células dissociadas DRG-derivado, como esquematicamente representadas na Figura 1. Ambos os tecidos e modelos de células únicas podem ser analisados usando uma variedade de técnicas moleculares, tais como a imunofluorescência, Western blot, ensaios de genômicos e outras técnicas analíticas, depe...

Neste relatório, destacam-se as vantagens de organotypic culturas e culturas primárias dissociadas dos gânglios das raízes de dorsais do mouse-derivado para investigar uma ampla gama de mecanismos associados a interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e resposta à infecção viral.

Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um modelo ex vivo de explante de gânglios da raiz dorsal e/ou modelo de célula dissociada primária derivada de DRG para investigar as respostas neuronais a pistas ambientais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroplasticidade ou neuroinflamação em resposta à exposição a patógenos. A principal vantagem desta técnica é que os explantes dos gânglios da raiz dorsal mantêm a complexidade semelhante a um órgão útil para iniciar o ciclo celular em ação e mudanças no microambiente intercelular devido a tratamentos específicos.A demonstração cuidadosa desse método é muito crítica, pois na identificação de DRGs, bem como na coleta deles, pode ser bastante difícil devido ao seu tamanho e localização. Para iniciar este procedimento, exponha a coluna vertebral cortando a camada de pele do animal, dorsalmente usando uma tesoura fina. Em seguida, isole a coluna vertebral cortando as costelas em ambos os lados da coluna e através do sacro, separando a coluna vertebral do resto do animal.Em seguida, monte a coluna vertebral com o lado ventral para cima em um tapete cirúrgico usando agulhas e alfinetes. Em seguida, faça um c

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um método para desenvolver gânglios da raiz dorsal ou cultura de explante DRG e modelos de células dissociadas em DRG usando tecidos isolados de DRG de camundongo. Esses modelos ajudam a estudar vários mecanismos com interações neurônio-glial em um ambiente controlado.

Gerando explante de gânglio da raiz dorsal e cultura de células dissociadas

Este vídeo demonstra a geração de um modelo de lesão neuronal em neurônios granulares cerebelares primários de camundongos. Ele descreve as etapas envolvidas na indução de lesão neuronal usando NMDA, um agonista excitatório do receptor de neurotransmissor, e glicina, um co-agonista. O NMDA e a glicina se ligam a receptores neuronais específicos, causando sua superestimulação e resultando em um influxo maciço de cálcio intracelular, o que leva a danos e morte das células neuronais.

Modelagem de lesão neuronal em neurônios granulares cerebelares primários de camundongos

Este vídeo descreve a geração de um modelo de lesão neuronal usando espécies reativas de oxigênio (ROS) em neurônios granulares cerebelares primários de camundongos. Ele detalha o processo de indução do estresse oxidativo adicionando altas concentrações de peróxido de hidrogênio. A exposição a ROS causa quebras de fita de DNA e instabilidade genômica. Além disso, a oxidação das proteínas celulares prejudica suas funções, enquanto a peroxidação lipídica compromete a integridade da membrana. Essa...

Modelagem da morte neuronal induzida por espécies reativas de oxigênio em neurônios de grânulos cerebelares de camundongos

Modelos de cultura celular proporcionar um controle detalhado sobre as condições ambientais e, assim, proporcionar uma plataforma poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular neuronal. Nós descrevemos um método rápido, barato e confiável para isolar, dissociar e cultura neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Os detalhes da preparação substratos e imunocitoquímica também são fornecidos.

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Neste artigo, descrevemos, em detalhes, um protocolo para a geração de culturas neurosferas a partir de células-tronco neurais de camundongos pós-natal derivadas dos principais nichos neurogênicos do rato. As neuroesferas são usadas para identificar células-tronco neurais do tecido cerebral permitindo a estimativa de números de células precursoras. Além disso, essas estruturas 3D podem ser banhadas em condições diferenciais, dando origem a neurônios, oligodendrócitos e astrócitos, permitindo o...

Isolamento e Expansão das Neuroesferas a partir de Nichos Neurogênicos de Camundongos (P1-3)

O modelo de inoculação do footpad é uma ferramenta valiosa para caracterizar respostas neuroinflamatórias invulgadas pelo viral in vivo. Em particular, fornece uma avaliação clara da cinética viral e processos imunopatológicos associados iniciados no sistema nervoso periférico.

Modelo de inoculação do footpad do mouse para estudar respostas neuroinflamatórias induzidas pelo viral

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

Apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neurorregenerativa de glia ensheathing glia (OEG), após lesão neural. Baseia-se em uma cocultura de neurônios gânglios de retina adulto axotomizados (RGN) em monocamadas OEG e estudo subsequente de regeneração axonal, analisando marcadores axonal e somatodendritic RGN.

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

Este protocolo apresenta uma maneira única de gerar culturas de células do sistema nervoso central a partir de cérebros embrionários de camundongos do dia 17 para pesquisa em neuro(imuno)logia. Este modelo pode ser analisado usando várias técnicas experimentais, incluindo RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo.

Estabelecendo culturas mistas de células neuronais e gliais de cérebros embrionários de camundongos para estudar infecção e imunidade inata

Este protocolo descreve a expressão ectópica mediada por vírus de Neurod1 após acidente vascular cerebral isquêmico cortical. O Neurod1 é administrado (1) usando o sistema Cre-Flex AAV em camundongos do tipo selvagem durante a fase subaguda pós-AVC (7 dias) e (2) usando um único vetor AAV em camundongos repórteres condicionais durante a fase crônica pós-AVC (21 dias).

Sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-AVC isquêmico

Aqui, fornecemos uma metodologia detalhada para isolar a retina do olho do camundongo para experimentação ex vivo estendida. Este protocolo enfatiza tornar essa abordagem tecnicamente exigente acessível para pesquisadores que gostariam de aproveitar os caminhos de pesquisa oferecidos pela manutenção da glia retiniana in situ em tecido vivo.

Um modelo de explante ex vivo para estudar interações gliais na retina de camundongos

Aprenda a criar modelos ex vivo de explantes e culturas dissociadas de gânglios da raiz dorsal em ratos para investigar neuroplasticidade e respostas neuronais a patógenos.

Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral (Vídeo) | JoVE Journal

Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral

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