Síntese de funcionalizados 10 nm polímero-revestida com partículas de ouro para o direcionamento do endotélio e entrega da droga

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar nanoesferas de ouro revestidas com polímero funcionalizado com 10 nanômetros de diâmetro, biocompatíveis, com tempo de circulação estendido e que podem ser visualizadas com microscopia de fluorescência. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em cardiologia sobre a permeabilidade do endotélio em condições doentes. A principal vantagem dessa técnica é que ela cria partículas ultrapequenas biocompatíveis que possuem grupos funcionais disponíveis para maior personalização.

Primeiro, em um tubo de microcentrífuga, dilua 12 microlitros de 80% THPC com um mililitro de água ultra pura. Fixar um balão de fundo redondo de 100 ml sobre uma placa de agitação magnética. Adicione ao frasco 45 mililitros de água e uma pequena barra de agitação em forma de ovo.

Comece a mexer a água a 300 RPM. Adicione ao frasco 0,5 mililitro de uma solução molar de hidróxido de sódio e um mililitro da solução diluída de THPC. Continue mexendo vigorosamente a mistura de reação por cinco minutos.

Em seguida, adicione dois mililitros de uma solução de ácido cloroáurico 25 milimolar à mistura de reação, mexendo sempre. Confirme se a mistura de reação amarela se torna marrom escuro em segundos, indicando a formação de nanopartículas de ouro carregadas negativamente e com tampa de THPC. Continue mexendo a mistura por 15 minutos.

Enquanto a mistura se agita, prepare uma solução aquosa de amina heterobifuncional PEG tiol, carboximetil PEG tiol e metoxi monofuncional PEG tiol. Depois que a mistura de reação de nanopartículas de ouro tiver agitado por 15 minutos, reduza a velocidade de agitação para 100 RPM. Adicione as soluções de PEG gota a gota à mistura enquanto mexe.

Continue mexendo suavemente a mistura durante a noite em temperatura ambiente. Em seguida, feche uma extremidade de uma membrana de celulose MWCO de 12-14 kilodalton com um clipe de diálise. Use uma pipeta para transferir a mistura de reação para a membrana.

Feche a outra extremidade da membrana com um segundo clipe de diálise. Dialisar a mistura de nanopartículas contra quatro litros de água agitada a 60 RPM por 72 horas. Troque a água a cada duas horas nas primeiras seis horas e a cada seis a 12 horas depois disso.

Em seguida, filtre a mistura de nanopartículas de ouro peguilado semipurificado através de um filtro de seringa de 0,2 micrômetro, em um tubo cônico de 50 mililitros. Congele a solução de nanopartículas purificada a 80 graus Celsius negativos por cerca de cinco horas. liofilizar as nanopartículas purificadas usando um liofilizador.

Para começar a preparar as nanopartículas fluorescentes de ouro peguilado, prenda um frasco de fundo redondo de 100 mililitros sobre uma placa de agitação magnética. Adicione 18 mililitros de água ultra pura e uma pequena barra de agitação em forma de ovo ao frasco e comece a mexer a 100 RPM. Em um tubo cônico de quatro mililitros, combine dois miligramas de nanopartículas de ouro peguiladas liofilizadas com dois mililitros de água.

Em seguida, transfira a solução de nanopartículas para o frasco de fundo redondo para posterior reconstituição. Adicione um mililitro de um tampão de carbonato molar de pH 8,8, 0,1 às nanopartículas reconstituídas, mexendo. Em seguida, adicione cinco microlitros de uma solução de 10 miligramas por mililitro de um éster fluorescente de anidroxisuccinimida em sulfóxido de dimetila.

Embrulhe o frasco em papel alumínio para excluir completamente a luz. Continue mexendo a mistura de nanopartículas fluorescentes durante a noite em temperatura ambiente. Em seguida, dialisar a mistura contra quatro litros de água por 72 horas usando o procedimento descrito na preparação das nanopartículas de ouro peguilado.

Mantenha o recipiente coberto com papel alumínio durante a diálise. Separe um mililitro das nanopartículas peguiladas fluorescentes purificadas para caracterização. Congele, liofilize e armazene as nanopartículas fluorescentes restantes a quatro graus Celsius.

Para visualizar o núcleo de nanopartículas de ouro com microscopia eletrônica de transmissão, primeiro coloque 10 microlitros da solução de nanopartículas fluorescentes purificadas em uma grade MET de malha revestida de carbono. Deixe a gota descansar por cinco minutos. Em seguida, use papel de filtro para remover cuidadosamente o excesso de fluido da borda da grade MET, até que apenas uma película das nanopartículas fluorescentes permaneça na grade.

Imagem das nanopartículas em 80 quilovolts, com uma ampliação de 50.000 a 150.000. Para medir o tamanho da nanopartícula hidrodinâmica, coloque um miligrama de nanopartículas de ouro revestidas com THPC liofilizadas em um tubo de microcentrífuga. Adicione um mililitro de água a cada tubo e transfira as soluções para cubetas de plástico transparente de um mililitro.

Avalie cada solução com espalhamento dinâmico de luz e meça os diâmetros hidrodinâmicos esféricos das partículas. Em seguida, transfira a cubeta contendo as nanopartículas de ouro peguilado fluorescente para um espectrofluorômetro. Defina o comprimento de onda de exotação para 633 nanômetros e leia os sinais de emissão de 650 a 800 nanômetros.

Em seguida, para avaliar a biocompatibilidade em concentrações de 7 nanopartículas, primeiro pipete 100 microlitros de uma suspensão de células endoteliais de almofada de gordura de rato em DMEM em cada um dos 21 poços de uma placa tratada com cultura de tecidos estéreis de fundo transparente de 96 poços. Incubar as células até que a confluência seja alcançada e, em seguida, obter sete soluções de nanopartículas fluorescentes em DMEM com concentrações variando de zero a 1000 microgramas por mililitro. Aspire o DMEM dos poços.

Coloque 100 microlitros de cada uma das sete soluções de nanopartículas em cada um dos poços separados em triplicata. Deixe as células e nanopartículas incubarem por 16 horas. Em seguida, aspire o DMEM e as nanopartículas suspensas ou frouxamente fixadas dos poços.

Adicione 100 microlitros de DMEM fresco contendo 20 microlitros de uma solução MTS/PES a cada poço. Incube as células a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, avalie a viabilidade celular por análise clorométrica a 492 nanômetros com o leitor de placas.

Em seguida, semeie células endoteliais de almofada de gordura de rato em lamínulas de vidro estéreis de 12 mililitros a 10.000 células por centímetro quadrado. Alimente as células com DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de estreptomicina de penicilina. Incubar as células até que a confluência total seja alcançada.

Modifique o glicocálice endotelial, se desejar, e, em seguida, incube as células com 550 microgramas por mililitro de nanopartículas de ouro fluorescentes por 16 horas. Preparar as células para a microscopia de imunofluorescência. Monte cada lamínula em uma lâmina de microscópio com meio de montagem antidesbotamento contendo DAPI.

Sele as bordas da lamínula com esmalte. Imagem das células endoteliais imunocoradas com microscopia confocal. Visualize os núcleos, o glicocálice de sulfato de heparina e as nanopartículas com canais azuis, verdes e vermelhos distantes, respectivamente.

TEM de nanopartículas de ouro revestidas com THPC, mostrou diâmetros de partícula de dois a três nanômetros. O MET das nanopartículas peguiladas só pôde confirmar a presença de partículas dispersas, pois o PEG não é visível nas imagens de MET. O DLS das nanopartículas revestidas e peguiladas com THPC mostrou uma mudança no diâmetro da partícula de pico de 2,5 nanômetros para 10,5 nanômetros.

A emissão fluorescente teve um máximo entre 660 e 672 nanômetros quando excitada com luz de 633 nanômetros, o que foi consistente com a emissão máxima esperada em 665 nanômetros para a sonda fluorescente usada. As células endoteliais do coxim de gordura de rato mostraram níveis semelhantes de viabilidade após 16 horas de co-incubação com nanopartículas de ouro pegoladas fluorescentes em concentrações de até um miligrama por mililitro, indicando que não há toxicidade significativa das nanopartículas. A absorção mínima de nanopartículas foi observada em células endoteliais de almofada de gordura de rato com glicocálices saudáveis.

Ocorreu uma captação significativamente maior em células com glicocálices degradados, como mostrado pelo aumento dos sinais fluorescentes vermelhos das nanopartículas. Após este procedimento, modificações adicionais, como a conjugação nos grupos funcionais abertos, podem ser feitas para modificar as partículas para direcionamento específico de um componente do endotélio ou administração de um medicamento.