Um ensaio de Blot Dot quantitativa para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional do vírus Adeno-associado Assembly-ativação de proteínas

Este método pode determinar os títulos de vácuo AV purificados e não purificados e avaliar a capacidade do AAV AAP de promover a montagem de sorotipia AV cognata e heteróloga. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um método simples e barato que evita as desvantagens de outros métodos de titulação de AAV. Embora esse método tenha sido comumente usado para quantificação de vetores AAV, ele também pode ser aplicado para abordar várias questões fundamentais sobre a biologia do AAV, conforme mostrado neste protocolo.

No dia zero, após a cultura de células HEK 293 a 90% de confluência, prepare o reagente de transfecção misturando os plasmídeos em 96 microlitros de PBS sem cálcio ou magnésio em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitro. Conforme indicado nesta tabela, a quantidade total de DNA é de dois microgramas por poço. Adicione quatro microlitros de solução de PEI à mistura de DNA do plasmídeo PBS.

O volume final é de aproximadamente 100 microlitros ou 5% do volume do meio de cultura. Vortex os tubos brevemente e incube a mistura de DNA PEI em temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, gire brevemente os tubos em uma microcentrífuga para coletar o líquido para o fundo.

E adicione a mistura de DNA PEI gota a gota ao meio de cultura em cada poço da placa de cultura HEK 293. Em seguida, agite suavemente as placas e devolva-as a uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de CO2. A transfecção da célula HEK 293 é um componente crítico deste protocolo para a produção de vírus de alto título.

Devem ser utilizadas células saudáveis e de baixo número de passagem, devendo ser tomado cuidado para não romper a monocamada das células. Nos dias um e dois, sob um microscópio de fluorescência invertida, observe as células transfectadas com o plasmídeo PCMVGFP para avaliar a eficiência da transfecção. No quinto dia, pipete as células e o meio contendo vírus para cima e para baixo ou use um raspador de células para raspar todas as células.

Em seguida, transfira a suspensão para tubos cônicos de polipropileno de 15 mililitros. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até o uso. Para recuperar as partículas virais, descongele rapidamente os tubos congelados em banho-maria a 37 graus Celsius.

Em seguida, vortex os tubos vigorosamente por um minuto para maximizar a recuperação de AAV das células. Pulverize os detritos celulares por centrifugação a 3.700 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, transfira 200 microlitros do sobrenadante de cada tubo para tubos de microcentrífuga rotulados com tampas de rosca para o ensaio de dot blot.

Para tratar as amostras com endonuclease de Serratia marcescens, prepare os reagentes da mistura A e da mistura B. Adicione 10 microlitros de cada reagente a cada tubo de amostra. Vortex as amostras por cinco segundos e gire-as brevemente para coletar o líquido no fundo dos tubos.

Em seguida, incube os tubos a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora. Depois de girar brevemente as amostras, realize o tratamento com proteinase K preparando o reagente da mistura C e adicionando 180 microlitros a cada tubo. Então, depois de fazer o vórtice e girar brevemente os tubos novamente, incube-os a 55 graus Celsius por uma hora.

Assim que as amostras retornarem à temperatura ambiente, adicione 200 microlitros de fenol-clorofórmio e vortex os tubos por um minuto. Em seguida, gire as amostras em uma microcentrífuga a 16, 100 vezes G e temperatura ambiente por pelo menos cinco minutos. Transfira 320 microlitros da camada aquosa ou 80% do volume do fluido aquoso para um novo tubo de microcentrífuga padrão.

Esta etapa de transferência é extremamente importante, pois o mesmo volume deve ser retirado da amostra para manter a precisão da quantificação do AAV. Deve-se tomar cuidado para evitar a fase orgânica durante a remoção da camada aquosa. Preparar o reagente da mistura D e adicionar 833 microlitros a cada tubo de amostra.

Depois de vórtice dos tubos, incube-os a menos 80 graus Celsius por pelo menos 20 minutos. Após a centrifugação, despeje o sobrenadante e seque os tubos uma vez em uma toalha de papel limpa. Pipete aproximadamente 500 microlitros de etanol a 70% em cada tubo e vortex os tubos por cinco segundos.

Depois de girar as amostras novamente, despeje o sobrenadante e seque os tubos uma vez em uma toalha de papel limpa. Em seguida, seque os pellets a 65 graus Celsius antes de ressuspendê-los em tampão TE. Para realizar o ensaio de dot blot, prepare padrões de DNA de plasmídeo diluindo o DNA do plasmídeo do genoma vetorizado AAV para 10 nanogramas por microlitro em água ou tampão Tris-HCL.

Transferir uma alíquota de 25 microlitros do ADN plasmidial diluído para um novo tubo e linearizá-la com uma enzima de restrição adequada num volume de reacção de 50 microlitros durante uma hora. Adicione 450 microlitros de água ou TE ao tubo que contém o padrão de DNA do plasmídeo digerido e misture bem. Em seguida, transfira 70 microlitros dessa mistura para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com 1.330 microlitros de água ou TE para fazer um padrão de plasmídeo diluído.

Para configurar o aparelho de mancha de pontos, usando uma tesoura, corte a membrana de mancha em um tamanho apropriado para o número de amostras e padrões. Mergulhe a membrana com água por 10 minutos antes de colocá-la no aparelho de mancha de pontos. Em seguida, cubra os poços não utilizados.

Adicione água aos poços para os quais as amostras serão carregadas. Aplique um aspirador, puxe a água pelos poços, verifique se há erros e reaperte os parafusos. Teste novamente, se necessário.

Aplique 400 microlitros de cada padrão de DNA de plasmídeo diluído em cada poço e execute quatro pistas de diluições padrão. Utilizar duas alíquotas separadas do resumo padrão e colocar cada uma delas em duplicado. Em seguida, aplique 200 microlitros por poço de cada amostra de DNA viral.

Aplique um vácuo suave para puxar as soluções de DNA através dos poços. Então, uma vez que todos os poços tenham esvaziado, libere o vácuo ajustando a válvula de três vias. Adicione 400 microlitros de uma solução alcalina X a cada poço.

Em seguida, aguarde cinco minutos antes de reaplicar o vácuo para esvaziar os poços. Reaplique o vácuo e desmonte o aparelho de dot blot. Em seguida, remova a membrana e enxágue-a com dois X SSC.

Coloque a membrana em uma toalha de papel limpa com o lado ligado ao DNA voltado para cima para remover o excesso de tampão. Use um reticulador UV apropriado para reticular UV o DNA borrado com a membrana. A membrana agora está pronta para hibridização.

Coloque a membrana em um frasco de hibridização com o lado ligado ao DNA para cima. Enxágue a membrana com cinco a 10 mililitros de tampão de hibridização pré-aquecido e descarte o tampão. Em seguida, adicione 10 mililitros de tampão de hibridização pré-aquecido e coloque a garrafa em um forno de hibridização rotativo ajustado para 65 graus Celsius.

Gire a garrafa por pelo menos cinco minutos. Adicione rapidamente o DNA do esperma desnaturado e a sonda radioativa ao tampão de hibridização no frasco e agite-o por 10 segundos para misturar. Retorne a garrafa ao forno a 65 graus Celsius e incuba-a com rotação a 65 graus Celsius por pelo menos quatro horas.

Quando a hibridização estiver concluída, pare a rotação. Remova o frasco de hibridização e, em seguida, despeje a solução de sonda radioativa em um tubo cônico de 50 mililitros com uma tampa de vedação de plugue à prova de vazamentos. Para lavar a membrana, adicione 20 a 30 microlitros de tampão de lavagem pré-aquecido ao frasco de hibridização e gire-o por cinco minutos.

Repita esta lavagem mais duas vezes. Após a terceira lavagem, remova a membrana do frasco de hibridização e, com papel toalha, remova o excesso de tampão da membrana. Em seguida, coloque a membrana em um suporte de papel plástico transparente.

Com um contador Geiger, verifique os sinais radioativos na membrana. Depois de expor a tela de imagem de fósforo apagada à membrana, escaneie a tela usando um sistema de varredura de imagem de fósforo e obtenha os dados sobre a intensidade do sinal de cada ponto. Realize a análise dos dados de acordo com o protocolo de texto.

Este dot blot quantitativo para titulação vetorial AAV 2G9 tem dois conjuntos de padrões e três quantidades diferentes de uma preparação vetorial AAV, incluindo 0,3, 0,1 e 0,03 microlitros em duplicata. As quantidades a serem analisadas na mancha são determinadas empiricamente ou com base em um ensaio preliminar. Foi determinado por interpolação que as alíquotas de 0,3, 0,1 e 0,03 microlitros do vetor AAV 2G9 tinham, em média, um título de 5,16, 0,27 nanogramas de microlitros equivalentes.

Todas as possíveis combinações de sorotipos cognatos e heterólogos de proteínas VP3 cas-pid e AAP de AAV5, AAV9 e AAV de cobra foram avaliadas quanto à montagem do capsídeo por um ensaio quantitativo de dot blot. Os resultados deste gráfico mostram que AAV5 VP3 é montado independentemente de AAP ter sido fornecido em trans. Além disso, AAP5 e AAP9 podem promover a montagem do capsídeo AAV9 VP3, embora AAP5 funcione de forma menos eficaz do que AAP9.

Nem AAP5 nem AAP9 exibem uma assembléia promovendo atividade na cobra AAV VP3, e a cobra AAP promove apenas a montagem da cobra AAV VP3. Uma análise de dot blot foi aplicada para avaliar a atividade da nuclease de três nucleases disponíveis comercialmente sob condições não otimizadas contendo impurezas derivadas de células e meios de cultura. A enzima A não foi tão ativa quanto as outras duas enzimas, mostrando que a escolha da nuclease pode afetar significativamente a leitura do ensaio de dot blot.

Esta técnica é direta para a quantificação do vetor AAV e instrumental na avaliação do papel do AAP na promoção da montagem de capsídeos AAV derivados de sorotipos cognatos e heterólogos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um dia se for executada corretamente, uma vez que as amostras de ensaio sejam obtidas em experimentos de cultura de células. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de pipetar cuidadosamente o volume de líquido correto para garantir a precisão quantitativa.

Após seu desenvolvimento, a aplicação do ensaio quantitativo de dot blot para estudar AAP abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do AAV entenderem melhor o mecanismo de montagem do capsídeo do AAV. Não se esqueça de que trabalhar com células humanas, agentes virais, fenol-clorofórmio e materiais radioativos pode ser extremamente perigoso. E o uso de jalecos, luvas e óculos de proteção são necessários para limitar a exposição.

Esses materiais só devem ser manuseados em áreas aprovadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como preparar amostras de dot blot para quantificação de AAV, configurar o aparelho de dot blot, determinar o título de AAV e aplicar o procedimento ao estudo da biologia do AAV. Seguindo este procedimento, outros ensaios, como ensaios de transdução vetorial AAV em células de cultura, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o título funcional do vetorizado em comparação com o título físico de partículas determinado pelo ensaio dot blot.