Name: Um ensaio de Blot Dot quantitativa para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional do vírus Adeno-associado Assembly-ativação de proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Aprenda a realizar ensaio de dot blot quantitativo para titulação de AAV e avaliação de proteínas AAP na montagem de capsídeos virais. Este método simples e econômico utiliza células HEK 293.

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Agradecemos Xiao Xiao na Universidade de North Carolina em Chapel Hill, por nos oferecer o plasmídeo pEMBL-CMV-GFP. Agradecemos a Christopher Cheng e Samuel J. Huang pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública concede (NIH R01 NS088399 e EY232113 T32).

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<li>Sonntag, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly-activating+protein+promotes+capsid+assembly+of+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes.</a> J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).</li>
<li>Naumer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+adeno-associated+virus+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein.</a> J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+in+the+adeno-associated+virus+serotype+2+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein.</a> J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).</li>
<li>Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+computational+evolution-based+method+to+study+a+mode+of+co-evolution+of+overlapping+open+reading+frames+in+the+AAV2+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome.</a> PLoS One. 8 (6), e66211(2013).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+Virus+%28AAV%29+Assembly-Activating+Protein+Is+Not+an+Essential+Requirement+for+Capsid+Assembly+of+AAV+Serotypes+4%2C+5%2C+and+11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11.</a> J Virol. 91 (3), (2017).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+are+biologically+active+and+free+of+detectable+helper+and+wild-type+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses.</a> Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).</li>
<li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+normal+integration+does+not+require+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression.</a> J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).</li>
<li>Wobus, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
<li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).</li>
<li>Fagone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+errors+in+quantitative+polymerase+chain+reaction+titration+of+self-complementary+adeno-associated+viral+vectors+and+improved+alternative+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).</li>
<li>Farkas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parvovirus+isolated+from+royal+python+%28Python+regius%29+is+a+member+of+the+genus+Dependovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).</li>
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<li>Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+for+short+hairpin+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression.</a> Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).</li>
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<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste relatório, a utilidade dos ensaios de borrão ponto quantitativa para estudar AAV AAPs e seu papel na montagem do capsídeo é descrita. Conhecimentos adquiridos com estes estudos podem fornecer insights detalhadas sobre as diferenças inatas no processo de montagem de capsídeo do vírus adeno-associados e o papel funcional da AAPs entre diferentes sorotipos. A este respeito, o ponto de cruz-complementação de AAV VP3-AAP blot revelou que cobra AAV VP3 exibido uma dependência estrita a expressão co seu cognato AAP para m...

Vírus adeno-associado (AAV) é um pequeno, não-envelopado, single-stranded DNA vírus com um genoma de aproximadamente 4,7 kilobases (kb). O genoma do vírus adeno-associados contém quadros de leitura aberta (ORFs) para os genes rep e cap . Em 2010, uma proteína não-estruturais inédita codificada por um + 1 quadro-deslocados ORF dentro do gene do tampão de AAV2 foi descoberta por Sonntag et al e verificou-se que desempenham um papel fundamental na montagem de AAV2 proteínas do capsídeo VP monômero em um viral capsídeo1. Esta proteína romance foi nomeada assembly-ativando proteína (AAP) após o papel que desempenha na promoção do capsídeo conjunto1.
As ORFs para AAP foram identificado bioinformatically nos genomas dos parvovírus todos do género Dependoparvovirus, mas não dentro os genomas dos vírus de diferentes gêneros dos parvovírus família1,2. Estudos funcionais desta proteína romance foram inicialmente focados no AAP do protótipo AAV2 (AAP2), que estabeleceu o papel essencial da AAP2 no direcionamento de proteínas de VP desmontadas para o nucléolo para sua acumulação e formação em totalmente montados capsids1,3,4. A incapacidade dos capsids AAV2 a montar na ausência de expressão de AAP tem sido independentemente confirmada por vários grupos, incluindo a nossa,1,2,3,4,5 . Estudos posteriores em serótipos AAV 1, 8 e 9 corroborou o papel crítico da AAPs no assembly do capsídeo, como proteínas de monômero VP3 de AAV1, 8, e 9 foram incapazes de formar um capsídeo totalmente montado na ausência de expressão co da AAP2.
Recentemente, através de abordagens que incluem o uso de ponto quantitativo borrão ensaios, investigamos a capacidade de AAV1 de 12 VP3 monômeros para montar em capsids na ausência de expressão de AAP e a capacidade de AAP1 a 12 para promover a montagem de VP3 monômeros de heterólogos serótipos. Este estudo revelou que AAV4, 5 e 11 VP3 monómeros podem montar sem AAP. Além disso, verificou-se que oito dos serótipos AAP doze nós examinamos (isto é, todos, mas AAP4, 5, 11 e 12) exibida uma ampla capacidade de suporte conjunto capsídeo de capsids de sorotipo heterólogos da AAV, enquanto AAP4, 5, 11 e 12 exibido um substancialmente capacidade limitada nesta consideração6. Estes quatro sorotipos são filogeneticamente distantes do outro AAP serótipos2,3. Além disso, o estudo revelou significativa heterogeneidade em suas localizações subcellular de diferentes PittCon6. Além disso, o estudo tem sugerido que a associação apertada da AAP com capsids montados e o nucléolo, a marca da montagem do capsídeo AAV2, necessariamente não pode ser estendida para outros sorotipos incluindo AAV5, 8 e 9, que exibem nucleolar exclusão de capsids montados6. Assim, a informação adquirida com o estudo de qualquer sorotipo específico AAP não é amplamente aplicável para todos biologia AAP. Natureza tão intrigante da biologia AAP enfatiza a necessidade de investigar o papel e a função de cada AAP de canônicos e não-canônicos serótipos AAV.
O papel biológico da AAP no assembly do capsídeo pode ser avaliado, determinando que os títulos de partícula viral de AAV totalmente embalados produziram no rim embrionário humano (HEK) 293 células, a linha de celular mais comumente usados para produção de vetor de vírus adeno-associados, com ou sem proteína AAP expressão. Os métodos padrão para quantificação de AAV são PCR quantitativo (qPCR)-ensaios com base7,8 e dot quantitativo baseado em blot ensaios9. Outros métodos para quantificação de partícula viral AAV como de10,de ensaio enzima-lig da imunoabsorção11 ou de medição de densidade óptica12 não são ideais para amostras provenientes de muitos diferentes sorotipos de vírus adeno-associados ou amostras contaminado com impurezas (lysates bruto ou meios de cultura), que muitas vezes são as amostras utilizadas para pesquisa AAV. Atualmente, qPCR é mais amplamente utilizado para quantificação de vírus adeno-associados; no entanto, é necessário reconhecer potenciais advertências do ensaio qPCR-baseado, como o ensaio podem resultar em erros sistêmicos e título significativas variações13,14. Ensaios baseados em PCR são afetados por uma série de confusão potencialmente fatores, tais como a presença de grampos de cabelo terminais fechados covalentemente em modelos PCR que inibem a amplificação13. Até mesmo um indivíduo experiente pode apresentar potencial fatores de confundimento em uma base qPCR inconscientemente ensaio13. Em contraste, os ensaios de mancha ponto quantitativos são uma técnica clássica de biologia molecular que não envolve a amplificação do genoma e usa um princípio muito mais simples com um risco mínimo de erros em comparação com ensaios baseados em qPCR. O método é menos tecnicamente desafiador; Portanto, os resultados do ensaio são razoavelmente reproduzíveis mesmo por pessoas inexperientes.
Neste relatório, descrevemos os detalhes metodológicos de um ensaio de mancha de ponto quantitativa rotineiramente usamos para quantificação de vetor de vírus adeno-associados e fornecer um exemplo de como aplicar o ensaio para estudar o papel de montagem-promoção da AAPs em comum sorotipos (AAV5 e AAV9) e uma anteriormente descaracterizada AAP de AAV cobra14. Na natureza, AAV VP proteínas e proteínas AAP são expressos em cis de um único gene (ou seja, VP-AAP cis-complementação), enquanto no ensaio descrito aqui, proteínas de VP e AAP são fornecidas em trans de dois plasmídeos separados (ou seja, VP-AAP trans-complementação). Desde que cada proteína VP ou AAP de sorotipos diferentes pode ser expressa de cada independente do plasmídeo, torna-se possível testar combinações de VP-AAP heterólogos para montagem do capsídeo (ou seja, VP-AAP Cruz-complementação). Brevemente, VP3 AAV de vários serótipos é expresso em células HEK 293 transfeccao de Plasmideo DNA de um genoma de vetor de vírus adeno-associados do pacote na presença ou ausência do sorotipo cognato AAP, ou na presença de um sorotipo heterólogo AAP. Após a produção, meios de cultura e lisados celulares são submetidos a um ensaio de mancha de ponto para quantificar o genoma viral dentro do shell do capsídeo. O primeiro passo do ensaio de mancha do ponto é tratar as amostras com uma nuclease para remover contaminantes DNAs plasmideo e genomas AAV não acondicionadas em amostras. A não observância aumentaria os sinais de fundo, em particular quando impuro amostras são doseadas. Esta é seguida por um tratamento de protease para quebrar capsids virais e liberam nuclease resistente genomas virais em soluções de amostra. Genomas virais, próximo são desnaturadas, destruídas em uma membrana e hibridizadas com uma sonda de DNA específico do genoma viral para quantificação. No ensaio exemplo relatado aqui, demonstramos que cobra AAV VP3 exige cobra AAP para montagem do capsídeo e que cobra AAP não promove a montagem de AAV9 capsids ao contrário de muitos as AAPs derivados de serótipos AAP-dependente que podem também promover a montagem de capsids do sorotipo heterólogo. Por último, relatamos uma ressalva importante para qPCR ou quantificação de AAV ponto baseado em blot ensaios que a escolha de nuclease afeta significativamente os resultados do ensaio.

<table><tbody><tr><td>Benzonase</td><td>milliporeSigma</td><td>1016970001</td><td>Referido como endonuclease Serratia marcescen no texto principal.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>referida como DNase I Enzima A no texto principal.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>referida como DNase I Enzima B no texto principal.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td>Referido como DNase I Enzima C no texto principal.</td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga com Tampa de Rosca O-Ring Anexado de 1,5 mL</td><td>Corning</td><td>430909</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico de Polipropileno de 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>3 M Acetato de Sódio</td><td>Teknova</td><td>S0298</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico de Polipropileno de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Células AAV-293</td><td>Agilent</td><td>240073</td><td>linha celular HEK-293 otimizada para o empacotamento de vírions AAV.</td></tr><tr><td>AccuGENE 0,5 M EDTA Solução</td><td>Lonza</td><td>51234</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 10% SDS</td><td>Lonza</td><td>51213</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1X TE Buffer</td><td>Lonza</td><td>51235</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Aparelho</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3294</td><td></td></tr> Kit Extrator <tr>de<td>DNA Clorofórmio</td><td>MilliporeSigma</td><td>372978</td><td></td></tr> <tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>295-50201</td><td>Isso é usado para manchas de pontos quantitativas em vírus purificados. Usamos apenas metade do volume de todos os reagentes em cada etapa recomendada para o Esquema de Protocolo 2 no manual fornecido pelo fabricante.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4,5 g/L)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18290015</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22095</td><td>Referido como Polysucrose 400.</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Arenque Esperma DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de hibridização</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-247-150</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant TL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>ImageQuant TL</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio Hexahidratado</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Mini Quick Spin DNA Columns</td><td>MilliporeSigma</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC2 Vector</td><td>Cell Biolabs Inc</td><td>VPK-422</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Tamponado Salino</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>de Exposição à Fosforimagem</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Várias</td><td></td></tr><tr><td>Telas de Fosforografia</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Vários</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeos Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA Polimerase</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Polietilenimina</td><td>Polysciences Inc</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5288</td><td></td></tr><tr><td>Prime-It II Kit de Rotulagem de Primer Aleatório</td><td>Agilent Technologies</td><td>300385</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Forward (N25 nucleotídeos do 4º nucleotídeo no AAP ORF, RE1 é um local de enzima de restrição para clonagem): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>AAP Reverse (N25 são os últimos 25 nucleotídeos da AAP ORF, RE2 é um local de enzima de restrição para clonagem): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer VP3 Forward (N25 os primeiros 25 nucleotídeos do VP3 ORF, RE1 é um local de enzima de restrição para clonagem): CTAA-RE1-CACC-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer VP3 Reverse (N25 são os últimos 25 nucleotídeos do AAP ORF, RE2 é um local de enzima de restrição para clonagem): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>Enzimas de Restrição</td><td>New England Biolabs</td><td>Vários</td><td></td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de Sódio Tribásico Dihidratado</td><td>MilliporeSigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Eppendorf</td><td>6321000515</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços tratada com cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353046</tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Buffer-Saturated Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Spectroline</td><td>XLE-1000</td><td>O modo de reticulação ideal é usado, fornecendo uma dosagem de energia UV de 120 mJ/cm2.</td></tr><tr><td>Membrana Zeta-Probe</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0165</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de blot dot quantitativa para titulação de aav e seu uso para avaliação funcional do vírus adeno-associado assembly-ativação de proteínas

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Enquanto o vírus adeno-associado (AAV) é amplamente aceita como um vetor atraente da terapia genética, serve também como um vírus de modelo para entender a biologia do vírus. A último aspecto, a recente descoberta de uma proteína não-estruturais AAV, denominada Assembleia-ativando proteína (AAP), tem lançar luz sobre os processos envolvidos na montagem das proteínas do capsídeo viral VP em um capsídeo. Embora muitos sorotipos de vírus adeno-associados exigem AAP para montagem, temos recentemente relatado que AAV4, 5, e 11 são exceções a essa regra. Além disso, temos demonstrado que AAPs e capsids montados de diferentes sorotipos localizar para diferentes compartimentos subcellular. Esta heterogeneidade inesperada na propriedades biológicas e funções funcionais da AAPs entre AAV diferente sorotipos sublinhados que a importância dos estudos na PittCon derivada de diversos sorotipos. Este manuscrito detalha um ensaio de mancha de ponto simples para quantificação de AAV e sua aplicação para avaliar a especificidade de dependência e sorotipo AAP no assembly do capsídeo. Para demonstrar a utilidade deste teste do borrão de ponto, partimos para caracterizar o conjunto de capsídeo e AAP dependência de AAV cobra, um réptil anteriormente descaracterizado AAV, bem como AAV5 e AAV9, que anteriormente foram mostrados para ser independente de AAP e dependente da AAP sorotipos, respectivamente. O ensaio revelou que o conjunto de capsídeo cobra AAV requer cobra AAP e não pode ser promovido por AAPs de AAV5 e AAV9. O ensaio também mostrou que, ao contrário de muitos o sorotipo comum PittCon que promovem Assembleia capsídeo heteróloga por Cruz-complementação, cobra AAP não promove Assembleia de AAV9 capsids. Além disso, mostramos que a escolha de nuclease afeta significativamente a leitura do ensaio de mancha do ponto, e assim, escolher uma enzima ideal é fundamental para o sucesso avaliação de títulos AAV.

Um resultado representativo de borrões ponto quantitativa para quantificação das existências de vetor AAV purificadas produzido em larga escala é mostrado na Figura 1. Com este ensaio de mancha de ponto, determinou-se o título de um estoque de vetor de AAV2G9-CMV-GFP de dupla-hélice. O vetor foi purificado por duas rodadas de cloreto de césio (CsCl) gradiente de densidade ultracentrifugação seguida de diálise como descrito anteriormente,20</...

Este manuscrito detalha um ensaio de mancha de ponto simples para quantificação da concentração de vírus adeno-associado (AAV) e sua aplicação para estudar o papel da montagem-ativando proteínas (AAPs), uma classe nova de proteínas virais não estruturais encontrados em todos os vírus adeno-associados sorotipos, em promover a montagem de capsids derivado cognatos e heterólogos serótipos AAV.

Um ensaio de Blot Dot quantitativa para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional do vírus Adeno-associado Assembly-ativação de proteínas

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Este método pode determinar os títulos de vácuo AV purificados e não purificados e avaliar a capacidade do AAV AAP de promover a montagem de sorotipia AV cognata e heteróloga. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um método simples e barato que evita as desvantagens de outros métodos de titulação de AAV. Embora esse método tenha sido comumente usado para quantificação de vetores AAV, ele também pode ser aplicado para abordar várias questões fundamentais sobre a biologia do AAV, conforme mostrado neste protocolo.No dia zero, após a cultura de células HEK 293 a 90% de confluência, prepare o reagente de transfecção misturando os plasmídeos em 96 microlitros de PBS sem cálcio ou magnésio em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitro. Conforme indicado nesta tabela, a quantidade total de DNA é de dois microgramas por poço. Adicione quatro microlitros de solução de PEI à mistura de DNA do plasmídeo PBS.O volume final é de aproximadamente 100 microlitros ou 5% do volume do meio de cultura. Vortex os tubos brevemente e incube a mistura de DNA PEI em temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, gire brevemente os tubos em uma microcentrífuga para coletar o líquido

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos um ensaio colorimétrico in vitro para detectar a presença de anticorpos neutralizantes contra vetores do sorotipo 6 do vírus adeno-associado recombinante que expressam fosfatase alcalina (rAAV6) em amostras de soro de ovelhas. O ensaio utiliza a reação entre o AAV que codifica um gene da fosfatase alcalina placentária humana e seu substrato para gerar um produto roxo insolúvel.

Ensaio de anticorpos neutralizantes AAV baseado em células: uma técnica colorimétrica para detectar anticorpos neutralizantes contra vírus adeno-associados específicos no soro

Neste vídeo, descrevemos o ensaio de dot blot para quantificar um genoma viral. A intensidade do sinal está diretamente relacionada à quantidade de DNA viral na amostra.

Ensaio de Dot Blot para quantificar o genoma viral

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para a produção em larga escala de vetores AAV de grau de pesquisa usando células hek 293 aderentes cultivadas em pilhas de células e purificação de cromatografia de afinidade. Este protocolo produz consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vetoriais/mL, fornecendo quantidades vetoriais apropriadas para grandes estudos em animais.

Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais

Este protocolo apresenta como quantificar a eficiência de transdução AAV na retina do mouse usando PCR de gotícula digital (dd-PCR) juntamente com produção de AAV de pequena escala, injeção intravitreal, imagem da retina e isolamento do DNA genômico da retina.

Método DE GOTÍcula Digital PCR para quantificação da eficiência de transdução AAV em Murine Retina

Um protocolo de laboratório abrangente e um fluxo de trabalho de análise são descritos para um ensaio rápido, econômico e simples baseado em células coloridas para detectar elementos neutralizantes contra o AAV6.

Um método passo-a-passo para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV usando um ensaio baseado em células coloridas

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e validação de boas práticas laboratoriais na detecção aderente de vetores virais adenoassociados em lágrimas humanas por reação em cadeia da polimerase digital em gotículas em apoio ao desenvolvimento clínico de vetores de terapia gênica.

Um ensaio de reação em cadeia da polimerase digital validável em gotículas para a detecção de vetores virais adenoassociados em estudos de biosshedding de lágrimas

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

À medida que o campo da terapia gênica continua a evoluir, há uma necessidade crescente de métodos inovadores que possam enfrentar esses desafios. Aqui, é apresentado um método único, que agiliza o processo de geração de vetores AAV de alto rendimento e alta pureza usando uma plataforma de fábrica de células, atendendo aos padrões de qualidade para estudos in vivo .

Um procedimento simplificado e padronizado para gerar vetores de vírus adeno-associados de alto título e alta qualidade utilizando uma plataforma de fábrica de células

A quantificação precisa das cópias do genoma do vetor do vírus adeno-associado (AAV) é crítica, mas um protocolo padronizado ainda não foi estabelecido. Este protocolo descreve um método validado para preparar amostras de AAV purificadas e conduzir a reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais (dd_PCR) para quantificar de forma confiável o título do genoma viral.

Quantificação de genomas virais adeno-associados em amostras de vetores purificados por reação em cadeia da polimerase por gotículas digitais

O degrau da escada a pé tarefa é um novo teste para avaliar a pé qualificados e medir tanto forelimb e hindlimb colocação, pisando, e inter-membro da coordenação.

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Aprenda a realizar ensaio de dot blot quantitativo para titulação de AAV e avaliação de proteínas AAP na montagem de capsídeos virais. Este método simples e econômico utiliza células HEK 293.

Um ensaio de Blot Dot quantitativa para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional do vírus Adeno-associado Assembly-ativação de proteínas (Vídeo) | JoVE Journal

Um ensaio de Blot Dot quantitativa para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional do vírus Adeno-associado Assembly-ativação de proteínas

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