Name: A longo prazo consequências comportamentais e reprodutivas de embrionária exposição a baixas doses tóxicas para (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprenda a investigar os efeitos de longo prazo da exposição a baixas doses de BPA durante a embriogênese em C. elegans. Este método avalia fecundidade e comportamento de aprendizagem em adultos, auxiliando pesquisadores em toxicologia ambiental.

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Suporte pelo NSF (EPSCoR EPS-0814251) e reconhece com gratidão-NIH (1P20GM103653-01A1) para MKT e HSD, suporte de estudante institucional da Universidade Estadual de Delaware para MDM (título III HBGI) e KRS (NIH-INBRE). Graças ao centro de genética c. elegans (suportado pelo NIH escritório de pesquisa programas de infra-estrutura P40 OD010110) para c. elegans estirpe selvagem-tipo N2.

Protocolos abaixo tem sido padronizados para testar os efeitos da exposição BPA durante a embriogênese precoce e podem ser modificados para uso com BPS, BPF ou outros CDE e substâncias tóxicas em embriões de c. elegans .
1. material instalação
<ol><li>Prepare 500 mL de mídia de18 nematódeo crescimento Media (NGM) dissolvendo-se 1,5 g de NaCl, 1,25 g de peptona e 8,5 g de ágar-ágar em água de 500 mL. Após a esterilização em autoclave (121 ° C, 15 PSI, 20 min.), adicionar 0,5 mL de colesterol (5 mg/mL em etanol), 0,5 mL de 1 M MgSO4, 0,5 mL de 1 M CaCl2 e 12,5 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M, pH 7,4 (108,3 g de KH2PO4 35,6 g de K2HPO4, água para 1L).</li>
	<li>Prepare a solução de hipoclorito pela mistura de 25 mL de 1 N KOH, 4 mL de água sanitária e 71 mL de água. Tornam essa solução fresca.</li>
	<li>Prepare o M9 Buffer misturando 3 g de KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g de NaCl, 5 mL de 1 M de MgSO4e água a 1 L.</li>
	<li>Prepare o Buffer S18 misturando 129 mL de 0,02 M K2HPO4mL 871 de KH2PO4e 5,85 g de NaCl.</li>
	<li>Esterilize o M9 e S buffers em autoclave.</li>
	<li>Cresce uma cultura durante a noite de Escherichia coli (cepa 50 OP) em 20 mL de caldo de Luria (LB).</li>
	<li>Dissolva o BPA em 10% de etanol para fazer uma solução stock de 1 mM. Faça diluições subsequentes de 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM e 10 µM em buffer de S. Nota: Diluição no buffer S aquoso reduz a concentração de etanol; por exemplo, a maior concentração de BPA descrito neste protocolo (10 µM), a concentração de etanol é 0,1% v/v.</li>
</ol>2. Culturing de c. elegans e sincronização
<ol><li>Despeje a mídia NGM chapas de 100 milímetros (cerca de 25 mL/placa) e deixar solidificar. Uma vez solidificado, propagar as placas espalhando 150 µ l de Escherichia coli OP50 da cultura líquida cresceu durante a noite. Incube as placas a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, traslado N2 vermes nas chapas de novo reunir uma laje aproximada do quadrado de 1 cm. Permitir que vermes a crescer por 3 dias a 20 ° C até que a placa é preenchida com adultos maduros bem alimentados contendo embriões visíveis.</li>
	<li>Para sincronizar, lave cada placa pipetando até 5 mL de tampão de M9 através da placa. Transferi o líquido para um tubo de centrifuga conico de estéril 15 mL. Nota: A sincronização é feita para matar vermes adultos e coletar embriões que são relativamente o mesmo palco.</li>
	<li>Centrifugar a 3.000 x g, durante 4 min à temperatura ambiente, a fim de obter uma pastilha solta de vermes adultos.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta de 10 mL, remova cuidadosamente o sobrenadante por forma a deixar a pelota intacta. Adicionar 5 mL da solução de hipoclorito e misture suavemente.</li>
	<li>Centrifugar a 3.000 x g , à temperatura ambiente durante 4 minutos.</li>
	<li>Remover o sobrenadante com uma pipeta de 10 mL e lave com 7 mL de tampão de M9. Repita duas vezes.</li>
</ol>3. expor Worms ao BPA
<ol><li>Após a última lavagem do passo 2.7 acima, suspenda a cerca de 100 µ l de ovos com buffer M9. Transferi 50 µ l de ovos para tubos de microcentrífuga de 2 mL contendo já a concentração adequada que BPA diluído em tampão de S. Ajuste a quantidade de buffer de S para garantir a correta concentração final de BPA (µM 0.0, 0.1 µM, 0,5 µM, 1,0 µM, 5,0 µM e 10 µM) pelo tubo. A tabela 1 ilustra uma maneira de tornar estas diluições.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Para a concentração Final de BPA</td>
			<td>Estoque de BPA (100 μM)</td>
			<td>S Buffer</td>
			<td>Worms sincronizado</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1 ΜM</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>949 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 ΜM</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>945 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ΜM</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>940 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ΜM</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ΜM</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>ΜL DE 850</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Estoque BPA, buffer de S e vermes sincronizadas usados para atingir a concentração desejada usada para nosso estudo.
<ol start="2"><li>Coloque os tubos em uma coqueteleira e agite por 4 h a 20° C, em 25 rpm para um agitador rotativo ou 25 inclina-se. / min. para um balanço shaker.</li>
	<li>Após 4 h, coloque os tubos nos suportes de tubo e permitir worms para resolver.</li>
	<li>Descartar o sobrenadante e transferir vermes para placas semeadas (placas NGM com OP50 Escherichia coli). Fazer a cultura OP50 Escherichia coli líquida tal como afirmado no 1.5 e propagar as placas, como indicado no ponto 2.1.</li>
	<li>Deixe os vermes crescem para 60h em 20 ° C. Examine placas todos os dias para a contaminação. Placas NGM contaminadas são geralmente descoloradas e acompanhadas de colônias individuais. Verifica vermes sob o microscópio para superlotação. Falta de gramado OP50 Escherichia coli e vermes concentradas em pequenos pontos significam a superlotação.</li>
</ol>4. ensaio de habituação de toque anterior
<ol><li>Transferência de aproximadamente 10 jovens sincronizados pegar vermes adultos para novas placas não-semeadas de NGM usando um fio de platina 30 G fogo-esterilizados. Deixar vermes sem ser perturbado por 5 min permitir-lhes tempo para se aclimatar à nova placa.</li>
	<li>Para a resposta de habituação, usar um sobrancelha cabelo anexado ao fim de um espeto de madeira ou palito de dente e esterilizar mergulhando em etanol a 70%. Limpe com um tecido limpo cotão e esperar 1 min para etanol evapora-se fora. Toque suavemente o verme na cabeça (anterior do bulbo faríngeo) usando os pelos da sobrancelha. Repita os toques, permitindo que 10 s entre toques a fim de permitir que o worm recuperar.</li>
	<li>Continue a tocar (permitindo 10 intervalos de interstimulus s) até que o worm já não se move para trás. Neste ponto, o worm tem habituado ao estímulo. Registre o número de toques necessários para o worm para se habituar.</li>
	<li>Analise a diferença entre as taxas de má habituação dos tratados e não tratados controles usando o One-Way ANOVA seguida pelo teste post hoc de Tukey.</li>
</ol>5. worm fecundidade ensaio
<ol><li>Transferência individuais vermes L3 para um prato fresco e semeado usando uma picareta de platina. Certifique-se que apenas um verme é colocado por placa. Nota: após a fase larval de L3, vermes evoluir para a fase larval de L4 e idade adulta. Pegá-los cedo é conveniente em que eles são grandes o suficiente para a transferência de animais individuais, garantindo que eles já não tinha todos os ovos que, de outra forma, iria ser desperdiçados na contagem.</li>
	<li>Conte o número de ovos postos a cada 12-24 h. Depois de contar, transferi o verme do pai para uma nova placa. Repita até que o verme para a postura dos ovos, normalmente depois de 5 dias quando incubadas a 20 ° C. Nota: em média, um verme tipo selvagem pode colocar até 300 ovos; Portanto, transferindo o pai para uma nova placa diariamente evita a superlotação.</li>
	<li>Analise a diferença entre o número médio de ovos colocados pelos tratados e não tratados controles usando o One-Way ANOVA seguida pelo teste post hoc de Tukey.</li>
</ol>

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<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223(2016).</li>
<li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+revisited%3A+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li>
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<li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/56300/assessment-effects-endocrine-disrupting-compounds-on-development">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , In Press (2017).</li>
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</ol>

Os autores declaram que eles não têm nada para divulgar.

Fases de rápido crescimento e desenvolvimento como embriogênese são particularmente vulneráveis aos efeitos prejudiciais de vários compostos endócrinos, incluindo o BPA. Nós fornecemos protocolos detalhados para estudar os efeitos da exposição ao BPA ou outras substâncias tóxicas no modelo de invertebrados c. elegans , que permite a titulação conveniente de uma gama de concentrações, para avaliar seu efeito sobre a viabilidade do embrião (Figura 2) . Acompanhar experimentos comportamentais sobreviventes adultos que se desenvolvem de embriões que foram expostas a baixas doses de BPA permitem a análise do efeitos a longo prazo na função neuronal (Figura 3). A ideia central deste trabalho é fornecer protocolos detalhados para expor os embriões a várias substâncias tóxicas durante o período de embriogênese inicial no modelo de c. elegans ; a primeira janela de 4 h de seu período de desenvolvimento embrionário de 11,5 horas (a 20 ° C) corresponde ao período de proliferação, que é seguido por organogênese. Nesse sentido, nós fornecemos a validação dos pontos de extremidade através de fecundidade e de ensaios de não-aprendizagem associativa. Enquanto a base mecanicista da ação do BPA e outros bisfenóis é o Santo Graal para que destina-se a investigação neste campo, temos não uma tentativa de oferecer uma explicação mecanicista para a ação do BPA neste artigo focado de metodologia. No entanto, gostaríamos de salientar que o modelo de c. elegans oferece um sistema ideal para dissecar ainda mais o mecanismo de ação. Por exemplo, em um futuro trabalho para decifrar os mecanismos de ação do BPA, c. elegans mutantes podem ser gerados e projectado para uma resistência aos efeitos do BPA e, assim, pavimentar o caminho para decifrar o caminho. Além disso, o nosso papel de companheiro lida com o efeito do BPA no nível de sincronia da rede neural em vertebrados, fornecendo uma outra avenida para entender a base para investigar potenciais mecanismos para efeitos tóxica19.
Na metodologia detalhada neste trabalho, algumas das etapas essenciais que devem ser executados extra cuidadosamente incluem o seguinte: escolha um prato com bem alimentados c. elegans adultos com ovos maduros visíveis sob o microscópio de dissecação é essencial, e Falha ao seguir esta etapa irá resultar em um tamanho de amostra insuficiente de embriões para o experimento Exposição EDC. Também é importante para se certificar de que a solução de hipoclorito é feita fresca para evitar a obtenção de uma população não sincronizada que irá interferir com a capacidade de realizar exposição BPA durante a embriogênese precoce. Lavagem de pelotas com M9 (após a exposição de hipoclorito) também é um passo muito importante. Se não for feito corretamente, a alta concentração de água sanitária pode resultar em embriões mortos. Além disso, os embriões devem ser transferidos para placas NGM semeadas após 4 h. Se deixada na solução de BPA por um período prolongado de tempo, os embriões são propensos a desenvolver para as larvas de dauer long-lived. Isto irá interferir significativamente com ensaio de fecundidade e ensaios comportamentais. Se qualquer uma dessas etapas é perdida, é aconselhável começar o procedimento desde o início. Se por qualquer motivo, a placa NGM com vermes está contaminada ou não tem comida suficiente, ele irá adicionar o stress sobre os vermes desse modo distorcer os dados coletados. Tais placas devem ser descartadas e não ser usadas no experimento.
Anteriormente, um notável estudo utilizado com sucesso o modelo de c. elegans para demonstrar que anomalias cromossómicas causaram pelo resultado BPA, devido a avaria da maquinaria de reparo de DNA no germline14. No entanto, é notável que o projeto de estudo acima tinha usado a exposição contínua do BPA de c. elegans a altas doses de BPA durante toda sua vida. Nossa metodologia foi projetada para estudar a baixas doses de exposição BPA durante a embriogênese precoce, a fim de ensaiar seus efeitos sobre a viabilidade embrionária e sutis efeitos de longo prazo sobre os sobreviventes. A nosso conhecimento, nenhuma metodologia foi desenvolvida para expor os embriões adiantados palco para muito baixas doses de BPA, limitado a um período especificado de tempo; assim, tornando o método apresentado aqui romance.
Além disso, os protocolos fornecidos aqui pode ser facilmente adaptado para estudar os efeitos de outros CDE durante a fase de proliferação da embriogênese. No entanto, a fim de estudar a tarde estágios embrionários, o protocolo exigirá modificações chaves para a janela de tempo crítico de desenvolvimento sob foco. Além disso, nosso protocolo não será adequado para experimentos que exigem tempos mais longos de exposição tóxica, como abre a possibilidade da via de desenvolvimento alternativo, resultando na detenção longeva dauer no segundo ciclo muda, que é resistente para condições severas de20. Outras modificações e aperfeiçoamentos serão necessários para tempos mais longos de exposição através de suplemento com uma fonte de alimento que não tem potencial para metabolizar a toxicidade ou EDC por exemplo autoclavado Escherichia coli. Em conclusão, nossa metodologia pode ser utilizada para avaliar os efeitos de vários produtos químicos sobre a fecundidade e na função neuronal endócrinos no sistema de invertebrados modelo c. elegans.

Exposição a tóxicos ambientais, particularmente os compostos aqueles que tendem a interferir com o desenvolvimento, tem estado sob escrutínio científico cuidadoso nos últimos anos. Mais de mil produtos químicos de uso diário são classificados como endócrinos compostos (EDC)1. Períodos de rápido crescimento e desenvolvimento, que incluem embrionárias, infantil e fases de infância, eram conhecidos por ser particularmente vulneráveis aos efeitos deletérios que mesmo baixas doses EDC. Seus efeitos foram mostrados para causar reprodutivo e neurológico transtornos2. A orientações painel nos agência de proteção ambiental e nos programa nacional de toxicologia, uma dose baixa pode ser definida como qualquer dose abaixo do nível do que foi relatado para causar uma mudança biológica observável ou danificar a3. Além dos efeitos de doses baixas de CDE individuais, misturas de vários CDE encontrado em baixas concentrações no ambiente têm o potencial de causar efeitos cumulativos substantivas4.
Bisphenol A (BPA ou 4,4'-(propane-2,2-diyl)) é um agente de polimerização encontrado em itens comumente usados como garrafas de água, armazenamento de recibos, selantes dentários e os forros de bebida e comida latas5. Devido à sua semelhança estrutural com 17 β Estradiol (E2) e a sua afinidade para os receptores de estrogênio ERα e ERβ, BPA foi classificado como um produto químico (EDC)5,6endócrinos. Apesar de mais fraco, afinidade do BPA para receptores de estrogênio mostrou que afetam o sistema de reprodução de ambos os sexos e interromper funções neurais em doses que são considerados seguros7,8. Foram observadas alterações na metilação do DNA, através de mecanismos epigenetically regulamentados para causar defeitos neuronais a longo prazo em ratos expostos ao BPA9. Especificamente, o BPA também tem sido implicado como um possível culpado para o aumento das taxas de hiperatividade, deficiência de atenção e aumento da sensibilidade às drogas devido ao aumento de visto em receptores de dopamina D1 do posencéfalo límbica do rato após exposição crônica 9 , 10. evidência significativa sobre os efeitos deletérios da CDE sobre a saúde humana é baseada em estudos de correlação, concentrando-se principalmente na exposição crônica das populações a tóxicos ambientais, mesmo em doses baixas,5; no entanto, limitações em inferências de estudos humanos e na manipulação de controles experimentais foram aceites ao se lidar com as críticas de campanha publicitária sem fundamento11,12.
Devido à conservação dos genes Caenorhabditis elegans' em relação dos mamíferos, incluindo seus genes do hormônio esteroide-receptor, os pesquisadores utilizaram este modelo de laboratório geneticamente tractable para desvendar os efeitos funcionais e mecanicistas da CDE 13. experimentos com c. elegans mostraram que estes compostos tais como o BPA e BPS podem causar apoptose, mortalidade embrionária, ruptura nos mecanismos de reparação da quebra de DNA dupla-hélice e função neural14,15 ,16.
Nosso laboratório tem mostrado anteriormente que nem baixa dose exposição limitada a embriogênese precoce leva a fecundidade baixou com défices comportamentais nos sobreviventes adultos15. Habituação a um estímulo repetido é uma forma de aprendizagem não associativa em sistemas modelo, incluindo c. elegans, e nossa metodologia usa esta forma de aprendizagem não-associativa como uma saída comportamental a ensaiar os efeitos a longo prazo da exposição embrionária para as substâncias tóxicas17 especificamente, nós fornecemos protocolos detalhados para estudar a exposição BPA em c. elegans, incluindo seus efeitos imediatos sobre mortalidade embrionária e efeitos a longo prazo sobre o comportamento do adulto, com uma esquema geral retratada em Figura 1. Resultados representativos de fecundidade e de ensaios de não-aprendizagem associativa são fornecidos para realçar a eficácia de nossa metodologia.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Fisher</td><td>S25761B</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P286-1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>7758-11--4</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>BPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239658-250g</td><td></td></tr><tr><td>BPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>103039-100g</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>E.coli OP50</td><td>CGC</td><td></td><td>Repositório em U de Minnesota</td></tr><tr><td>N2 (C. elegans de tipo selvagem) worms</td><td>CGC</td><td></td><td>Repositório em U de Minnesota</td></tr><tr><td>Picareta de fio de platina</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-AWP</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Dissecção</td><td>AmScope</td><td>SM-2TYY</td><td></td></tr></tbody></table>

a longo prazo consequências comportamentais e reprodutivas de embrionária exposição a baixas doses tóxicas para

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Bisfenóis, tais como o bisfenol A (BPA) e Bisfenol S (BPS) são polimerização agentes amplamente utilizados na produção de plásticos e inúmeros produtos de uso diário. Com base na sua estrutura química e propriedades biológicas como estradiol, eles foram classificados como endócrinos compostos (EDC). A exposição prolongada a CDE, mesmo em doses baixas, tem sido associada a vários defeitos de saúde, incluindo câncer, distúrbios comportamentais e infertilidade, com maior vulnerabilidade indicada durante os períodos do desenvolvimento precoce. Estudos celulares e moleculares com o geneticamente tractable modelo nemátode Caenorhabditis elegans têm demonstrado que a exposição ao BPA provoca apoptose, letalidade embrionária e perturbação no DNA mecanismos de reparação. Informamos anteriormente que a exposição dos embriões de c. elegans de baixas doses de fecundidade diminui de bisfenóis diferentes. Além disso, mostramos que os efeitos da exposição durante a fase inicial de desenvolvimento persistirem na vida adulta como analisada quantificando o comportamento de habituação, uma forma de aprendizagem não associativa. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para exposição embrionária a CDE baixa dose anterior e a fecundidade associada toque ensaios de habituação, juntamente com resultados representativos.

Estudos anteriores com c. elegans relataram que a exposição contínua a altas concentrações de BPA (≥ 1 mM) ao longo do desenvolvimento do embrião e a idade adulta diminui fecundidade14. Estudos subsequentes relatados do nosso laboratório mostraram que os embriões que foram expostos ao BPA durante um período limitado de 4h nos estágios iniciais do seu desenvolvimento mostrou uma diminuição no número de ovos viáveis definidos como adultos15 (Figura 2). Duas principais características da metodologia foram que (i) as concentrações de BPA usadas eram significativamente mais baixo (0.1 µM a intervalo de 10 µM) e (ii) a exposição foi limitada ao início do período embrionário. Além de diminuição da fecundidade, mesmo em doses mais baixas, nossos ensaios de habituação revelaram que vermes expostos ao BPA como embriões necessários mais estímulos para tornar-se hábito quando comparado aos vermes expostos ao veículo sozinho15 (Figura 3). Estes efeitos são dignos de nota, em que se baseiam na exposição BPA de baixa dose, seguindo a lógica que efeitos mais sutis na função neuronal que pode não ser morfologicamente aparente são prováveis ser discernível através de mudanças de comportamento. Em suma, os resultados representativos apresentados aqui sublinhado o fato de que os efeitos nocivos da exposição BPA para um embrião influencia seu desenvolvimento, incluindo a função neuronal que pode ser avaliada através de ensaios de comportamentais adultos em c. elegans. Protocolos fornecidos aqui podem ser usados para testar os efeitos de baixa dose, bem como a longo prazo de outros potenciais tóxicos incluindo compostos de interrupções do sistema endócrino.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Figura 1: representação esquemática do desenho experimental. Vermes adultos foram coletadas e expostas a solução de hipoclorito a fim de coletar embriões sincronizados. Os embriões foram então expostos a diferentes concentrações de BPA para 4 h. Os embriões expostos foram transferidos para placas NGM semeadas, onde eles foram autorizados a crescer para 60 h a 20 ° C. Para testar a eficácia de exposição durante os estágios iniciais de desenvolvimento, os vermes L4 foram transferidos para pratos individuais e testados para a fecundidade, e jovens adultos foram testados com toque anterior habituação. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Figura 2: fecundidade é abaixada pelo BPA. Exposição de 1 µM e maiores concentrações de BPA diminuiu significativamente o número de ovos postos em comparação ao controle (representado pela linha horizontal; n = 10, *p &lt; 0,05). Barras de erro denotam SEM. análise feita utilizando ANOVA, teste post hoc de Tukey. Esta figura foi modificada de Mersha et al, 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Figura 3: efeitos a longo prazo da exposição BPA embrionária são refletidos no comportamento adulto. Os embriões expostos a concentrações de BPA tão baixas quanto 0,1 µM afeta habituação não-associativa toque anterior em adultos (n = 60, *p &lt; 0,05). Barras de erro denotam SEM; ANOVA, teste post hoc de Tukey. Esta figura foi modificada de Mersha et al, 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Exposição a tóxicos ambientais aguda pode afetar o desenvolvimento, com efeitos a longo prazo. Protocolos detalhados são fornecidos para ilustrar uma estratégia usando um modelo eficaz de laboratório para estudar o efeito da exposição embrionária precoce ao Bisfenol A. Nós fornecemos a fecundidade e ensaios comportamentais para monitorar a eficácia da nossas bio-ensaios de exposição tóxica.

A longo prazo consequências comportamentais e reprodutivas de embrionária exposição a baixas doses tóxicas para

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

O objetivo geral desses procedimentos é investigar os efeitos a longo prazo da exposição a baixas doses de BPA no início da embriogênese. Os embriões de C. elegans são expostos ao BPA por um período limitado e testados ao atingir a idade adulta quanto à fecundidade e comportamento de aprendizagem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre os efeitos de longo prazo no desenvolvimento da exposição a substâncias tóxicas, como bisfenóis e outros compostos desreguladores endócrinos.A principal vantagem dessa técnica é que ela permite testar os efeitos sutis e de longo prazo de tóxicos no desenvolvimento por meio de ensaios comportamentais quantitativos em um modelo de laboratório de invertebrados fácil de usar. As implicações dessa técnica se estendem à compreensão da base neural e de desenvolvimento dos efeitos deletérios à saúde da exposição a tóxicos, mesmo em doses baixas. Tivemos a ideia para esses experimentos quando percebemos que vários distúrbios complexos ou multifatoriais pareciam ter algum ou outro componente de desenvolvimento.O que pode exercer sua influência em parte por meio da expressão anômala de genes críticos. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de habituação ao toque interior podem ser difíceis de aprender apenas por meio de instruções baseadas em texto. No dia anterior à sincronização, transfira os vermes N2 para placas de 100 milímetros contendo meio NGM, espalhado com E.coli OP50.Por laje de aproximadamente um centímetro quadrado. Deixe os vermes crescerem por três dias a 20 graus Celsius. Após três dias, quando as placas estiverem preenchidas com adultos maduros e bem alimentados contendo embriões visíveis, comece a sincronização lavando primeiro cada placa com cinco milímetros de tampão M9 e transferindo o líquido para um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mililitros.Centrifugue a 3.000 vezes a gravidade por quatro minutos à temperatura ambiente. Após a certrifugação, use uma pipeta de dez mililitros para remover cuidadosamente o sobrenadante de cada pellet solto de vermes adultos. Em seguida, adicione 5 mililitros de solução de hipoclorito recém-preparada a cada pellet de minhocas e misture delicadamente.Centrifugue a 3.000 vezes a gravidade à temperatura ambiente por quatro minutos. É fundamental obter populações sincronizadas. Preparar uma solução fresca de hipoclorito ajuda a evitar contaminação e animais não sincronizados.Em seguida, use uma pipeta de dez mililitros para remover o sobrenadante e lave os sete mililitros de tampão M9. Repita esta etapa duas vezes. Após a última lavagem, adicione aproximadamente 100 microlitros de tampão M9 aos ovos.Em seguida, transfira cerca de 50 microlitros de ovos para dois tubos de microcentrífugas de mililitros contendo BPA diluído em tampão S. Ajuste a quantidade de tampão S para garantir a concentração final correta de BPA por tubo, conforme mostrado na tabela. Coloque os tubos em um agitador oscilante ou rotativo, movendo-se a 25 inclinações por minuto ou 25 RPM por quatro horas a 20 graus Celsius.Após quatro horas, coloque os tubos em suportes de tubos e deixe os vermes assentarem. Rejeitar o sobrenadante e transferir os vermes para placas NGM semeadas com OP50 E.coli. Deixe os vermes crescerem por 60 horas a 20 graus Celsius.Examine as placas todos os dias quanto a contaminação. As placas NGM contaminadas são geralmente descoloridas e acompanhadas por colônias individuais. Verifique se há superlotação nos vermes ao microscópio.Primeiro, use uma picareta de fio de platina de calibre 30 esterilizada a fogo para transferir aproximadamente dez vermes adultos jovens sincronizados para novas placas NGM não semeadas. Deixe os vermes intactos por cinco minutos para permitir que eles se acostumem com a nova placa. Em seguida, esterilize um pêlo da sobrancelha preso à ponta de um espeto de madeira ou palito de dente mergulhando em etanol a 70%.Limpe com um lenço de papel limpo e sem fiapos e aguarde um minuto para que o etanol evapore. Toque suavemente o verme na cabeça usando os pelos da sobrancelha. Repita os toques, permitindo dez segundos entre os toques para permitir que o verme se recupere.Continue a tocar, permita intervalos de dez segundos até que o verme não se mova mais para trás. Registre o número de toques necessários para que essa habituação ocorra. Permitir um intervalo de dez segundos entre os toques é importante, pois isso permite o tempo de recuperação do animal e ajuda a obter ensaios consistentes de comportamento de habituação.Animais adultos que foram expostos embrionariamente a uma concentração micromolar ou superior de BPAs colocaram significativamente menos ovos em comparação com o controle representado pela linha horizontal. Animais adultos derivados de embriões que foram expostos a concentrações de BPA tão baixas quanto 0,1 micromolar apresentam déficits não associativos com base no aumento do número de toques anteriores necessários para que eles se habituem. Ao preparar embriões para exposição ao BPA, é importante escolher uma placa com adultos C. elegans bem alimentados com ovos maduros visíveis ao microscópio de dissecação, a fim de ter um tamanho de amostra suficiente.Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da toxicologia ambiental avaliarem os efeitos de toxinas e outros compostos desreguladores endócrinos no comportamento e projetarem experimentos mecanicistas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expor embriões de C.elegans em estágio inicial ao BPA e como testar o comportamento de habituação nos adultos resultantes derivados dos embriões expostos ao BPA.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Triagem de toxicidade química baseada em embriões: avaliando os efeitos no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

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