A longo prazo consequências comportamentais e reprodutivas de embrionária exposição a baixas doses tóxicas para
6 de março de 2018
Exposição a tóxicos ambientais aguda pode afetar o desenvolvimento, com efeitos a longo prazo. Protocolos detalhados são fornecidos para ilustrar uma estratégia usando um modelo eficaz de laboratório para estudar o efeito da exposição embrionária precoce ao Bisfenol A. Nós fornecemos a fecundidade e ensaios comportamentais para monitorar a eficácia da nossas bio-ensaios de exposição tóxica.
O objetivo geral desses procedimentos é investigar os efeitos a longo prazo da exposição a baixas doses de BPA no início da embriogênese. Os embriões de C. elegans são expostos ao BPA por um período limitado e testados ao atingir a idade adulta quanto à fecundidade e comportamento de aprendizagem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre os efeitos de longo prazo no desenvolvimento da exposição a substâncias tóxicas, como bisfenóis e outros compostos desreguladores endócrinos.
A principal vantagem dessa técnica é que ela permite testar os efeitos sutis e de longo prazo de tóxicos no desenvolvimento por meio de ensaios comportamentais quantitativos em um modelo de laboratório de invertebrados fácil de usar. As implicações dessa técnica se estendem à compreensão da base neural e de desenvolvimento dos efeitos deletérios à saúde da exposição a tóxicos, mesmo em doses baixas. Tivemos a ideia para esses experimentos quando percebemos que vários distúrbios complexos ou multifatoriais pareciam ter algum ou outro componente de desenvolvimento.
O que pode exercer sua influência em parte por meio da expressão anômala de genes críticos. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de habituação ao toque interior podem ser difíceis de aprender apenas por meio de instruções baseadas em texto. No dia anterior à sincronização, transfira os vermes N2 para placas de 100 milímetros contendo meio NGM, espalhado com E.coli OP50.
Por laje de aproximadamente um centímetro quadrado. Deixe os vermes crescerem por três dias a 20 graus Celsius. Após três dias, quando as placas estiverem preenchidas com adultos maduros e bem alimentados contendo embriões visíveis, comece a sincronização lavando primeiro cada placa com cinco milímetros de tampão M9 e transferindo o líquido para um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mililitros.
Centrifugue a 3.000 vezes a gravidade por quatro minutos à temperatura ambiente. Após a certrifugação, use uma pipeta de dez mililitros para remover cuidadosamente o sobrenadante de cada pellet solto de vermes adultos. Em seguida, adicione 5 mililitros de solução de hipoclorito recém-preparada a cada pellet de minhocas e misture delicadamente.
Centrifugue a 3.000 vezes a gravidade à temperatura ambiente por quatro minutos. É fundamental obter populações sincronizadas. Preparar uma solução fresca de hipoclorito ajuda a evitar contaminação e animais não sincronizados.
Em seguida, use uma pipeta de dez mililitros para remover o sobrenadante e lave os sete mililitros de tampão M9. Repita esta etapa duas vezes. Após a última lavagem, adicione aproximadamente 100 microlitros de tampão M9 aos ovos.
Em seguida, transfira cerca de 50 microlitros de ovos para dois tubos de microcentrífugas de mililitros contendo BPA diluído em tampão S. Ajuste a quantidade de tampão S para garantir a concentração final correta de BPA por tubo, conforme mostrado na tabela. Coloque os tubos em um agitador oscilante ou rotativo, movendo-se a 25 inclinações por minuto ou 25 RPM por quatro horas a 20 graus Celsius.
Após quatro horas, coloque os tubos em suportes de tubos e deixe os vermes assentarem. Rejeitar o sobrenadante e transferir os vermes para placas NGM semeadas com OP50 E.coli. Deixe os vermes crescerem por 60 horas a 20 graus Celsius.
Examine as placas todos os dias quanto a contaminação. As placas NGM contaminadas são geralmente descoloridas e acompanhadas por colônias individuais. Verifique se há superlotação nos vermes ao microscópio.
Primeiro, use uma picareta de fio de platina de calibre 30 esterilizada a fogo para transferir aproximadamente dez vermes adultos jovens sincronizados para novas placas NGM não semeadas. Deixe os vermes intactos por cinco minutos para permitir que eles se acostumem com a nova placa. Em seguida, esterilize um pêlo da sobrancelha preso à ponta de um espeto de madeira ou palito de dente mergulhando em etanol a 70%.
Limpe com um lenço de papel limpo e sem fiapos e aguarde um minuto para que o etanol evapore. Toque suavemente o verme na cabeça usando os pelos da sobrancelha. Repita os toques, permitindo dez segundos entre os toques para permitir que o verme se recupere.
Continue a tocar, permita intervalos de dez segundos até que o verme não se mova mais para trás. Registre o número de toques necessários para que essa habituação ocorra. Permitir um intervalo de dez segundos entre os toques é importante, pois isso permite o tempo de recuperação do animal e ajuda a obter ensaios consistentes de comportamento de habituação.
Animais adultos que foram expostos embrionariamente a uma concentração micromolar ou superior de BPAs colocaram significativamente menos ovos em comparação com o controle representado pela linha horizontal. Animais adultos derivados de embriões que foram expostos a concentrações de BPA tão baixas quanto 0,1 micromolar apresentam déficits não associativos com base no aumento do número de toques anteriores necessários para que eles se habituem. Ao preparar embriões para exposição ao BPA, é importante escolher uma placa com adultos C. elegans bem alimentados com ovos maduros visíveis ao microscópio de dissecação, a fim de ter um tamanho de amostra suficiente.
Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da toxicologia ambiental avaliarem os efeitos de toxinas e outros compostos desreguladores endócrinos no comportamento e projetarem experimentos mecanicistas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expor embriões de C.elegans em estágio inicial ao BPA e como testar o comportamento de habituação nos adultos resultantes derivados dos embriões expostos ao BPA.
Visão Geral
Este estudo investiga os efeitos de longo prazo da exposição a baixas doses de bisfenol A (BPA) durante a embriogênese inicial, utilizando C. elegans como organismo modelo. A pesquisa concentra-se em ensaios de fecundidade e comportamentais para avaliar o impacto do BPA no desenvolvimento e no comportamento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Ecotoxicologia
- Biologia do desenvolvimento
- Neurociência comportamental
Antecedentes
- A exposição a toxicantes ambientais pode ter efeitos duradouros no desenvolvimento.
- O BPA é um composto disruptor endócrino que pode influenciar a expressão gênica.
- O C. elegans é um modelo adequado para estudar desfechos no desenvolvimento e no comportamento.
- Compreender esses efeitos pode ajudar a abordar distúrbios complexos com componentes desenvolvimentais.
Objetivo do Estudo
- Investigar os efeitos da exposição embrionária precoce ao BPA.
- Avaliar a fecundidade e o comportamento de aprendizagem em C. elegans adultos.
- Fornecer um método para avaliar os impactos de longo prazo de substâncias tóxicas.
Métodos Utilizados
- Sincronização de embriões de C. elegans para exposição controlada.
- Exposição a concentrações variadas de BPA durante a embriogênese.
- Ensaios comportamentais para medir habituação e fecundidade em adultos.
- Demonstração visual dos métodos para auxiliar na compreensão das etapas do procedimento.
Resultados Principais
- Adultos expostos ao BPA exibiram fecundidade reduzida em comparação com os controles.
- Até baixas concentrações de BPA provocaram déficits comportamentais na habituação.
- Ensaios quantitativos revelaram efeitos subtis de longo prazo da exposição ao BPA.
- A metodologia permite a avaliação dos impactos desenvolvimentais de tóxicos.
Conclusões
- Esta técnica fornece informações sobre os efeitos de toxicantes ambientais no desenvolvimento.
- Os achados contribuem para a compreensão da base neural dos efeitos sobre a saúde decorrentes da exposição a toxicantes.
- O estudo destaca a importância da avaliação dos impactos de toxicantes em baixas doses.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite que equipes de P&D de biofármacos modelizem as consequências de longo prazo no desenvolvimento e no comportamento decorrentes da exposição a baixas doses de disruptores endócrinos, utilizando um sistema de invertebrados geneticamente manipulável. Ao quantificar a fecundidade e o comportamento de habituação em C. elegans adultos após exposição embrionária a tóxicos, o método auxilia na desmistificação mecanicista de compostos ambientais já nos estágios iniciais da validação de alvos. Ele fornece uma plataforma quantitativa e escalável para avaliar sinais de toxicidade neurodesenvolvimental e reprodutiva relevantes ao perfil de segurança preditivo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar os mecanismos de tóxicos que afetam vias de desenvolvimento e redes de expressão gênica relacionadas à disruptão endócrina.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos moleculares envolvidos na reparação do DNA, apoptose e plasticidade neural por meio de leituras fenotípicas.
- Valor Preditivo: Gera dados de resposta à dose para efeitos em baixas doses, que orientam as margens de segurança dos alvos e reduzem os riscos de hipóteses antes dos testes em mamíferos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Produz pontos finais padronizados e quantificáveis (contagem de ovos, contagem de toques de habituação) adequados para triagem de alta densidade de bibliotecas de compostos.
- Reprodutibilidade: A sincronização embrionária e a exposição controlada garantem condições basais consistentes entre réplicas e laboratórios.
- Escalabilidade: O modelo de invertebrado simples permite triagem economicamente viável de múltiplas concentrações de toxicantes e análogos estruturais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela déficits persistentes no comportamento e na reprodução originados por lesão no desenvolvimento inicial, refletindo os efeitos latentes na saúde provocados por EDCs.
- Continuidade Tradutiva: Conecta eventos moleculares iniciadores no embrião a desfechos fenotípicos na vida adulta, apoiando o desenvolvimento de vias de desfecho adverso (AOP).
- Avaliação de Risco: Fornece dados empíricos sobre limiares de efeitos em baixas doses para subsidiar cálculos de margem de exposição e modelos pré-clínicos de risco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, nos quais informações mecanicistas obtidas a partir de modelos simples orientam a seleção de alvos e a priorização de compostos antes de se investir em sistemas mamíferos complexos.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses sobre a interrupção induzida por tóxicos nas redes genéticas do desenvolvimento e na função neural, utilizando saídas comportamentais e reprodutivas mensuráveis.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e normalizadas (fecundidade, habituação) que permitem comparação entre doses de tóxicos e classes químicas.
- Análises: Gera curvas dose-resposta para desfechos apicais que apoiam a modelagem de dose de referência e a extrapolação entre espécies.
- Pesquisa Translacional: Relaciona perturbações moleculares precoces a alterações fenotípicas persistentes, auxiliando na identificação de biomarcadores para neurotoxicidade do desenvolvimento.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de triagem de tóxicos aplicável a bisfenóis, ftalatos e outros compostos com atividade endócrina em programas de saúde ambiental.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao conectar a exposição embrionária a déficits funcionais na aprendizagem e na reprodução na fase adulta.
- Valor Operacional: Oferece um sistema de baixo custo e compatível com alta produtividade, com protocolos padronizados para adoção entre diferentes equipes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao identificar compostos bioativos com risco de toxicidade no desenvolvimento já nos estágios iniciais da pesquisa.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base no potencial de toxicidade no desenvolvimento, reduzindo a eliminação em fases tardias.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de C. elegans, sincronização de embriões e observação microscópica do comportamento.
- Depende do acesso a incubadoras, agitadores rotativos, tubos de microcentrífuga e estereomicroscópios para a realização do ensaio de toque.
- Necessita padronização na preparação do hipoclorito, na duração da exposição e nos intervalos entre estímulos para garantir a validade do ensaio.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a outros toxicantes ou a linhagens alternativas de nematoides com perfis de sensibilidade diferentes.
- Limita-se a modelos invertebrados; os achados exigem validação ortogonal em sistemas vertebrados para relevância regulatória.
