Name: Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de camundongos anestesiados usando micromanipulador. Esta técnica reduz a contaminação sanguínea e permite análise precisa de biomarcadores em doenças neurais.

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Este trabalho foi apoiado pelo Nacional Natural Science Foundation da China (81650110527, 81371400) e nacional chave básica pesquisa programa de China (2013CB530900).

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as políticas da sociedade de neurociência (EUA) e comissões de ética de Fudan University (Shanghai, China). Este procedimento é para uma cirurgia não-sobrevivência.
1. instalação de aparelhos de coleção do CSF
<ol><li>Puxe o vidro capilar (diâmetro interno de 0,75 mm, diâmetro externo 1,0 mm) usando um extrator de micropipeta (conforme mostrado no Liu et al . 10; capilar afiada é mostrado na Figura 1).</li>
	<li>Lugar um capilar no suporte do capilar de vidro afiado firmemente montado em um micromanipulador (figura 1A).</li>
	<li>Quebrar a ponta do capilar afiado com pinça reta sob um microscópio de dissecação, para que o diâmetro interno da ponta quebrada é sobre 10-20 µm (Figura 1).</li>
	<li>Anexar um tubo fino e uma seringa para a outra extremidade do titular do capilar e conectar a seringa e o tubo fino com uma válvula de três vias.</li>
	<li>Deslocar a válvula de três vias para abrir e mergulhar a seringa para soprar ar da seringa através da tubulação para o capilar de expulsar todos os contaminadores e criar pressão positiva no tubo capilar de vidro.</li>
	<li>Repita isso algumas vezes por dis-ligação e re-conectar a seringa para a válvula de três vias e elaborar a seringa ~ 100-200 µ l antes da última re-conexão da seringa com a válvula de três vias (figura 1B).</li>
	<li>Mova o micromanipulador com o capilar de vidro para o lado para evitar danos durante a dissecção do mouse.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56774/56774fig1.jpg"> Figura 1. Microscópio, micromanipulador e instalação capilar. (A) microscópio e micromanipulador com capilar anexado setup, bem como uma imagem mais perto de (B) a seringa conectada e a válvula de três vias para abrir (mostrado aqui) ou fechar a tubulação e (C) uma ininterrupta (direita) e quebrado (à esquerda) ponta capilar pronta para coleta do CSF. Uma vez quebrado, a ponta do capilar deve ter um diâmetro interno de 0,75 mm, diâmetro externo de 1,0 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56774/56774fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Mouse dissecação
<ol><li>Anestesia o mouse. Nota: para este protocolo, C57BL/6 e amiloide precursora da proteína/presenilina 1 (APP/PS1) transgénicos (modelo do rato da doença de Alzheimer) ratos foram utilizados e anestesiados com 4% hidrato de cloral (em dH20) em 10 µ l/g do peso do mouse via intraperitoneal injeção.</li>
	<li>Quando totalmente anestesiados, certifique-se de que o mouse é adequadamente anestesiado. A resposta de retirada aos pés pitada, ligeiramente estendendo membros posteriores e beliscar os dedos e olhando para uma resposta de retirada, é executada para garantir a adequada anestesia. Verificar por beliscar todos os quatro membros; Se não houver nenhuma reação o mouse corretamente é anestesiado. Cortar e aparar o cabelo na parte de trás da cabeça do mouse acima dos olhos, entre os ouvidos para a parte inferior do pescoço com uma tesoura de dissecação (Figura 2A). Alternativamente, tosquiadeiras ou creme depilatório pode ser usado para ajudar na remoção de pelos.</li>
	<li>Fixar a cabeça do rato usando um adaptador para mouse (parte de trás da cabeça virada para cima com o nariz apontado para baixo ~ 45 °, Figura 2A). Corrigir barras de orelha entre as orelhas e os olhos do mouse e aperte. Verifique se a cabeça não pode se mover e está segura firmemente o adaptador empurrando suavemente para baixo para a cabeça do rato.</li>
	<li>Verifique novamente a resposta de retirada para toe pitada antes de fazer a incisão cirúrgica e regularmente posteriormente para garantir o plano cirúrgico da anestesia. Visualmente, observe qualquer alteração na taxa respiratória durante o procedimento para indicar alterações nos planos da anestesia. Uma técnica limpa, não assépticas, pode ser usada para esta cirurgia não-sobrevivência curta. Usando uma tesoura e pinça curvada, corte a pele e a primeira camada do músculo até a base do crânio é exposta com apenas uma fina camada de músculo. Nota: Corte através da pele de rato em toda a volta do pescoço e em seguida, corte a pele para baixo no meio do crânio entre as orelhas e os olhos do rato. Pele e tecido podem então ser puxados distante e fora da área a cisterna magna.</li>
	<li>Enquanto a visualização através do microscópio de dissecação, cuidadosamente dissecar fora o último finas camadas de músculo sobre a base do crânio usando fórceps e mover estas camadas de músculo para o lado e fora da área de interesse. Se lá está sangrando, use cotonetes para remover e ajudar a parar o sangramento.</li>
	<li>Uma vez que a dura-máter sobre a cisterna magna é exposta (forma triangular com geralmente 1-2 grandes vasos sanguíneos que atravessa a área; ambos os lados de ou entre os vasos sanguíneos é ideal para inserção capilar e coleção de CSF, Figura 2B), use um úmido cotonete para limpar a membrana e em seguida, use um cotonete seco para secar a área.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56774/56774fig2.jpg"> Figura 2. Configuração de mouse e dissecação com imagens representativas de inserção capilar para coleção CSF. Configuração do mouse pronta para extração de CSF com (A) raspou a cabeça presa no lugar para dissecção e (B) detalhadas imagem (vista de x 10) de um rato dissecado dura cobrindo a cisterna magna (seta tracejada mostra um vaso sanguíneo que atravessa a área e seta sólida mostra área ideal para inserção capilar). Imagens detalhadas (10 x modo de exibição) de (C) afiada ponta do capilar de vidro alinhada contra a dura-máter da cisterna magna, (D) o ponto em que o capilar puncturas quase a dura-máter, com alguma resistência de dura-máter e (E) a ponta capilar aproveitada através da dura-máter para coletar CSF. CSF deve ser um líquido coletado no vidro capilar (seta pontilhada). Todas as barras de escala na parte inferior direita de cada imagem de microscópio indicam 100 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56774/56774fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. CSF coleção de Mouse anestesiado
<ol><li>Alinhe o capilar de vidro na parte de trás da cabeça do rato, de modo que o ponto afiado é apenas atrás da membrana em um ~ 30-45 ° ângulo (Figura 2).</li>
	<li>Mergulhar a seringa uma vez ou algumas vezes e elaborar a seringa ~ 100-200 µ l (para certificar-se de que não há nenhum contaminante e existe pressão negativa no vidro capilar).</li>
	<li>Usando o micromanipulador, mova o capilar dica mais perto da membrana até a resistência pode ser vista, mas não puncioná-la (Figura 2D).</li>
	<li>Uma vez que a resistência é vista entre a ponta do capilar e a membrana, bata levemente o tubo capilar através da membrana por bater nos controles de micromanipulador. Use o microscópio para ver o ponto afiado da punção capilar para a cisterna magna. CSF automaticamente deve ser desenhado dentro do tubo capilar, uma vez que a abertura foi esvaziada (Figura 2E).</li>
	<li>Sair do capilar para coletar lentamente CSF. Se o CSF parou de desenhar, desenhar a seringa uma pequena quantidade lentamente (~ 50 µ l) para criar pressão mais negativa no capilar para extrair para fora o CSF. Nota: Alternativamente, capilar pode ser suavemente e lentamente tirou o cérebro usando os controles bem micromanipulador para permitir CSF flua capilar novamente. Um montante total de ~ 10-15 µ l de LCR (~ 3-4 cm no capilar) leva ~ 10-30 min e ocasionalmente de 20 µ l ou mais podem ser coletados. Embora não seja absolutamente necessário, é recomendável usar uma almofada de calor durante a coleta do CSF. Coleção de CSF foi realizada à temperatura ambiente (~ 23 ° C).</li>
	<li>Uma vez que a quantidade de LCR desejado é coletada, feche o tubo deslocando-se a válvula de três vias para fechar (para parar de desenhar fora o CSF).</li>
	<li>Retire a seringa conectada para o tubo e abrir e fechar o tubo (para criar pressão equalizada no capilar, um tubo e a área fora do capilar). Reconectar a seringa com a válvula de três vias, mas não mergulhe a seringa.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o capilar de vidro do mouse usando o micromanipulador.</li>
	<li>Coloque o tubo de coleta (microtubos de 1,5 mL com 1 µ l de 20 x inibidor da protease) sob o ponto afiado do vidro capilar.</li>
	<li>Abra o tubo e mergulhar suavemente a seringa: o CSF deve fluir fora do capilar e o tubo de coleta.</li>
	<li>Após a coleta, centrifugar rapidamente (pulso rotação por 5 s, a velocidade máxima, usando uma mini centrífuga) o CSF para misturar a amostra com o inibidor de protease na parte inferior do tubo da coleção. Nota: As amostras de CSF podem ser aliquotadas e então armazenados para posterior análise a-80 ° C. O resto do mouse pode ser dissecado para outros tecidos, tais como cérebro e medula espinhal. O mouse ainda está vivo nesta fase e, portanto, sangue pode também ser recolhido, se necessário.</li>
</ol>

<ol><li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+Biomarkers+for+Alzheimer%27s+Disease+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Alzheimers.+Dis%22%5BJournal%5D)">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li>
<li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li>
<li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li>
<li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer%27s+disease+diagnosis%3A+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer%27s+Biomarkers+Standardization+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Dement%22%5BJournal%5D)">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li>
<li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/archive/2014/302712/">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li>
<li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li>
<li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+observation+on+CSF+A%CE%B242+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein%2Fpresenilin-1+doubly+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li>
<li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Dement%22%5BJournal%5D)">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li>
<li>You, J. -S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li>
<li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li>
<li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+amyloid-%CE%B2+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2(2013).</li>
<li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve, em detalhes, uma técnica que melhora na atual métodos10 da coleção do CSF para minimizar a contaminação do sangue e permitir a coleção abundante de LCR (em média ~ 10-15 µ l podem ser obtidos) dos ratos. Ao quebrar a ponta capilar, a ponta do capilar não deve ser muito pequena (como então o CSF será extraído muito lentamente) ou muito grande (vontade não ser fino o suficiente para recolher o CSF e tecido pode tornar-se alojou no capilar). Tenha cuidado quando dissecando a ...

O CSF é um fluido corporal valioso para análise na pesquisa da neurociência. O CSF é feito principalmente do plasma sanguíneo, que contém poucas células (sem células vermelhas do sangue e apenas algumas células brancas do sangue) e é quase livre de proteína. É um dos fluidos em contato próximo com o sistema nervoso central (SNC) e pode passar muitos eletrólitos para fora do cérebro e da medula espinhal para o sistema periférico. Em humanos, CSF amostras podem ser coletadas para auxiliar no diagnóstico de doenças ou para fins de pesquisa em ensaios clínicos, como uma punção (ou punção lombar) é um procedimento invasivo, menor: o fluido CSF pode refletir as alterações no SNC sem ter que acessar diretamente estas tecidos. Assim, nos últimos anos, para fins de pesquisa, na clínica, amostras de CSF foram obtidas de pacientes de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer e outras demências1,2,3. Existem muitos ensaios de biomarcador que foram desenvolvidos usando amostras do CSF para potencialmente auxiliar no diagnóstico de doenças na clínica2,3. No entanto, existe muito debate sobre a fiabilidade destes ensaios para produzir resultados consistentes, sensíveis para diagnosticar especificamente doença4,5. Então, há uma grande necessidade para o desenvolvimento de melhores ensaios e alvos, que podem ser encontrados no CSF, para auxiliar na produção de uma norma técnica para diagnosticar doenças neurodegenerativas com maior sensibilidade e especificidade. Devido a importância potencial das amostras de CSF humanas na doença, a coleção de LCR de roedores em pesquisas de Neurociências também é de interesse.
Ratos são animais importantes em pesquisas biológicas e médicas e permitam o teste de potenciais compostos terapêuticos e estudos de prova de conceito antes de testes clínicos em humanos. No entanto, em camundongos é difícil obter amostras CSF devido a sua proximidade ao cérebro de um animal pequeno, como o método usual de coleção do CSF em camundongos é obtê-la através da cisterna magna, uma abertura entre o cerebelo e a superfície dorsal da medulla oblongata. Isso faz com que a dificuldade na coleta de amostras de CSF nesta área é difícil de dissecar a e na proximidade de vasos sanguíneos, aumentando o risco de contaminação das células do sangue. Devido a essas dificuldades, a maioria dos pesquisadores só podem obter uma pequena quantidade de LCR para análise (geralmente indicado como 5 a 7 µ l) e a contaminação das amostras do CSF por pilhas de sangue é uma preocupação primordial para análises6,7,8 , 9. contaminação de sangue pode obscurecer os resultados e não realmente refletem o estado do SNC. Além disso, amostra limitada coletada pode afetar a pesquisa como a quantidade habitual coletada de ratos é suficiente para apenas uma medição (em duplicado ou triplicado) utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Assim, amostras de CSF são geralmente agrupadas de vários mouses para ter suficiente amostra para executar vários ensaios. Desenvolver um protocolo para a abundante, coleção incontaminada de LCR de ratos é muito desejada e será benéfica na melhoria da investigação neurociência usando roedores.
Neste protocolo, uma técnica para a abundante (uma média de 10-15 µ l) coleção de LCR de ratos anestesiados é descrita em detalhes e melhora em um método atualmente conhecido da coleção do CSF para minimizar a contaminação do sangue10. Um protocolo robusto para coleção CSF ajudarão no desenvolvimento dos ensaios baseados em CSF biomarcador, que poderia ser usado para auxiliar no diagnóstico de doenças, bem como melhorar a pesquisa para os mecanismos subjacentes a doenças que afectam o CNS.

<table><tbody><tr><td>Hidrato de cloral (usado como anestésico)</td><td>Sinopharm Chemicals Reagen Co., Ltd.</td><td>30037517</td><td>número CAS 302-17-0.</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>66 tecnologia de visão</td><td>54002</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação curva</td><td>66 tecnologia de visão</td><td>53072</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação reta</td><td>66 tecnologia de visão</td><td>53070</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de mouse (com barras de ouvido)</td><td>Feito internamente.</td><td>N/A</td><td>Equipamento similar disponível na World Precision Instruments.</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Meiji Labax</td><td>Modelo 15381</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>Base magnética para micromanipulador</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Sutter</td><td>Instruments Modelo P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Seringas (1ml)</td> <td>Tansoole</td><td>02024692</td><td>Para 1ml.</td></tr><tr><td>Microtubos (1.5ml)</td><td>Axigen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease Conjunto de coquetel III Calbioquímico sem EDTA</td><td></td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>A&beta Humano; 42 Kit ELISA</td><td>Invitrogen</td><td>KHB3441</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação (tubo de teflon)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MMP-KIT</td><td>Obtido a partir de um kit de microinjeção e acoplado ao suporte capilar e à seringa.</td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Tiangen Biotech</td><td>OSE-MC8</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td>Obtido em qualquer loja / farmácia doméstica.</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

O líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido corporal valioso para análise na pesquisa da neurociência. É um dos fluidos em contato mais próximo com o sistema nervoso central e assim, pode ser usado para analisar o estado doente do cérebro ou da medula espinhal sem acessar diretamente esses tecidos. No entanto, em ratos, é difícil de obter da cisterna magna devido a sua proximidade de vasos sanguíneos, que muitas vezes contaminar amostras. A área para a coleção do CSF em ratos também é difícil de dissecar a e muitas vezes apenas pequenas amostras são obtidas (máximo de 5 a 7 µ l ou menos). Este protocolo descreve, em detalhes, uma técnica que melhora na atuais métodos de coleção para minimizar a contaminação do sangue e permitir a coleção abundante de LCR (em média que 10-15 µ l podem ser coletados). Esta técnica pode ser usada com outros métodos de dissecação na recolha de tecidos de ratos, como isso não afeta quaisquer tecidos durante a extração do CSF. Assim, o cérebro e a medula espinhal não são afetados com esta técnica e permanecem intactos. Com a maior coleção de amostra do CSF e pureza, mais análises podem ser usadas com esta pesquisa de neurociência do fluido para mais ajuda e entendem melhor as doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.

Usando o procedimento descrito aqui (Figura 1 e Figura 2), o CSF imediatamente recolhido no capilar deve ser clara (Figura 2E), não rosa ou vermelho. Se houver uma rosa para coloração avermelhada para o fluido coletado no capilar, depois houve contaminação com sangue.
Como um exemplo da aplicação da amostra do CSF coletados com esse método,...

Este protocolo descreve uma técnica melhorada para a coleção abundante de líquido cerebrospinal (CSF), sem contaminação de sangue. Com a maior coleção de amostra e pureza, mais análises podem ser executadas usando o CSF para aprofundar nossa compreensão das doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.

Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

O objetivo geral deste procedimento é melhorar a coleta de líquido cefalorraquidiano de camundongos sem contaminação do sangue. Este método fornece uma maneira fácil e confiável de coletar LCR para monitorar os biomarcadores de doenças neurais. A principal vantagem dessa técnica é que a adição com o micromanipulador para auxiliar na coleta de LCR de camundongos diminui a contaminação do sangue durante a coleta.Comece colocando um capilar de vidro puxado em um suporte capilar que está firmemente montado em um micromanipulador. Em seguida, durante a visualização através de um microscópio de dissecação, use uma pinça reta para quebrar a ponta do capilar afiado de modo que o diâmetro interno da ponta quebrada seja de cerca de 10 a 20 mícrons. Em seguida, conecte um tubo fino e uma seringa na outra extremidade do suporte capilar, conecte o tubo fino e a seringa com uma válvula de três vias e mude a válvula de três vias para abrir.Em seguida, mergulhe a seringa para expelir quaisquer contaminantes e criar pressão positiva no tubo capilar. Repita isso algumas vezes desconectando e reconectando a seringa à válvula de três vias. Em seguida, aspire o ar para 100 a 200 microlitros antes da re

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Modelos transgênicos (Tg) do mouse do AD uma excelente oportunidade para investigar como e por que níveis Aâ ou tau na mudança CSF como a doença progride em pacientes humanos. Aqui, nós demonstramos uma refinada técnica de punção da cisterna magna para amostragem CSF serial do mouse.

A técnica de coleta de líquido cefalorraquidiano Serial da Cisterna Magna em rato

Fonte: Sweeney, A. M., et al. Imagem in vivo do transporte de líquido cefalorraquidiano através do crânio intacto do camundongo usando macroscopia de fluorescência. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o processo de visualização do fluxo do líquido cefalorraquidiano (LCR) no cérebro de um camundongo usando imagens de fluorescência. Um traçador fluorescente é injetado na cisterna magna (MC), permitindo que seu movimento com o LCR seja rastreado através dos espaços subaracnóideo e perivascular.

Imagens in vivo do transporte de líquido cefalorraquidiano em um cérebro de camundongo usando macroscopia de fluorescência

O ventricular líquido cefalorraquidiano (LCR) banha os neuroepiteliais e cerebral células progenitoras corticais durante o desenvolvimento do cérebro no início do embrião. Aqui descrevemos o método desenvolvido para isolar CSF ventricular de embriões de roedores de idades diferentes, a fim de investigar a sua função biológica. Além disso, podemos demonstrar o nosso dissecção explante cerebral cortical e técnica de cultura que permite o crescimento de explantes com volumes mínimos de meio de...

Isolamento de fluido cerebrospinal de embriões de roedores para uso com dissecados Cerebral Cortical Explantes

A imagem latente ótica de Transcranial permite a imagem latente do largo-campo do transporte do líquido cerebrospinal no córtice de ratos vivos através de um crânio intacto.

In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia

Níveis elevados de proteína do fluido espinhal podem ser o resultado da difusão da proteína plasmática através de uma barreira hemato-cerebral alterada ou síntese intratérica. Um protocolo de teste otimizado é apresentado neste artigo que ajuda a discriminar ambos os casos e fornece medições quantitativas de proteínas sintetizadas intrathecally.

Medição quantitativa de proteínas sintetizadas intrathecally em camundongos

Este artigo descreve um protocolo detalhado para aumentar a concentração de glicose no líquido cefalorraquidiano (LCR) de camundongos. Esta abordagem pode ser útil para estudar os efeitos da glicose elevada no LCR sobre a neurodegeneração, cognição e metabolismo periférico da glicose em camundongos.

Implante de Minibomba Osmótica para Aumento da Concentração de Glicose no Líquido Cefalor de Camundongos

Descrevemos um protocolo para avaliação de curvas dose-resposta para estimulação extracraniana em termos de medidas de campo elétrico cerebral e um biomarcador relevante de fluxo sanguíneo cerebral. Como esse protocolo envolve a colocação invasiva de eletrodos no cérebro, a anestesia geral é necessária, com respiração espontânea preferida em vez de respiração controlada.

Colocação de eletrodos estimuladores extracranianos e mensuração do fluxo sanguíneo cerebral e campos elétricos intracranianos em camundongos anestesiados

O protocolo mostra repetidas coletas de líquido cefalorraquidiano e sangue de ratos epilépticos realizadas em paralelo com a monitorização contínua por vídeo-eletroencefalograma (EEG). Estes são instrumentais para explorar possíveis ligações entre alterações em várias moléculas de fluido corporal e atividade convulsiva.

Amostragem de líquido cefalorraquidiano e sangue da veia lateral da cauda em ratos durante registros de EEG

Para estudar a regulação do fluxo sanguíneo cerebral in vivo, os métodos farmacológicos tradicionais são invasivos, muitas vezes danificando o crânio, a dura-máter e as leptomeninges. Neste trabalho, desenvolvemos uma técnica minimamente invasiva que combina injeção de magna intracisternal (ICM) guiada por nanoinjetor com imagens de contraste de manchas a laser, preservando a integridade do crânio e das leptomeninges.

Nanoinjeção de Cisterna Magna Emparelhada e Ensaio de Imagem de Contraste de Manchas a Laser para Estudar a Regulação do Fluxo Sanguíneo Cerebral In Vivo

Aqui, é apresentado um protocolo para avaliar os vasos linfáticos meníngeos (MLVs) de camundongos, que desempenham um papel importante em múltiplas doenças neurológicas. O objetivo desse protocolo é fornecer um método integrado que permita tanto a avaliação funcional da drenagem dos traçadores quanto a caracterização morfológica detalhada da rede de MLVs dorsais.

Protocolo Integrado para Avaliação de Linfáticos Meníngeos: Injeção de Cisterna Magna, Imagem de Linfonodos, Dissecção Meníngea e Coloração em Montagem Inteira

Aprenda um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de camundongos anestesiados usando micromanipulador. Esta técnica reduz a contaminação sanguínea e permite análise precisa de biomarcadores em doenças neurais.

Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados

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