Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados

O objetivo geral deste procedimento é melhorar a coleta de líquido cefalorraquidiano de camundongos sem contaminação do sangue. Este método fornece uma maneira fácil e confiável de coletar LCR para monitorar os biomarcadores de doenças neurais. A principal vantagem dessa técnica é que a adição com o micromanipulador para auxiliar na coleta de LCR de camundongos diminui a contaminação do sangue durante a coleta.

Comece colocando um capilar de vidro puxado em um suporte capilar que está firmemente montado em um micromanipulador. Em seguida, durante a visualização através de um microscópio de dissecação, use uma pinça reta para quebrar a ponta do capilar afiado de modo que o diâmetro interno da ponta quebrada seja de cerca de 10 a 20 mícrons. Em seguida, conecte um tubo fino e uma seringa na outra extremidade do suporte capilar, conecte o tubo fino e a seringa com uma válvula de três vias e mude a válvula de três vias para abrir.

Em seguida, mergulhe a seringa para expelir quaisquer contaminantes e criar pressão positiva no tubo capilar. Repita isso algumas vezes desconectando e reconectando a seringa à válvula de três vias. Em seguida, aspire o ar para 100 a 200 microlitros antes da reconexão final da seringa com a válvula de três vias.

Mova o micromanipulador com o capilar de vidro para o lado para evitar danos durante o procedimento cirúrgico. Antes de iniciar a cirurgia, certifique-se de que o camundongo foi totalmente anestesiado, beliscando os quatro membros e observando a ausência de reação. Em seguida, use uma tesoura de dissecação para cortar e aparar o cabelo na parte de trás da cabeça do rato, de cima dos olhos entre as orelhas até a parte inferior do pescoço.

Prenda a cabeça do mouse usando um adaptador de mouse de quadro estereotáxico. Certifique-se de que a cabeça não possa se mover e esteja firmemente presa no adaptador, empurrando suavemente para baixo a cabeça do mouse. Use uma tesoura e uma pinça curva para cortar a pele do rato na parte de trás do pescoço e, em seguida, no meio do crânio entre as orelhas e os olhos do rato.

Separe a pele e o tecido e saia da área sobre a cisterna magna. Enquanto visualiza através do microscópio de dissecação, disseque cuidadosamente as últimas camadas finas de músculo sobre a base do crânio usando uma pinça e mova essas camadas de músculo para o lado e para fora da área de interesse. Assim que a dura-máter sobre a cisterna magna estiver exposta, use um cotonete úmido para limpar a membrana e, em seguida, use um cotonete seco para secar a área.

A cisterna magna parece triangular com um a dois grandes vasos sanguíneos correndo pela área. Ambos os lados ou entre os vasos sanguíneos são ideais para inserção capilar e coleta de LCR. Uma vez que a cisterna magna esteja exposta, use o micromanipulador para alinhar o capilar de vidro com a parte de trás da cabeça do mouse, de modo que a ponta afiada fique logo atrás da membrana em um ângulo de 30 a 45 graus.

Em seguida, mergulhe a seringa uma ou algumas vezes e, em seguida, mova o êmbolo para trás 100 a 200 microlitros para garantir que não haja contaminantes e que haja pressão negativa no capilar de vidro. Em seguida, aproxime a ponta capilar da membrana até que a resistência possa ser vista, mas sem perfurar a membrana. Bata nos controles do micromanipulador para bater suavemente no tubo capilar através da membrana.

O LCR deve ser puxado automaticamente para dentro do tubo capilar assim que a abertura for perfurada. Deixe o capilar no lugar para coletar lentamente o LCR. Se o LCR parou de fluir, puxe lentamente a seringa aproximadamente 50 microlitros para criar mais pressão negativa no capilar.

Dez a 15 microlitros de LCR são coletados em 10 a 30 minutos. Uma vez coletado o volume desejado de LCR, feche a tubulação deslocando a válvula de três vias para fechar e remova a seringa conectada à tubulação. Abra e feche a tubulação para criar pressão equalizada no capilar, na tubulação e na área externa ao capilar.

Em seguida, reconecte a seringa antes de remover suavemente o capilar de vidro do mouse usando o micromanipulador. Em seguida, coloque o tubo de coleta contendo um microlitro de inibidor de protease 20X sob a ponta afiada do capilar de vidro. Abra o tubo e mergulhe suavemente a seringa.

O LCR deve fluir para fora do capilar e para o tubo de coleta. Após a coleta, centrifugue o LCR por pulso para misturar a amostra com o inibidor de protease no fundo do tubo de coleta. As amostras de LCR podem ser aliquotadas e armazenadas para análise posterior a 80 graus Celsius negativos.

O LCR coletado de camundongos APP / PS1 demonstrou um aumento significativo nos níveis de A beta 42 humano aos 12 meses de idade. Em camundongos do tipo selvagem, nenhum A beta 42 humano foi detectado. Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito em uma hora se executado corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar vasos sanguíneos ao inserir o capilar e fazer apenas pequenos ajustes com o micromanipulador durante a coleta do LCR para evitar contaminação com sangue.