Name: Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprenda a registrar transientes de cálcio em dendritos neuronais usando imagem de dois fotões combinada com patch-clamp de célula inteira em fatias agudas de hipocampo de camundongo. Este método oferece alta resolução espaçotemporal para estudar a integração sináptica e a plasticidade dendrítica.

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de institutos canadenses de pesquisa em saúde, ciências naturais e pesquisa de engenharia (NSERC Discovery Grant) e a Fundação de Savoy. OC foi apoiado por uma bolsa de doutorado do NSERC.

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes de bem-estar dos animais do Comitê de proteção Animal de Université Laval e o Conselho canadense no cuidado Animal.
1. preliminar preparação (opcional: Prepare-se 1 dia de antecedência)
<ol><li>Prepare três tipos de solução artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) (Normal, sacarose e soluções de recuperação, 1L cada; ver tabela 1). Ajustar a pressão osmótica das soluções para 300 ± 10 mOsm25 e esfriar a ACSF-sacarose até um ponto perto de congelamento (0-4 ° C). Nota: O uso de uma solução de corte baixo teor de sódio (ACSF-sacarose) ajuda a preservar a viabilidade dos neurônios nas camadas superficiais de fatias aguda26.</li>
	<li>Preparar 0,75 mL de remendo-solução contendo um fluoróforo vermelho (por exemplo, Alexa-594) e um indicador de cálcio sintético verde (por exemplo, Oregon Green BAPTA-1; consulte a tabela 1). Incluem biocytin (ver tabela 1) na solução de patch se post hoc identificação morfológica das células gravadas é necessária.</li>
	<li>Ajuste a pressão osmótica da solução de 280 mOsm ± 5 e pH 7,35 ± 0,5. Manter a solução na geladeira ou no gelo em todos os momentos. Nota: A escolha do indicador de cálcio deve ser baseada na sua gama dinâmica e sobre a natureza dos eventos Ca2 + investigadas.</li>
	<li>Usando um extrator de micropipeta, preparar pipetas de remendo de capilares de vidro de borosilicato (ver Tabela de materiais) com uma ponta de 2 µm ≈ (pipeta resistência de MΩ 3-5) e pipetas de estimulação dos capilares de theta-vidro borosilicato (ver tabela de de Materiais) com uma ponta de µm de 2-5. Nota: As configurações de extrator para pipetas de um determinado diâmetro e forma de fazer serão determinadas pelo tipo de filamento de extrator e os resultados do teste de rampa para um determinado tipo de vidro.</li>
</ol>2. hippocampal fatia preparação
<ol><li>Anestesiar o mouse (P13-20; a tensão e o sexo do rato é determinada pela pergunta experimental a ser tratada) com 1 mL de isoflurano colocado sobre uma toalha de papel dentro de uma câmara de narcose por inalação. Quando o animal é anestesiado profundamente, como evidenciado pela falta de movimento e respiração lenta, removê-lo da câmara de narcose e decapitar usando uma guilhotina.</li>
	<li>Expor o crânio cortando a pele com uma pequena tesoura na parte de trás do crânio ao nariz. Use um pequeno par de osso mini ruginas para fazer um furo no nível do bregma. Em seguida, use a tesoura para fazer um corte de caudal e rostral ao longo da sutura sagital. Com as ruginas Segure a parte de trás de cada crânio e o elevador para cima e para fora para remover o crânio, cobrindo cada hemisfério.</li>
	<li>Depois que o cérebro está completamente exposto, minar os nervos ópticos com uma espátula pequena. Remover o cérebro do crânio e colocá-lo em uma placa de Petri contendo continuamente oxigenado, frio ACSF-sacarose (ver tabela 1 para a concentração de sacarose).<ol>
<li>Se o tecido de ratos mais velhos é necessário, realize uma perfusão intracardíaca usando uma seringa (25G) preenchida com 20 mL de ACSF-sacarose gelada antes da extração do cérebro para obter fatias de boa qualidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare fatias hippocampal do cérebro animal extraído.<ol>
<li>Deixe o frio do cérebro de cerca de 2 min. Coloque um pedaço de papel de filtro em um prato de Petri cheia de gelo, transferir o cérebro para o papel de filtro. Disse os dois hemisférios.</li>
		<li>Cole os hemisférios dissecados (a orientação é determinada pelo objetivo experimental para obter fatias de coronal, horizontal ou transversal) em uma mesa de vibratome e mergulhá-lo na bandeja de vibratome preenchida com gelada oxigenado ACSF-sacarose. Fazer 300 µm fatias grossas a uma temperatura de cerca de 1 ° C, usando um vibratome refrigerador ou colocando o gelo ao redor da bandeja de vibratome.</li>
		<li>Usando um pincel de pintura lisa, acumular as fatias contendo o hipocampo (até 6 fatias por hemisfério) em um banho contendo oxigenado ACSF-recuperação aquecido a 37 ° C.</li>
		<li>Deixe as fatias no banho ACSF-recuperação pelo menos 45 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. células inteiras Patch-clamp gravações
<ol><li>Definir uma fatia hippocampal no lugar num banho posicionado no âmbito do objectivo (ampliação: 40x, abertura numérica: 0.8) de um microscópio de dois fotões de varredura a laser. Continuamente perfundir o banho com oxigenada Normal ACSF aquecido a 30-32 ° C a uma taxa de 2,5-3 mL/min.</li>
	<li>Use o contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) ou microscopia Dodt-SGC para localizar uma célula de interesse usando o seu tamanho, forma e posição. Nota: Dependendo da população alvo neurônio, um modelo do rato geneticamente modificado pode ser usado para localizar facilmente as células de interesse. Neste caso, esta etapa pode ser substituída com o uso de uma fonte de luz fluorescente.</li>
	<li>Encha uma pipeta de estimulação com uma solução de ACSF Normal contendo o fluoróforo vermelho (por exemplo, Alexa-594).</li>
	<li>Defina a pipeta de estimulação (conectada a uma unidade de estimulação elétrica) em cima da fatia, para que a ponta é na mesma região que a célula de interesse.</li>
	<li>Depois de encher a pipeta de remendo com solução de remendo e anexá-lo a um estágio de cabeça, configurá-lo sobre a fatia para que sua ponta está diretamente acima da célula de interesse.</li>
	<li>Caber uma seringa em uma torneira de três vias e conectá-lo ao remendo-pipeta através do tubo de plástico. Injetar constante pressão positiva dentro da pipeta de remendo (≈ 0,1 mL) utilizando a seringa. Manter a torneira na posição de "fechar".</li>
	<li>Ativar o módulo de software de controle do amplificador e alternar para o modo de tensão-braçadeira, clicando no botão "VC". Abra o software de aquisição de dados de eletrofisiologia (por exemplo, clampex) para aquisição de sinais eletrofisiológicos e clique no ícone do "Teste de membrana" para tê-lo continuamente enviar um pulso de tensão quadrada (5 mV, 10 ms), que é necessário para monitorar alterações na resistência a pipeta.</li>
	<li>Baixe a pipeta de remendo até que é bem em cima da célula alvo. Após fazer contato com a membrana celular, retire a pressão rodando a torneira na posição "aberta". Nota: O contato com a membrana celular é detectado quando um pequeno aumento na resistência a pipeta (≈ 0,2 MΩ) é visto e um pequeno recuo na célula é causado por pressão positiva.</li>
	<li>Exercendo uma ligeira pressão negativa para a pipeta de remendo usando uma seringa vazia encaixar a torneira até que a resistência de pipeta fornecida pelo software atinja 1 GΩ. Na janela 'Teste de membrana' do software de aquisição de dados, fixar a célula a -60 mV.</li>
	<li>Continue a aplicar a pressão negativa, até que a célula é aberta e a configuração de célula inteira é alcançada. Deteção deste estado de célula baseia-se se a mudança repentina da resistência de pipeta (a partir de 1 GΩ para MΩ 70-500, dependendo do tipo de interneurônio) e o aparecimento de grandes capacitivos transientes na janela 'Teste de membrana'.</li>
</ol>4. dois fotões Ca2 + imagens
<ol><li>Se estiver interessado nas respostas pós-sinápticos excitatórias, adicionar o gabazine de bloqueador do receptor de GABAA (10 µM) e o bloqueador do receptor GABAB CGP55845 (2 µM) no banho ACSF.</li>
	<li>No módulo de software de controle de amplificador, definir a configuração de remendo para corrente-braçadeira, clicando no botão "CC" e gravar o padrão de disparo da célula em resposta às injeções somáticas de despolarizar corrente (0.8-1.0 at, 1 s). Aguarde pelo menos 30 min para a célula a ser preenchido com os indicadores presentes na solução remendo. Nota: O padrão de queima e ativas Propriedades da célula podem ser usadas para identificar o subtipo da célula; por exemplo, células de rápido-cravação. É importante para a concentração do indicador estabilizar através da difusão antes de começar a gravar gatos (ver tabela 2 para solução de problemas).</li>
	<li>AP-evocada gatos<ol>
<li>Usando o software de aquisição de imagem, começa a aquisição de imagens. Localize um dendrito de interesse usando o sinal de fluorescência vermelha. Para garantir uma resposta visível, em primeiro lugar, escolha um dendrite proximal (≤ 50 µm) como a eficiência de retropropagação AP pode declinar significativamente com a distância em gabaérgica interneurônios22.</li>
		<li>Usando a ferramenta' retangular' do software de aquisição de imagem, zoom sobre a região de destino e mudar para o "xt" modo (linha). Posicione a verificação através do ramo dendrítica de interesse. Com os controladores de intensidade do laser do software de aquisição, definido o laser dois fotões em um nível mínimo de energia onde a fluorescência de base verde é apenas ligeiramente visível, para evitar a fototoxicidade.</li>
		<li>O eletrofisiologia dados software de aquisição de software de aquisição de imagem e a janela de 'Protocolo', crie um gravação de julgamento a duração desejada, contendo uma injeção atual somática da amplitude desejada.<ol>
<li>Usando o software de aquisição de imagem, clique no botão "Começar a gravar" e adquirir a fluorescência continuamente por 1-2 s. repetir a aquisição de imagem 3 - 10 vezes. Espere pelo menos 30 s entre as varreduras única para evitar Fotodano. Se adquirir a linescans em vários pontos ao longo de um dendrite, levá-los em ordem aleatória para evitar efeitos de ordem.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gatos synaptically evocada<ol>
<li>Localize um dendrito de interesse usando o sinal de fluorescência vermelha.</li>
		<li>Defina a pipeta de estimulação na superfície da fatia acima o dendrito de interesse. Abaixe lentamente a pipeta de estimulação no lugar, minimizando o movimento para evitar perturbar a configuração de células inteiras. Posição da pipeta em 10-15 µm do dendrito.</li>
		<li>Para visualizar a localização do microdomains sináptica em aspiny dendrites, do software de aquisição de imagem, mude para o 'xt' (linha) modo e posicionar a linha ao longo do ramo dendrítica de interesse.</li>
		<li>Na janela de 'Protocolo' (do software de aquisição de dados de eletrofisiologia) e software de aquisição de imagem, crie um julgamento de gravação que aciona a unidade de estimulação após o início do julgamento.</li>
		<li>Usando o software de aquisição, clique no botão "Começar a gravar" a varredura ao longo do dendrito continuamente para aquisição de repetição s. 1-2 3 - 5 vezes, esperando 30 s entre as varreduras para evitar Fotodano. Nota: O comprimento do scan pode ser ajustado dependendo da cinética do evento evocado, mas deve ser minimizado para evitar Fotodano (ver tabela 2 para solução de problemas).</li>
		<li>Repita a etapa 4.5.5 em condições diferentes (por exemplo, diferente intensidade/comprimento de estimulação, a introdução de um bloqueador farmacológico, etc) dependendo da pergunta específica a ser tratada.</li>
		<li>Impedir a aquisição quando a célula mostra sinais de deterioração da saúde: despolarização abaixo -45 mV, aumento da linha de base Ca2 + nível, deterioração morfológica de dendrites (por exemplo, blebbing, fragmentação; ver tabela 2 para solução de problemas).</li>
		<li>Para obter informações preliminares sobre a morfologia da célula e manter um registro da localização da pipeta estimulação, adquira uma Z -pilha da célula no canal vermelho. Usando o software de aquisição de 'xyz' modo, definir os limites superior e inferior da pilha para toda a célula de imagem com todos os processos incluídos. Definir o tamanho do passo do' ' em 1 µm e iniciar a aquisição de pilha usando o botão "Iniciar gravação".</li>
		<li>Quando o Z-aquisição de pilha está completa, use a opção de "Projeção máxima" no software para sobrepor todos os planos focais da pilha e verificar a qualidade da aquisição. Em seguida, retraia lentamente a pipeta de remendo fora a fatia.</li>
		<li>Para corrigir a fatia para identificação morfológica post hoc , rapidamente retirar a fatia do banho usando um pincel de pintura lisa e coloque-a entre dois papéis de filtro, em um prato de Petri ACSF-cheia. Substituir o ACSF com uma solução de paraformaldeído (PFA) 4% e deixe o prato em uma sala de 4 ° C ou a geladeira durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. imuno-histoquímica para Post Hoc identificação morfológica das células gravadas
Nota: Depois de 1 noite de fixação em PFA, a fatia pode ser armazenada em tampão fosfato (PB) com azida de sódio (0,5%) até 1 mês.
<ol><li>Coloque a fatia em tampão Tris solução salina (TBS) com Triton X-100 (0,3%) e executar 4 lavagens (5-10 min cada).</li>
	<li>Coloque a fatia na TBS-Triton 0,3% com 10% de soro de cabra normal (NGS) por 1h.</li>
	<li>Coloque a fatia na TBS-Triton 0,3% com 1% NGS e um fluoróforo estreptavidina conjugada (por exemplo, estreptavidina conjugada com Alexa Fluor 546, 1: 200) para incubação de noite.</li>
	<li>Lave 4 vezes (5-10 min) na TBS.</li>
	<li>Monte as fatias em corrediças do microscópio e imagem usando um microscópio confocal. Para ter uma reconstrução celular completa, adquirir um Z-pilha (passo tamanho: 1 µm) usando um objectivo de 20x. Para um rótulo de Alexa 546-conjugados de imagem, uso de um laser de 543 nm e uma detecção de nm 515-560 filtro definido.</li>
</ol>6. análise dos gatos
<ol><li>Extrair os valores de fluorescência, de regiões de interesse (ROIs) nas imagens de linha dos canais vermelhos e verdes e média os valores das várias repetições para cada condição reduzir o ruído. Nota: Quando a aquisição de linha é executada ao longo do dendrito, é possível extrair dados de ROIs múltiplos, que podem corresponder a microdomains dendríticas (2-5 µm), e assim permitindo o estudo de Ca2 + sinal compartimentação.</li>
	<li>Para cada ROI, expressa as mudanças de Ca2 + amplitude como: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> Nota: Aqui G é o valor de fluorescência do canal verde; G0 é o valor de fluorescência de base do canal verde durante o período de pré-estimulação; R é o valor de fluorescência do canal vermelho18. Como dois fotões excitação é altamente localizada e não gera um significativo fundo, subtração de fluorescência de fundo não é necessária.</li>
</ol>

<ol><li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li>
<li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+upmanship%3A+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li>
<li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li>
<li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li>
<li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li>
<li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li>
<li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li>
<li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li>
<li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2%2B+signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li>
<li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2%2B+signaling+in+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li>
<li>Camiré, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li>
<li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thespread+of+Na%2B+spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2%2B+entry+into+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li>
<li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+release+of+Ca2%2B+from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li>
<li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca%282%2B%29+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li>
<li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites%3A+contribution+of+Ca2%2B-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li>
<li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones%3A+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li>
<li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li>
<li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5(2004).</li>
<li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10777761">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li>
<li>Camiré, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/225093837_Functional_compartmentalisation_and_regulation_of_postsynaptic_Ca2_transients_in_inhibitory_interneurons">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li>
<li>Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+%28IS3%29+cells+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li>
<li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2%2B+signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li>
<li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li>
<li>Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons%3A+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259(2012).</li>
<li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+RevNeurosci%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li>
<li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li>
<li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+two-photon+uncaging%3A+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li>
<li>Salomé, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li>
<li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li>
</ol>

Os autores têm sem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

O método mostrado aqui demonstra como a combinação de dois fotões Ca2 + imagem e Eletrofisiologia do remendo-braçadeira pode ser usada para estudar dendríticas Ca2 + sinalização nos dendritos neuronais em fatias cerebral aguda. Esse método permite o monitoramento de ambos as locais Ca2 + elevações evocadas pela AP elétrica de estimulação ou backpropagating em segmentos dendríticas e resposta somática da célula. Isso torna uma excelente ferramenta para estudar como várias partes da árvore ...

A contribuição de um neurônio para atividade da rede é largamente determinada pela natureza dinâmica das entradas sinápticas que recebe. Tradicionalmente, o método predominante de caracterizar a atividade sináptica nos neurônios baseou-se em gravações somática célula inteira remendo-braçadeira de correntes pós-sinápticas evocadas pela estimulação elétrica de axônios de passagem. No entanto, única atividade de sinapses proximalmente localizadas com sinceridade é relatada neste caso1. Além disso, para avaliar os mecanismos específicos de sinapse, gravações de pares de neurônios e de dendrites num local específico têm sido utilizadas para atingir as sinapses de interesse e os mecanismos de integração dendrítica, respectivamente. Um grande avanço no campo da fisiologia sináptica foi alcançado através de um casamento de técnicas ópticas e eletrofisiológicos. Laser de excitação de dois fotões microscopia (2PLSM) em combinação com a imagem latente de Ca2 + e optogenetic ferramentas pode revelar detalhes tremenda da organização dinâmica da atividade sináptica em conexões neuronais específicas em fatias de cérebro em Vitro e na vivo.
Diversas vantagens feitas 2PLSM destacam-se a excitação convencional, um fóton microscopia2: (1) devido a uma natureza não-linear de dois fotões de excitação, a fluorescência é gerada apenas no volume focal, e todos os fótons emitidos representam sinais úteis (sem necessidade de pinhole); (2) comprimentos de onda, usados em 2PLSM, penetram o tecido de dispersão mais eficientemente; Além disso, dispersos fótons são demasiado diluídos para produzir a excitação de dois fotões e fluorescência de fundo; (3) Fotodano e fototoxicidade também são limitados ao plano focal. Portanto, apesar do alto custo dos sistemas 2-fóton em comparação com microscópios confocal convencionais, o 2PLSM continua a ser um método de escolha para investigação de alta resolução da estrutura neuronal e função em tecidos grossos.
A primeira aplicação de 2PLSM em tecido de dispersão foi a imagem da estrutura e função das espinhas dendríticas3. 2PLSM em combinação com Ca2 + imagem latente revelou essa função de espinhos como compartimentos isolados de bioquímicos. Uma vez que em muitos tipos de neurônios, há uma correspondência exacta entre espinhos e sinapses individuais4, dois fotões Ca2 + imagem logo tornou-se uma ferramenta útil, relatando a atividade de sinapses individuais em tecido intacto5, 6,7,8. Além disso, baseada em 2PLSM Ca2 + imagem foi usada com sucesso para monitorar a atividade de canais de cálcio único e as interações não-lineares entre os conductances intrínsecos e sinápticas, bem como para avaliar o estado e atividade-dependente Regulamento de Ca2 + sinalização neuronal dendrites5,6,7,8,9,10,11.
O cálcio é um onipresente segundo mensageiro intracelular, e sua organização spatiotemporal subcellular determina a direção de reações fisiológicas, alterações na força sináptica para a regulação do íon de canais, crescimento dos dentritos e espinha, como bem como morte celular e sobrevivência. Dendríticas Ca2 + elevações ocorrem através da ativação de várias vias. Potenciais de ação (APs), backpropagating para os dendritos, abrir canais de cálcio dependentes de voltagem12 e produzir relativamente globais transientes de Ca2 + (gatos) em dendritos e espinhos13. Transmissão sináptica é associada com a ativação de pós-sináptica Ca2 +-permeáveis receptores (NMDA, Ca2 +-permeável Leandro e agonista), desencadeando sináptica gatos6,14,15. Finalmente, supralinear Ca2 + eventos podem ser gerados em dendritos sob certas condições,11,12,13,16.
Emprega dois fotões Ca2 + imagem em combinação com gravações eletrofisiológicos remendo-braçadeira sintético Ca2 +-sensíveis indicadores fluorescentes, que normalmente são entregues através do eletrodo de remendo durante as gravações de células inteiras . Um método padrão para a quantificação da dinâmica de Ca2 + baseia-se o método de duplo indicador17,18. Ele usa dois fluorophores com espectros de emissão bem separados (por exemplo, uma combinação de um vermelho Ca2 +-tintura insensível com verde Ca2 + indicadores, tais como o Oregon Green BAPTA-1 ou Fluo-4) e tem várias vantagens quando comparado com o método do indicador único. Primeiro, uma Ca2 +-tintura insensível é usado para localizar pequenas estruturas de interesse (ramificações dendríticas e espinhos) onde Ca2 + imagem latente será executada. Em segundo lugar, a relação entre a mudança na fluorescência verde e vermelha (ΔG/R) é calculada como uma medida de [Ca2 +], que é em grande parte insensível às mudanças na fluorescência de base devido a flutuações no [Ca2 +]017 , 18. Além disso, as alterações de fluorescência podem ser calibradas em termos de absoluta Ca2 + concentrações.19.
Uma preocupação geral quando executando dois fotões Ca2 + imagem experimentos em fatias agudas é celular saúde e estabilidade da aquisição imagem devido ao poder do laser alta normalmente usado. Adicionalmente, em Ca2 + imagem as experiências, há preocupação com a perturbação e substancial superestimação da subcellular Ca2 + dinâmica devido ao fato de que indicadores de Ca2 + atuam como altamente móvel exógena Ca2 + buffers. Assim, a escolha do indicador de Ca2 + e sua concentração depende do tipo neuronal, a amplitude prevista de gatos e a questão experimental.
Adaptamos o método de dois fotões Ca2 + imagem para investigação de Ca2 + flutuações de dendrites de gabaérgica interneurônios9,10,11,20,21 , 22. enquanto a maior parte do Ca2 + imagem estudos iniciais foram feitos em neurônios principais, interneurônios inibitórios mostrar uma grande variedade de funcional Ca2 + mecanismos que são distintos daqueles em células piramidais20 , 23 , 24. estes mecanismos específicos de interneurônio (por exemplo, Ca2 + permeável Leandro receptores) podem desempenhar funções específicas na regulação da atividade das células. Enquanto dendríticas Ca2 + sinalização em interneurônios é um alvo tentador para maiores investigações, dois fotões Ca2 + imagem em dendritos dessas células apresenta desafios adicionais, de um diâmetro mais fino de dendrites e falta de espinhos para uma particularmente elevado Ca2 + ligação capacidade endógena. Como nossa pesquisa interessa foco no estudo dos interneurônios hippocampal, o seguinte protocolo, embora aplicáveis a diferentes populações neuronais, foi adaptado para lidar com esses desafios.
Este protocolo foi executado com um microscópio confocal comercial dois fotões, que foi equipado com dois detectores externos, não-descanned (NDDs), electro-ópticos modulador (Moe) e um Dodt digitalização contraste gradiente (SGC) e instalado em uma mesa de óptica. O microscópio foi acoplado com uma Ti:Sapphire do laser do multiphoton modo bloqueado a 800 nm (> 3 W, 140 pulsos fs, taxa de repetência de 80 Hz). O sistema da imagem latente foi equipado com uma plataforma padrão de eletrofisiologia, incluindo uma câmara de perfusão com controle de temperatura, uma plataforma de tradução com dois Micromanipuladores, um amplificador de microeletrodos controlado por computador, um digitador, um estímulo unidade e software de aquisição de dados.

<table><tbody><tr><td>Linhagem Animal: Camundongo CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 cloridrato</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído em pó, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato de potássio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Base Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma&nbsp;</td>Cloridrato de Trizma <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico di-hidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sódio monobásico monohidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td> Trifosfato de adenosina (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td> Guanosina (GTP)-Na+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td> Sal de fosfocreatina di(tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td> Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td> Patch Capilares de Vidro de Borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td> Theta Capilares de Vidro de Borosilicato</td><td>Instrumento Sutter</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td> P-97 Extrator de Micropipeta Flamejante/Marrom</td><td>Instrumento Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCS SP5 Microscópio Confocal Multifotônico</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chameleon Ultra II Ti:Laser multifotônico de safira&nbsp;</td><td>Software de</td> aquisição de imagens LAS AF coerente <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Controlador de temperatura Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amplificador MultiClamp 700B Molecular</td><td>Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digidata 1440A Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocal Tradutor</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> pClamp Software de Aquisição de Dados</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> A365 Isolador de Estímulo de Corrente Constante</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vibraplane Optical Table</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imagem de cálcio (Ca2 +) é uma poderosa ferramenta para investigar a dinâmica spatiotemporal de Ca2 + sinais intracelulares em dendritos neuronais. Flutuações de CA2 + podem ocorrer através de uma variedade de mecanismos intracelulares e membrana e desempenham um papel crucial na indução de plasticidade sináptica e regulação da excitabilidade dendrítica. Portanto, a capacidade de gravar diferentes tipos de Ca2 + sinais em ramificações dendríticas é valiosa para grupos estudando como dendrites integram informações. O advento da microscopia de dois fotões tenha facilitado tais estudos significativamente, resolvendo os problemas inerentes à imagem latente no tecido vivo, tais como a dispersão da luz e Fotodano. Além disso, através da combinação de técnicas eletrofisiológicas convencionais com dois fotões Ca2 + imagem, é possível investigar o local Ca2 + flutuações nos dendritos neuronais em paralelo com as gravações de atividade sináptica em soma. Aqui, descrevemos como usar esse método para estudar a dinâmica do locais transientes de Ca2 + (gatos) em dendritos de interneurônios inibitórios gabaérgica. O método pode ser aplicado também ao estudo dendríticas Ca2 + sinalização em diferentes tipos neuronais em fatias cerebral aguda.

Usando o protocolo aqui apresentado, obtivemos gatos evocados por injeção atual somática e por estimulação elétrica em dendritos de oriens/alveus interneurônios na área CA1 do hipocampo. Depois de remendar um neurônio, identificado com base em sua forma e posição, adquirimos linescans através de um dendrite proximal em vários pontos no dado as distâncias do soma (figura 1A). Observamos uma diminuição da amplitude dos gatos induzido por backpropagating APs com...

Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

O objetivo geral deste experimento é estudar elevações de cálcio em dendritos neuronais em resposta a diferentes paradigmas de estimulação usando registros de patch-clamp de células inteiras no soma neuronal em paralelo com imagens de cálcio de dois fótons em dendritos. Este método pode ser empregado para monitorar a sinalização de cálcio em pequenos compartimentos dendríticos, permitindo uma observação cuidadosa dos processos que ocorrem nos ramos dendríticos durante a integração de entradas sinápticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os padrões de sinalização de cálcio sejam observados em alta resolução e especificidade espaço-temporal.Coloque o cérebro do camundongo em uma placa de Petri contendo ACSF-sacarose fria e continuamente oxigenada. Para preparar fatias de hipocampo do cérebro extraído, deixe o cérebro esfriar por cerca de dois minutos. Depois, coloque um pedaço de papel de filtro em uma placa de Petri cheia de gelo e transfira o cérebro para o papel de filtro.Em seguida, disseque o cérebro em dois hemisférios. Cole os hemisférios dissecados em uma plataforma de corte de vibratomo e mergulhe-a na bandeja de corte cheia de sacarose ACSF oxigeada gelada. Posteriormente, corte fatias de 300 micrômetros de espessura a um grau Celsius usando um resfriador de vibratomo ou colocando o gelo ao redor da bandeja de vibratomo.Usando um pincel, transfira as fatias contendo o hipocampo para um banho de recuperação de ACSF oxigenado aquecido a 37 graus Celsius. Nesta etapa, transfira uma fatia do hipocampo para um banho sob a objetiva de um microscópio de dois fótons de varredura a laser. Perfundir continuamente o banho com ACSF-normal oxigenado.Em seguida, use a microscopia de contraste de interferência diferencial infravermelha para localizar uma célula de interesse usando seu tamanho, forma e posição. Depois disso, encha uma pipeta estimulante com uma solução normal ACSF contendo o fluoróforo vermelho. Abaixe-o em cima da fatia para que a ponta fique na mesma região da célula de interesse.Em seguida, encha a pipeta de remendo com solução de remendo e conecte-a ao estágio principal. Coloque-o sobre a fatia de forma que sua ponta fique diretamente acima da célula de interesse. Em seguida, encaixe uma seringa na torneira de três vias e conecte-a à pipeta de remendo através de um tubo de plástico.Injete pressão positiva constante na pipeta de remendo e mantenha a torneira na posição fechada. Em seguida, abra o MultiClamp módulo de software de controle do amplificador e mude para o modo Voltage Clamp clicando no botão VC. Abra o software de aquisição de dados Clampex de eletrofisiologia para registrar sinais eletrofisiológicos e clique no ícone Teste de membrana para enviar um pulso de tensão quadrada constante para monitorar as mudanças na resistência da pipeta.Agora, abaixe a pipeta de adesivo até que esteja bem em cima da célula alvo. Ao entrar em contato com a membrana celular, remova a pressão girando a torneira para a posição aberta. Em seguida, aplique uma leve pressão negativa na pipeta de remendo usando uma seringa vazia encaixada na torneira até que a resistência da pipeta atinja um gigaohm.Na janela Teste de membrana do software de aquisição de dados, clamp a célula em 60 milivolts negativos. Continue aplicando pressão negativa até que a resistência da pipeta caia e a configuração de toda a célula seja alcançada. No módulo de software de controle do amplificador MultiClamp, defina a configuração do patch para o grampo de corrente clicando no botão IC e registre as propriedades da membrana em resposta a injeções somáticas de correntes hiperpolarizantes e despolarizantes.Aguarde pelo menos 30 minutos para que a célula seja preenchida com os indicadores presentes na solução do adesivo. Para adquirir imagens, localize um dendrito de interesse usando o sinal de fluorescência vermelho. Garanta uma resposta visível escolhendo um dendrito proximal menor que 50 micrômetros, pois a eficiência da retropropagação do AP pode diminuir significativamente com a distância nos interneurônios GABAérgicos e mudar para o modo xt.Com os controladores de intensidade do laser, defina o laser de dois fótons em um nível de potência mínimo onde a fluorescência verde da linha de base seja apenas ligeiramente visível, para evitar fototoxicidade. Posteriormente, na janela de protocolo do software de aquisição de dados de eletrofisiologia Clampex e no software de aquisição de imagem, crie um teste de gravação da duração desejada contendo uma injeção de corrente somática da amplitude desejada. Depois disso, clique no botão Iniciar gravação e adquira a fluorescência continuamente por um a dois segundos.Repita a aquisição da imagem de três a 10 vezes. Aguarde pelo menos 30 segundos entre as varreduras únicas para evitar fotodanos. Para registrar transientes de cálcio dendrítico induzidos por estimulação elétrica, localize um dendrito de interesse usando o sinal de fluorescência vermelho.Coloque a pipeta estimulante na superfície da fatia acima do dendrito de interesse. Abaixe lentamente a pipeta de estimulação de 10 a 15 micrômetros do dendrito, minimizando o movimento para evitar perturbar a configuração de toda a célula. Para visualizar a localização dos microdomínios sinápticos em neurônios espinhosos, no software de aquisição de imagem, mude para o modo xt e posicione a linha ao longo do ramo dendrítico de interesse.Na janela Protocolo, crie uma tentativa de gravação que acione a estimulação. Usando o software de aquisição, escaneie ao longo do dendrito continuamente por um a dois segundos. Repita a aquisição de três a cinco vezes, aguardando 30 segundos entre as varreduras para evitar fotodanos.Para obter informações preliminares sobre a morfologia da célula e manter um registro da localização da pipeta de estimulação, adquira uma pilha Z da célula no canal vermelho. Usando o software de aquisição no modo xyz, defina os limites superior e inferior da pilha para criar imagens de toda a célula com todos os processos incluídos. Em seguida, defina o tamanho do passo em um micrômetro e inicie a aquisição da pilha usando o botão Iniciar registro.Quando a aquisição da pilha Z estiver concluída, use a opção Projeção máxima no software para sobrepor todos os planos focais da pilha e verificar a qualidade da aquisição. Em seguida, retraia lentamente a pipeta de remendo para fora da fatia. Para fixar a fatia para identificação morfológica post hoc, remova rapidamente a fatia do banho usando um pincel e coloque-a entre dois papéis de filtro em uma placa de Petri cheia de ACSF.Substitua o ACSF por uma solução de paraformaldeído a 4% e deixe o prato a quatro graus Celsius durante a noite. Nesta figura, a projeção máxima de uma pilha Z de dois fótons mostra um interneurônio corrigido preenchido com Alexa-594. As pontas das setas brancas apontam para a localização dos terminais axonais dentro da camada piramidal, sugerindo que o interneurônio é uma célula em cesta.Esta figura mostra o ramo dendrítico próximo ao qual o eletrodo estimulante foi posicionado. A linha tracejada mostra a localização da varredura de linha. As imagens aqui ilustram o resultado de uma varredura de linha nos canais vermelho e verde.O aumento da fluorescência verde no momento da estimulação indica um aumento na concentração de cálcio nessa área. As imagens podem ser agrupadas em segmentos menores, permitindo a análise da propagação da resposta. Os traços vistos aqui mostram os transientes de cálcio provocados em diferentes segmentos em resposta à estimulação elétrica registrada no nível somático durante o teste de imagem.A amplitude dos transientes de cálcio diminui com a distância do hotspot central, indicando que a resposta está espacialmente localizada. Após este procedimento, outros métodos, como imagens de corantes sensíveis à voltagem ou optogenética, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como mudanças locais no potencial de memória dentro de ramos dendríticos ou integração de entradas específicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como monitorar as flutuações de cálcio dependentes da atividade em dendritos neuronais usando uma combinação de técnicas optofisiológicas, que serão úteis para explorar os meandros da integração e plasticidade da entrada dendrítica.

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

Atividade espontânea de desenvolvimento de redes neuronais podem ser medidos utilizando-AM éster formas de corantes de cálcio sensível indicador. Alterações de cálcio intracelular, o que indica a ativação neuronal, são detectados como alterações transitórias na fluorescência indicador com um ou dois fótons de imagem. Este protocolo pode ser adaptada para uma série de developmentally dependentes de redes...

Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

Neste protocolo, atualizar o progresso recente na imagem...

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Uma técnica de imagem para monitoramento de mudanças potenciais de membrana com sub-micrômetro espacial e sub-milissegundo resolução temporal é descrito. A técnica, com base na excitação do laser de corantes sensíveis à voltagem, permite a medição de sinais em axónios e colaterais, ramos terminais axonais e dendríticas individuais espinhas dendriticas.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Este vídeo demonstra um protocolo para registro de patch-clamp de células inteiras e imagens de cálcio de dois fótons em fatias do hipocampo cerebral. Este método permite estudar a dinâmica de transientes locais de Ca2+ (CaTs) em dendritos de diferentes tipos neuronais em fatias cerebrais agudas.

Estabelecendo uma configuração de célula inteira para imagens de cálcio de dois fótons de fatias cerebrais

Os procedimentos são descritos para realizar registros simultâneos do potencial ou corrente de membrana e alterações da concentração de cálcio intracelular. Os neurônios do núcleo supraquiasmático são preenchidos com o indicador de cálcio bis-fura-2 usando um eletrodo de patch clamp na configuração de patch clamp de célula inteira.

Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

A imagem de lapso de tempo no animal vivo fornece informações valiosas sobre a reorganização estrutural no cérebro intacto. Aqui, apresentamos uma preparação de crânio afinado que permite imagens transcranianas de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongo vivo por microscopia de dois fótons.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Aprenda a registrar transientes de cálcio em dendritos neuronais usando imagem de dois fotões combinada com patch-clamp de célula inteira em fatias agudas de hipocampo de camundongo. Este método oferece alta resolução espaçotemporal para estudar a integração sináptica e a plasticidade dendrítica.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

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