Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

O objetivo geral deste experimento é estudar elevações de cálcio em dendritos neuronais em resposta a diferentes paradigmas de estimulação usando registros de patch-clamp de células inteiras no soma neuronal em paralelo com imagens de cálcio de dois fótons em dendritos. Este método pode ser empregado para monitorar a sinalização de cálcio em pequenos compartimentos dendríticos, permitindo uma observação cuidadosa dos processos que ocorrem nos ramos dendríticos durante a integração de entradas sinápticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os padrões de sinalização de cálcio sejam observados em alta resolução e especificidade espaço-temporal.

Coloque o cérebro do camundongo em uma placa de Petri contendo ACSF-sacarose fria e continuamente oxigenada. Para preparar fatias de hipocampo do cérebro extraído, deixe o cérebro esfriar por cerca de dois minutos. Depois, coloque um pedaço de papel de filtro em uma placa de Petri cheia de gelo e transfira o cérebro para o papel de filtro.

Em seguida, disseque o cérebro em dois hemisférios. Cole os hemisférios dissecados em uma plataforma de corte de vibratomo e mergulhe-a na bandeja de corte cheia de sacarose ACSF oxigeada gelada. Posteriormente, corte fatias de 300 micrômetros de espessura a um grau Celsius usando um resfriador de vibratomo ou colocando o gelo ao redor da bandeja de vibratomo.

Usando um pincel, transfira as fatias contendo o hipocampo para um banho de recuperação de ACSF oxigenado aquecido a 37 graus Celsius. Nesta etapa, transfira uma fatia do hipocampo para um banho sob a objetiva de um microscópio de dois fótons de varredura a laser. Perfundir continuamente o banho com ACSF-normal oxigenado.

Em seguida, use a microscopia de contraste de interferência diferencial infravermelha para localizar uma célula de interesse usando seu tamanho, forma e posição. Depois disso, encha uma pipeta estimulante com uma solução normal ACSF contendo o fluoróforo vermelho. Abaixe-o em cima da fatia para que a ponta fique na mesma região da célula de interesse.

Em seguida, encha a pipeta de remendo com solução de remendo e conecte-a ao estágio principal. Coloque-o sobre a fatia de forma que sua ponta fique diretamente acima da célula de interesse. Em seguida, encaixe uma seringa na torneira de três vias e conecte-a à pipeta de remendo através de um tubo de plástico.

Injete pressão positiva constante na pipeta de remendo e mantenha a torneira na posição fechada. Em seguida, abra o MultiClamp módulo de software de controle do amplificador e mude para o modo Voltage Clamp clicando no botão VC. Abra o software de aquisição de dados Clampex de eletrofisiologia para registrar sinais eletrofisiológicos e clique no ícone Teste de membrana para enviar um pulso de tensão quadrada constante para monitorar as mudanças na resistência da pipeta.

Agora, abaixe a pipeta de adesivo até que esteja bem em cima da célula alvo. Ao entrar em contato com a membrana celular, remova a pressão girando a torneira para a posição aberta. Em seguida, aplique uma leve pressão negativa na pipeta de remendo usando uma seringa vazia encaixada na torneira até que a resistência da pipeta atinja um gigaohm.

Na janela Teste de membrana do software de aquisição de dados, clamp a célula em 60 milivolts negativos. Continue aplicando pressão negativa até que a resistência da pipeta caia e a configuração de toda a célula seja alcançada. No módulo de software de controle do amplificador MultiClamp, defina a configuração do patch para o grampo de corrente clicando no botão IC e registre as propriedades da membrana em resposta a injeções somáticas de correntes hiperpolarizantes e despolarizantes.

Aguarde pelo menos 30 minutos para que a célula seja preenchida com os indicadores presentes na solução do adesivo. Para adquirir imagens, localize um dendrito de interesse usando o sinal de fluorescência vermelho. Garanta uma resposta visível escolhendo um dendrito proximal menor que 50 micrômetros, pois a eficiência da retropropagação do AP pode diminuir significativamente com a distância nos interneurônios GABAérgicos e mudar para o modo xt.

Com os controladores de intensidade do laser, defina o laser de dois fótons em um nível de potência mínimo onde a fluorescência verde da linha de base seja apenas ligeiramente visível, para evitar fototoxicidade. Posteriormente, na janela de protocolo do software de aquisição de dados de eletrofisiologia Clampex e no software de aquisição de imagem, crie um teste de gravação da duração desejada contendo uma injeção de corrente somática da amplitude desejada. Depois disso, clique no botão Iniciar gravação e adquira a fluorescência continuamente por um a dois segundos.

Repita a aquisição da imagem de três a 10 vezes. Aguarde pelo menos 30 segundos entre as varreduras únicas para evitar fotodanos. Para registrar transientes de cálcio dendrítico induzidos por estimulação elétrica, localize um dendrito de interesse usando o sinal de fluorescência vermelho.

Coloque a pipeta estimulante na superfície da fatia acima do dendrito de interesse. Abaixe lentamente a pipeta de estimulação de 10 a 15 micrômetros do dendrito, minimizando o movimento para evitar perturbar a configuração de toda a célula. Para visualizar a localização dos microdomínios sinápticos em neurônios espinhosos, no software de aquisição de imagem, mude para o modo xt e posicione a linha ao longo do ramo dendrítico de interesse.

Na janela Protocolo, crie uma tentativa de gravação que acione a estimulação. Usando o software de aquisição, escaneie ao longo do dendrito continuamente por um a dois segundos. Repita a aquisição de três a cinco vezes, aguardando 30 segundos entre as varreduras para evitar fotodanos.

Para obter informações preliminares sobre a morfologia da célula e manter um registro da localização da pipeta de estimulação, adquira uma pilha Z da célula no canal vermelho. Usando o software de aquisição no modo xyz, defina os limites superior e inferior da pilha para criar imagens de toda a célula com todos os processos incluídos. Em seguida, defina o tamanho do passo em um micrômetro e inicie a aquisição da pilha usando o botão Iniciar registro.

Quando a aquisição da pilha Z estiver concluída, use a opção Projeção máxima no software para sobrepor todos os planos focais da pilha e verificar a qualidade da aquisição. Em seguida, retraia lentamente a pipeta de remendo para fora da fatia. Para fixar a fatia para identificação morfológica post hoc, remova rapidamente a fatia do banho usando um pincel e coloque-a entre dois papéis de filtro em uma placa de Petri cheia de ACSF.

Substitua o ACSF por uma solução de paraformaldeído a 4% e deixe o prato a quatro graus Celsius durante a noite. Nesta figura, a projeção máxima de uma pilha Z de dois fótons mostra um interneurônio corrigido preenchido com Alexa-594. As pontas das setas brancas apontam para a localização dos terminais axonais dentro da camada piramidal, sugerindo que o interneurônio é uma célula em cesta.

Esta figura mostra o ramo dendrítico próximo ao qual o eletrodo estimulante foi posicionado. A linha tracejada mostra a localização da varredura de linha. As imagens aqui ilustram o resultado de uma varredura de linha nos canais vermelho e verde.

O aumento da fluorescência verde no momento da estimulação indica um aumento na concentração de cálcio nessa área. As imagens podem ser agrupadas em segmentos menores, permitindo a análise da propagação da resposta. Os traços vistos aqui mostram os transientes de cálcio provocados em diferentes segmentos em resposta à estimulação elétrica registrada no nível somático durante o teste de imagem.

A amplitude dos transientes de cálcio diminui com a distância do hotspot central, indicando que a resposta está espacialmente localizada. Após este procedimento, outros métodos, como imagens de corantes sensíveis à voltagem ou optogenética, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como mudanças locais no potencial de memória dentro de ramos dendríticos ou integração de entradas específicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como monitorar as flutuações de cálcio dependentes da atividade em dendritos neuronais usando uma combinação de técnicas optofisiológicas, que serão úteis para explorar os meandros da integração e plasticidade da entrada dendrítica.