Detecção altamente sensível e quantitativa de proteínas e suas isoformas pelo método isoeléctrica capilar

Isoeléctrica capilar é uma técnica baseada em anticorpos, ultra-sensível, alta taxa de transferência, permitindo a caracterização detalhada de proteínas e suas isoformas das amostras biológicas extremamente pequenas. A seguir descreve um protocolo para a detecção e quantificação de proteínas específicas e suas isoformas de forma automatizada e robotizada.

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da pesquisa biomédica, como descoberta de biomarcadores, descoberta de medicamentos, diagnósticos e triagem de drogas ou anticorpos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é de alto rendimento e pode detectar isoformas proteicos de forma altamente reprodutível. As implicações dessa técnica se estendem para o diagnóstico de muitas doenças, pois pode medir proteínas afetadas ou suas isoformas.

Embora este método possa fornecer informações sobre caminhos de sinalização celular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas onde proteínas específicas precisam ser analisadas. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de ensaio são difíceis de aprender por causa dos truques, como remover bolhas, carregar a placa, etc. Primeiro, prepare uma mistura diluída amostra, adicionando um microliter de mistura inibidora de DMSO e dois microliters de inibidores de protease a 47 microliters de diluentes amostrais diluídos, de modo que a concentração final de inibidores de DMSO e protease seja um X.Diluir os lises proteicos anteriormente isolados usando a mistura diluidora da amostra para obter as concentrações desejadas.

Em seguida, adicione 3.325 microliters de escada padrão, seis microliters de inibidor de protease, e três microliters de inibidor DMSO a 137.675 microliters de antolito pré-luz. Vórtice a amostra pelo menos 15 segundos e manter no gelo. Misture as duas soluções preparadas em uma proporção de um a três para que as concentrações finais dos inibidores de protease DMSO e da escada padrão de ponto isoelétrico sejam de um X e as proteínas no capilar atinjam as concentrações finais desejadas.

Depois que as proteínas forem adicionadas à mistura de amostras, todas as etapas serão realizadas no gelo ou a quatro graus Celsius. Coloque uma placa de 384 poços no gelo. Carregue dez microliters da amostra se misture no poço apropriado da placa, de acordo com o layout do modelo de ensaio projetado com o software automatizado do sistema de manchas ocidentais.

Na sequência, dilui os anticorpos primários e secundários com anticorpos diluídos. Em seguida, pipeta dez microliters de anticorpos primários e 15 microliters de anticorpos secundários em cada poço. Em seguida, misture o XDR de luminol e peróxido em uma proporção de um para um.

Pipeta 15 microliters da mistura de peróxido de luminol em cada poço. Uma vez que as amostras e reagants tenham sido adicionados à placa, centrífuga por dez minutos a 2500 vezes G e quatro graus Celsius para girar o líquido e remover as bolhas. Se ainda existirem bolhas, remova-as manualmente usando uma ponta fina de pipeta.

Abra o software automatizado do sistema de manchas ocidentais e clique em novo'do menu de arquivos. Vá para o painel de layout e atribua locais para reagants e amostras na placa de 384 poços. Faça uma tarefa reagant clicando em um poço em qualquer lugar do bloco.

Selecione um bloco de linha de 12 poços cada. Em seguida, vá para a barra de ferramentas do painel de layout e insira um bloco de linha de amostra, primário, secundário ou luminol. Vá para o painel de protocolo e selecione um local reagant na placa.

Em seguida, clique na célula na coluna de amostra e selecione o reagant no menu suspenso. Da mesma forma, selecione os locais reagant para o principal, secundário e luminol para cada ciclo. Clique nas células uma de cada vez na coluna de anticorpos primários ou secundários e altere os tempos de incubação, se necessário.

Em seguida, adicione ciclos clicando no botão Adicionar na seção protocolo. No painel de modelos, insira informações relativas à amostra, como a identidade dos anticorpos primários e secundários, seus números de catálogo e diluições. Salve o novo arquivo de ensaio.

Antes de clicar no botão iniciar, verifique rapidamente o layout para ter certeza de que tudo está correto. Agora, clique em iniciar a corrida. O software solicitará ao usuário que remova os resíduos, reabastegue a água e a caixa capilar, adicione anolite e católito à bandeja de recursos, adicione o buffer de lavagem e carregue a placa na bandeja de amostra resfriada.

Uma barra de status do instrumento será exibida na tela do computador alguns minutos após o início da execução. Clique na tela de resumo de execução para ver o status e os painéis de separação. Para observar a separação da eletroforese em um capilar, reprodute o filme de separação para esse capilar clicando no ciclo desejado e, em seguida, clicando no botão de reprodução no painel de controle.

Abra o arquivo de execução e selecione a guia de tela de análise. Clique em editar'e, em seguida, análise'para alterar o intervalo de pontos isoelétricos. Aplique o padrão de ponto isoelétrico apropriado.

Adicione um ajuste de pico e adicione um nome de pico. Finalmente, selecione os dados para usar na guia picos e exporte os dados para análise suplementar. O eletroferograma de cinesases extracelulares extracelulares fosforilaladas de lises estimuladas pelo fator de crescimento endotelial vascular é mostrado aqui.

Há uma indução muito alta de proteínas fosfoiladas observadas com fator de crescimento endotelial vascular. O inset mostra o controle de carregamento endógeno, HSP 70, indicando carregamento semelhante de amostras para amostras não tratadas e tratadas. Em um imunoblot convencional, apenas duas bandas foram detectadas, embora as proteínas de quinase extracelular reguladas por sinal fosforilado tenham sido resolvidas em quatro picos pela análise isoelétrica capilar.

O eletroferograma de quinases extracelulares reguladas por sinal de lises estimuladas pelo fator de crescimento endotelial vascular é mostrado aqui. O inset mostra o mesmo controle de carregamento usado em paralelo. Um imunoblot convencional mostra apenas duas bandas correspondentes à quinase extracelular regulada por sinal e quinase extracelular regulada por sinal dois.

Considerando que com o foco isoelétrico capilar, as proteínas de quinase extracelular reguladas pelo sinal foram resolvidas em seis picos, correspondendo a todos os quatro picos fosfoilados diferentes e dois picos não fosfoilados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em poucas horas, dependendo do número de ciclos, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar concentrações de anticorpos mais altas em comparação com os imunoblots convencionais.

A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de ensaio são difíceis de aprender por causa de truques, como remover bolhas, carregar a placa, etc. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar um ensaio, preparar amostras, executar o ensaio e analisar os dados para observar diferentes isoformas de sua proteína.