Medida quantitativa da proteína precursora amiloide γ-Secretase-mediada e clivagem de entalhe em plataformas de ensaio baseada em célula Luciferase Reporter

O objetivo geral deste ensaio quantitativo de gene repórter baseado em células para gama-secretase é examinar o efeito diferencial de moduladores putativos de gama-secretase na clivagem mediada por gama-secretase. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo da doença de Alzheimer, como a identificação de novos moduladores da gama-secretase para o tratamento da doença de Alzheimer. A vantagem dessa técnica é que ela é um sistema de ensaio altamente eficiente e pode identificar facilmente moduladores de gama-secretase.

A implicação dessa técnica se estende à terapia da doença de Alzheimer por meio da descoberta potencial de drogas anti-AD com efeitos colaterais mínimos. Este método pode fornecer informações sobre a seletividade do substrato da gama-secretase. Também pode ser aplicado aos estudos de outras doenças, como o neuroblastoma.

Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades com a remoção cuidadosa e adição de meios de cultura de células a 96 microplacas, pois muita perturbação pode complicar os resultados finais. Comece este procedimento com a preparação das células NG e CG, conforme referenciado no protocolo de texto. Conte as células NG ou CG com um hemocitômetro.

Em seguida, semeie as células a 20.000 células por poço em microplacas de 96 poços a um volume final de 200 microlitros por poço em meio de crescimento. Transfira as microplacas para uma incubadora de dióxido de carbono umidificado e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação durante a noite, remova 100 microlitros de meio de crescimento de cada poço.

Adicione 100 microlitros por poço de meio de crescimento contendo dois microgramas por mililitro de tetraciclina com 0,2% de dimetilsulfóxido, dois CL-387 micromolares, 785, dois DAPT micromolares ou outros inibidores de ErbB1 / ErbB2 relacionados. Incube as células tratadas e as microplacas a 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, remova 150 microlitros por poço de meio de crescimento das microplacas.

Em seguida, adicione 50 microlitros por poço de reagente de ensaio de luciferase. Em seguida, transfira as microplacas para um leitor de microplacas de luminescência e mantenha-as em temperatura ambiente por cinco minutos. Determine a luminescência emitida pela luciferase do vaga-lume usando um programa predefinido armazenado no leitor de microplacas de luminescência.

Primeiro, abra o software de controle do instrumento. Em seguida, no menu Ferramenta, selecione Luminometria. Na configuração Parâmetros, escolha Sem filtro para filtro de emissão, marque Normal para abertura de emissão, insira um para contagem de tempo e clique em OK para configurar a leitura de luminescência.

Na guia Controle do instrumento, percorra a lista de protocolos ativos e selecione o protocolo pré-armazenado para leitura de luminescência. Na guia Exibição em tempo real, defina a escala no menu suspenso e selecione Logaritmo ou Linear para o tipo. Na guia Temperatura, selecione Desligado para aquecimento da placa.

Por fim, clique no botão Iniciar para realizar a leitura de luminescência. Exporte os resultados para um formato de planilha usando o Explorer incorporado ao software de controle. Estimar a luminescência de fundo de células CG ou NG tratadas com meio de crescimento que não inclui tetraciclina.

Defina um sinal de luminescência emitido por células CG ou NG tratadas com 0,1% de DMSO em meio de crescimento contendo um micrograma por mililitro de tetraciclina sozinho como 100% de atividade relativa da gama-secretase. Finalmente, normalize os sinais de luciferase de células CG ou NG que são cultivadas com meio de crescimento contendo tetraciclina e CL-387, 785 ou DAPT para o sinal de luciferase emitido por células CG ou NG tratadas com DMSO. Aqui são mostrados resultados representativos que demonstram as medições quantitativas da clivagem da gama-secretase de APP-C99 nas células CG.

As células foram tratadas com um micromolar de CL-387, 785 ou DAPT na presença de um micrograma por mililitro de tetraciclina a 37 graus Celsius por 24 horas. A luminescência derivada da proteólise mediada por gama-secretase de C99-GV foi quantificada após a adição de 100 microlitros por poço de reagente de ensaio de luciferase. O sinal de luciferase emitido pelas células tratadas apenas com veículo foi definido como 100% de luminescência relativa.

Resultados representativos que demonstram as medições quantitativas da clivagem da gama-secretase de N-delta-E nas células NG são mostrados aqui. Da mesma forma, as células foram tratadas com um micromolar de CL-387, 785 ou DAPT na presença de um micrograma por mililitro de tetraciclina a 37 graus Celsius por 24 horas. A luminescência derivada da proteólise mediada por gama-secretase de N-delta-E-GV foi quantificada após a adição de 100 microlitros por poço de reagente de ensaio de luciferase.

O sinal de luciferase emitido pelas células tratadas apenas com veículo foi definido como 100% de luminescência relativa. Uma vez dominada, essa técnica requer apenas um tempo prático de uma a duas horas, dependendo do número de compostos a serem examinados. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o pesquisador no campo da doença de Alzheimer explorar o modificador genético e químico da gama-secretase em busca de novas terapias para a doença de Alzheimer.