Name: Medida quantitativa da proteína precursora amiloide γ-Secretase-mediada e clivagem de entalhe em plataformas de ensaio baseada em célula Luciferase Reporter (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a quantificar a atividade da γ-secretase em ensaios baseados em células com repórter de luciferase. Este método permite identificar moduladores da γ-secretase para pesquisa da doença de Alzheimer.

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Os autores graças a facilidade do núcleo do Instituto de celular e biologia organísmica, Academia Sinica, apoio técnico. Este estudo foi suportado pelo Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan (mais-103-2320-B-001-016-MY3 para Y.-F. L.), o programa de inovação translacional de Biofarmacêutica desenvolvimento – tecnologia de apoio a plataforma eixo regime (NP7 para Y.-F.L.) e Academia Sinica (para Y.-F.L.).

1. medição de sinais de repórter de Luciferase, que correspondem a clivagem de γ-Secretase de APP-C99 ou NΔE
Nota: Consulte as publicações anteriores para obter descrições detalhadas da geração de CG e NG células20,21.
<ol><li>
Semente de células NG ou CG (20, 000 células/poço) para microplacas de 96 poços em um volume final de 200 μL/poço no meio de crescimento que é composto modificado águia médio (DMEM) acrescido de 10% bovina soro fetal de Dulbecco (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 antibiótico μg/mL (por exemplo, zeocin) e 200 μg/mL hptII B.
	<ol>
<li>Contar as células com um hemocytometer.</li>
		<li>Transferir as microplacas para uma incubadora de2 CO umidificada e incubar a 37 ° C durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova 100 μL de média de crescimento de cada poço.</li>
	<li>Adicionar 100 μL/poço do crescimento médio contendo 2 tetraciclina μg/mL com ou 0,2% dimetilsulfóxido (DMSO), 2 μM CL-387.785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-aguarráz (DAPT) ou outros relacionados ErbB1/ErbB2 inibidores.</li>
	<li>Incube células tratadas CG ou NG em microplacas a 37 ° C por 24 h.</li>
	<li>Remova o meio de crescimento μL/poço de 150 de microplacas.</li>
	<li>Adicionar 50 μL/poço do luciferase ensaio reagente (veja Tabela de materiais).</li>
	<li>
Transferi as microplacas para um leitor de microplacas de luminescência.
	<ol>
<li>Manter as microplacas à temperatura ambiente por 5 min com agitação suave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinar o luciferase de vaga-lume (FL)-emitida usando um programa pré-definido armazenado no leitor de microplacas de luminescência de luminescência.
	<ol>
<li>Abra o software de controle de instrumento (ver Tabela de materiais para obter detalhes do instrumento).</li>
		<li>No menu 'Ferramentas', selecione 'Luminometry'.<ol>
<li>Sob as configurações de 'Parâmetros', não escolha 'Nenhum filtro' para emissão de filtro, carrapato 'Normal' para abertura de emissão, digite '1' para contagem de tempo e clique em 'Okey' para configurar a leitura de luminescência.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Na guia 'Instrumento de controle', percorra a lista de protocolos de ativos e selecione o protocolo previamente armazenado para a leitura de luminescência.</li>
		<li>Sob a aba "Exibição de viver", definir a dimensão da lista suspensa e selecione 'Logaritmo' ou 'Linear' para o tipo.</li>
		<li>Na guia 'Temperatura', selecione 'Off' para o aquecimento da placa.</li>
		<li>Clique no botão 'Iniciar' para executar a leitura de luminescência.</li>
		<li>Conforme necessário, exporte os resultados em um formato de planilha usando o 'Explorer' incorporado dentro do software de controle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. a quantificação da atividade de γ-Secretase
<ol><li>
Defina um sinal de luminescência emitida pelo CG ou células NG tratadas com 0,1% DMSO em meio de cultura contendo 1 tetraciclina μg/mL como 100% relativo γ-secretase atividade sozinha.
	<ol>
<li>Estimar a luminescência de fundo de células CG ou NG, tratando as células com o meio de crescimento que não inclui tetraciclina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalizar os sinais do luciferase de CG ou NG células que são cultivadas com meio de cultura contendo 1 tetraciclina μg/mL e qualquer 1 μM CL-387.785 ou 1 μM de DAPT com o sinal do luciferase emitido por CG tratados com DMSO ou NG células (atividade de γ-secretase relativa de 100%, como definido em 2.1).</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease+at+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li>
<li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/18/3157">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li>
<li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer%27s+disease%3A+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li>
<li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+strategies+for+disease+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li>
<li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer%27s+disease%3A+regulation%2C+cell+biology%2C+function%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li>
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<li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18548070">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li>
<li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li>
<li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li>
<li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li>
<li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li>
<li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+substrates+of+presenilin%2Fgamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li>
<li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163%2C+a+Potent%2C+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li>
<li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+%28GSI-953%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li>
<li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15(2008).</li>
<li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).</li>
<li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+small+molecular+%28D%29-leucinamides+as+potent%2C+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li>
<li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha%2C+interleukin-1beta%2C+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li>
<li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li>
<li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li>
<li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li>
<li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li>
<li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li>
<li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer%27s+Disease+Patients%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os resultados promissores de um fase 1b ensaio de aducanumab imunoterapia para AD estabeleceram firmemente o papel crítico de Aβ na patogênese da AD22 e sugerem que abordagens anti-Aβ ainda são uma estratégia viável para o desenvolvimento de drogas antianúncios. Aqui, descrevemos ensaios cell-based, para quantificar a proteólise γ-secretase-catalisada de APP-C99 e NΔE usando sistemas de repórter de luciferase de vaga-lume. APP-C99 e NΔE são os dois substratos de γ-secretase mais bem estudados e ju...

Oligoméricas formas de amiloide-β (Aβ) são acreditadas para ser a causa primária de neurodegeneração nos cérebros de pacientes que sofrem de doença de Alzheimer (AD)1. Peptídeos aβ são produzidos pela gradual clivagem da proteína precursora amiloide (APP), primeiro por β-secretase e depois por γ-secretase2. Na década passada, abordagens terapêuticas para o tratamento da AD têm-se centrado na prevenção da produção de Aβ3. A maioria dos estudos focaram-se também o aumento da atividade de α-secretase, que pode impede a clivagem de γ-secretase de APP e, assim, diminuir a produção de Aβ, ou a inibição da β-e/ou γ-secretase atividades4. Infelizmente, não-seletivo da inibição da β ou γ-secretases resultados em inevitáveis efeitos colaterais que são devido à interferência com o funcionamento de outros substratos fisiológicos de β e γ-secretase5,6. No que se refere a inibidores de γ-secretase, estudos recentes relataram a descoberta de um número de moduladores químicos e genéticos que podem regular a produção de Aβ enquanto exercer efeitos insignificantes sobre o tratamento de γ-secretase-mediada essencial de entalhe7 ,8,9,10,11,12, no entanto, terapêutica bem sucedida ainda não foram desenvolvidas. Assim, ainda mais sistemáticas telas são garantidas para descobrir novos modificadores de genéticas e químicas que podem seletivamente modular γ-secretase-mediada processamento de APP.
Γ-Secretase é conhecido para cravar mais de 90 diferentes proteínas de membrana-ancorado. Entre estes substratos é entalhe, cuja actividade é fundamental para a determinação do destino de célula e diferenciação durante desenvolvimento13. Seletivamente a modular γ-secretase-catalisada APP processamento na ausência de afectar o entalhe processamento será essencial para minimizar efeitos colaterais relacionados com entalhe de γ-secretase-inibidores, e esta seletividade é pensada para ser um fator principal que será dite a eficácia biológica de moduladores de γ-secretase potenciais para o tratamento crônico da AD. Tem havido um número de derivados de arylsulfonamide, tais como o GSI-953 (begacestat) e BMS-708163 (avagacestat), que foram encontrados para exibem inibição potente e seletiva de γ-secretase14,15. Um estudo anterior demonstrou que a inibição diferencial de γ-secretase clivagem da APP e entalhe pode ser observada usando um ensaio quantitativo ELISA-baseado em combinação com validação no vivo usando zebrafish16. Além disso, foram estabelecidas paradigmas baseada em célula de ensaio para abordar a potencial seletividade de substrato de γ-secretase em direção a APP e o entalhe de17,18. Usando protocolos semelhantes as descritas neste documento, nós descobrimos recentemente uma nova classe de (D)-leucinamides que potente modular γ-secretase clivagem da APP com entalhe poupadores seletividade19. Juntos, esta coleção de estudos fornece um prova de conceito a noção de que a seletividade/disponibilidade de substrato de γ-secretase podem estar sujeitas a modulação química e verificação experimental de apoio. No entanto, essas plataformas de ensaio muitas vezes dependem de relativamente baixa produtividade leituras e abordagens de trabalho intensivos que não podem cumprir padrões industriais para programas de descoberta de drogas.
Nós recentemente geraram ensaios de gene do repórter do luciferase baseada em célula que quantitativamente podem determinar a atividade catalítica de γ-secretase em direção a dois substratos distintos, 99-amino ácido fragmento C-terminal da APP (APP-C99) e o extracelular domínio-excluído peptídeo Notch (NΔE). Tanto APP-C99 e NΔE foram amplamente utilizados como substratos diretos de γ-secretase em vários ensaios. Para gerar ensaios de gene repórter do luciferase homogênea e consistente para a clivagem de γ-secretase de APP-C99 ou NΔE, geramos uma linha de HEK-derivado de célula estável (CG) que constitutivamente expressa um Gal4 vagalume orientada por promotor do luciferase repórter ( Gal4-Luc) e a proteína de fusão Gal4/VP16-com a tag APP-C99 (C99-GV). Além disso, geramos uma outra linha de HEK-derivado de célula estável (NG) que constitutivamente expressa Gal4-Luc e NΔE Gal4/VP16-marcados (NΔE-GV). Usando estes ensaios romance substrato específico γ-secretase, agora oferecemos um método para quantificar e distinguir a atividade catalítica de γ-secretase em direção a diferentes substratos (APP-C99 em células CG), ou NΔE em células de NG. Além disso, os substrato específico γ-secretase ensaios foram projetados para ser propício para plataformas de triagem de alto teor. Estes ensaios γ-secretase recém-gerado poderiam pavimentar o caminho para a descoberta de moduladores de γ-secretase romance que poderia melhorar a função cognitiva, suprimindo a produção de Aβ sem suscitar indesejável inibição de entalhe para o tratamento de última geração do anúncio.

<table><tbody><tr><td>Leitor de placas de luminescência VictorLight</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0010</td><td></td></tr><tr><td>Classe II, Tipo 2 Gabinete de Segurança Biológica</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Série A2</td><td></td></tr><tr><td>CL-387,785</td><td>EMD Calbiochem</td><td>233100-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Merck</td><td>565770</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12100046</td><td>principal componente do meio de crescimento</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytomer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Microplaca de 96 poços BR717805 Aldrich</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nunc</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de ensaio de luciferase Steady-Glo</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Revco</td><td>Ultima II</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular T-REx293</td><td>Invitrogen</td><td>R71007</td><td></td></tr><tr><td>Wallac 1420 software versão 3.0</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>software de controle de instrumento do leitor de microplacas de luminescência</td></tr></tbody></table>

medida quantitativa da proteína precursora amiloide γ-secretase-mediada e clivagem de entalhe em plataformas de ensaio baseada em célula luciferase reporter

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Nós desenvolvemos um par de ensaios de gene repórter baseada em célula para medir quantitativamente a clivagem de γ-secretase de substratos distintos. Este manuscrito descreve procedimentos que podem ser usados para monitorar a clivagem γ-secretase-mediada de APP-C99 ou entalhe, utilizando um sistema de repórter Gal4 vagalume orientada por promotor do luciferase. Estes ensaios foram estabelecidos por estàvel co transfecting células HEK293 com o gene do repórter do luciferase orientado a Gal4 e o fragmento de Gal4/VP16-marcados C-terminal da APP (APP-C99; Células CG), ou a Gal4/VP16-tag entalhe-ΔE (NΔE; Células de NG). Usando estes ensaios de repórter em paralelo, temos demonstrado que um inibidor ErbB2, CL-387.785, preferencialmente pode suprimir a clivagem de γ-secretase de APP-C99 em células CG, mas não NΔE em células de NG. As diferenciais respostas exibidas pelas células CG e NG, quando tratados com CL-387.785, representam uma característica preferencial para moduladores de γ-secretase, e essas respostas estão em contraste com a pan-inibição de γ-secretase induzido por DAPT. Nossos estudos fornecem a evidência direta que γ-secretase atividades em direção a diferentes substratos podem ser diferenciadas em um contexto celular. Estes novos ensaios, podem ser ferramentas úteis na descoberta da droga melhorada das terapias AD.

Inibição de ErbB2 pelo CL-387.785 diferencialmente pode promover o processamento de APP-C99 por Γ -secretase sem afetar a clivagem do entalhe Para estabelecer um ensaio baseados em células que quantitativamente pode medir a clivagem proteolítica de um substrato específico γ-secretase, geramos a linhagem de células HEK293-derivado CG por transfection co estável de uma tetraciclina-inducible C-terminal Gal4/VP16-tag APP-C99 e um gene rep...

Estamos com sucesso geraram dois ensaios de substrato específico γ-secretase. Ambos os ensaios cell-based aqui apresentados destinam-se para quantificar o γ-secretase actividades enzimáticas através da saída de repórteres de luciferase de vaga-lume.

Medida quantitativa da proteína precursora amiloide γ-Secretase-mediada e clivagem de entalhe em plataformas de ensaio baseada em célula Luciferase Reporter

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

O objetivo geral deste ensaio quantitativo de gene repórter baseado em células para gama-secretase é examinar o efeito diferencial de moduladores putativos de gama-secretase na clivagem mediada por gama-secretase. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo da doença de Alzheimer, como a identificação de novos moduladores da gama-secretase para o tratamento da doença de Alzheimer. A vantagem dessa técnica é que ela é um sistema de ensaio altamente eficiente e pode identificar facilmente moduladores de gama-secretase.A implicação dessa técnica se estende à terapia da doença de Alzheimer por meio da descoberta potencial de drogas anti-AD com efeitos colaterais mínimos. Este método pode fornecer informações sobre a seletividade do substrato da gama-secretase. Também pode ser aplicado aos estudos de outras doenças, como o neuroblastoma.Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades com a remoção cuidadosa e adição de meios de cultura de células a 96 microplacas, pois muita perturbação pode complicar os resultados finais. Comece este procedimento com a preparação das células NG e CG, conforme referenciado no protocolo de texto. Conte as células NG ou CG com um hemocitômetro.Em seguida, semeie as células a 20.000 células por poço em microplacas de 96 poços a um volume final de 200 microlitros por poço em meio de crescimento. Transfira as microplacas para uma incubadora de dióxido de carbono umidificado e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação durante a noite, remova 100 microlitros de meio de crescimento de cada poço.Adicione 100 microlitros por poço de meio de crescimento contendo dois microgramas por mililitro de tetraciclina com 0,2% de dimetilsulfóxido, dois CL-387 micromolares, 785, dois DAPT micromolares ou outros inibidores de ErbB1 / ErbB2 relacionados. Incube as células tratadas e as microplacas a 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, remova 150 microlitros por poço de meio de crescimento das microplacas.Em seguida, adicione 50 microlitros por poço de reagente de ensaio de luciferase. Em seguida, transfira as microplacas para um leitor de microplacas de luminescência e mantenha-as em temperatura ambiente por cinco minutos. Determine a luminescência emitida pela luciferase do vaga-lume usando um programa predefinido armazenado no leitor de microplacas de luminescência.Primeiro, abra o software de controle do instrumento. Em seguida, no menu Ferramenta, selecione Luminometria. Na configuração Parâmetros, escolha Sem filtro para filtro de emissão, marque Normal para abertura de emissão, insira um para contagem de tempo e clique em OK para configurar a leitura de luminescência.Na guia Controle do instrumento, percorra a lista de protocolos ativos e selecione o protocolo pré-armazenado para leitura de luminescência. Na guia Exibição em tempo real, defina a escala no menu suspenso e selecione Logaritmo ou Linear para o tipo. Na guia Temperatura, selecione Desligado para aquecimento da placa.Por fim, clique no botão Iniciar para realizar a leitura de luminescência. Exporte os resultados para um formato de planilha usando o Explorer incorporado ao software de controle. Estimar a luminescência de fundo de células CG ou NG tratadas com meio de crescimento que não inclui tetraciclina.Defina um sinal de luminescência emitido por células CG ou NG tratadas com 0,1% de DMSO em meio de crescimento contendo um micrograma por mililitro de tetraciclina sozinho como 100% de atividade relativa da gama-secretase. Finalmente, normalize os sinais de luciferase de células CG ou NG que são cultivadas com meio de crescimento contendo tetraciclina e CL-387, 785 ou DAPT para o sinal de luciferase emitido por células CG ou NG tratadas com DMSO. Aqui são mostrados resultados representativos que demonstram as medições quantitativas da clivagem da gama-secretase de APP-C99 nas células CG.As células foram tratadas com um micromolar de CL-387, 785 ou DAPT na presença de um micrograma por mililitro de tetraciclina a 37 graus Celsius por 24 horas. A luminescência derivada da proteólise mediada por gama-secretase de C99-GV foi quantificada após a adição de 100 microlitros por poço de reagente de ensaio de luciferase. O sinal de luciferase emitido pelas células tratadas apenas com veículo foi definido como 100% de luminescência relativa.Resultados representativos que demonstram as medições quantitativas da clivagem da gama-secretase de N-delta-E nas células NG são mostrados aqui. Da mesma forma, as células foram tratadas com um micromolar de CL-387, 785 ou DAPT na presença de um micrograma por mililitro de tetraciclina a 37 graus Celsius por 24 horas. A luminescência derivada da proteólise mediada por gama-secretase de N-delta-E-GV foi quantificada após a adição de 100 microlitros por poço de reagente de ensaio de luciferase.O sinal de luciferase emitido pelas células tratadas apenas com veículo foi definido como 100% de luminescência relativa. Uma vez dominada, essa técnica requer apenas um tempo prático de uma a duas horas, dependendo do número de compostos a serem examinados. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o pesquisador no campo da doença de Alzheimer explorar o modificador genético e químico da gama-secretase em busca de novas terapias para a doença de Alzheimer.

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Este vídeo demonstra o procedimento de medição da atividade da γ-secretase em células humanas geneticamente modificadas usando um sistema induzível por tetraciclina. O processo envolve a indução da expressão do gene APP com tetraciclina, geração de peptídeos β amilóide e ativação da produção de luciferase. A bioluminescência resultante da reação luciferase-substrato é então medida, refletindo a atividade da γ-secretase.

Ensaio de luciferase para medir a atividade da γ-secretase em células humanas

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

A transferência de célula para célula de agregados proteicos, ou sementes proteopáticas, pode estar subjacente à progressão da patologia em doenças neurodegenerativas. Aqui, é descrito um novo ensaio de citometria de fluxo FRET que permite a detecção específica e sensível da atividade de semeadura de amostras recombinantes ou biológicas.

Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

Este relatório descreve protocolos para medir as taxas de degradação de proteínas mal dobradas por ensaios baseados em western blot ou fluorescência. Os métodos podem ser aplicados à análise de outras proteínas mal dobradas e para triagem de alto rendimento.

Os ensaios para a degradação de proteínas em células deformadas

Nós descrevemos um método para quantificar a agregação de misfolded proteínas. Nossos detalhes de protocolo Lentivirus induzida por geração de linha celular estável, imagem latente confocal automatizada e análise de imagens de agregados de proteínas. Como uma aplicação ilustrativa, estudamos o efeito de pequenas moléculas na promoção da SOD1 agregação de maneira tempo e dose-dependente.

Desenvolvimento de ensaio para quantificação de conteúdo elevado de Sod1 proteína mutante formação agregada em células vivas

Há uma demanda para fazer pré-clínicos de teste para uma novela classe de drogas "órfão" chamado acompanhantes farmacológicos podem ser reproduzidos, rápido e eficiente. Desenvolvemos um ensaio de baseado em cultura celular altamente padronizado, simples e versátil para tela para pacientes elegíveis, bem como drogas de romance acompanhante farmacológica.

In Vitro Enzima de medição para teste farmacológico acompanhante receptividade em Fabry e a doença de Pompe

Imagem molecular com laser assistida por matriz baseada em ionização/dessorção de imagem espectrometria de massa (MALDI-IMS) permite o mapeamento simultâneo de vários analitos em amostras biológicas. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e visualização da proteína β amiloide nos tecidos do cérebro de doença de Alzheimer e amostras de Angiopatia amiloide cerebral usando MALDI-IMS.

Visualização dos depósitos β amiloide no cérebro humano com Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de imagem espectrometria de massa

Este protocolo apresenta um método para avaliar a atividade proteolítica de uma protease de baixa atividade intrinsecamente, único volume de negócios em um contexto celular. Especificamente, esse método é aplicado para avaliar a atividade proteolítica de PCSK9, um motor essencial do metabolismo lipídico, cuja atividade proteolítica é necessária para sua função final hipercolesterolêmicos.

Um ensaio de Luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de PCSK9 a Protease Single-volume de negócios

Este protocolo descreve como executar rápidos ensaios de luciferase de baixo custo em média taxa de transferência usando uma luciferase de Gaussia ligada à insulina como um proxy para a secreção de insulina de células beta. O ensaio pode ser realizado com a maioria dos leitores de placas de luminescência e pipetas multicanal.

Medindo a secreção relativa de insulina usando um substituto de luciferase co-secretado

Este protocolo explica como medir o efeito da variação genética associada a distúrbios do neurodesenvolvimento na atividade da enzima desubiquitilante, combinando a purificação de proteínas recombinantes com ensaios de clivagem da cadeia de ubiquitina.

Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro

Aqui, descrevemos um sistema de levedura reconstituindo a γ-secretase humana. Este sistema permite a identificação e o estudo de mutações que afetam a atividade e a triagem de inibidores da γ-secretase (GSIs). Utilizando as propriedades de perda de função dos mutantes familiares da doença de Alzheimer, é possível rastrear moduladores de γ-secretase (GSMs).

Saccharomyces cerevisiae Modelos da doença de Alzheimer para rastrear genes, mutações e produtos químicos que afetam a produção de beta-amilóide pela γ-secretase

Aprenda a quantificar a atividade da γ-secretase em ensaios baseados em células com repórter de luciferase. Este método permite identificar moduladores da γ-secretase para pesquisa da doença de Alzheimer.

Medida quantitativa da proteína precursora amiloide γ-Secretase-mediada e clivagem de entalhe em plataformas de ensaio baseada em célula Luciferase Reporter (Vídeo) | JoVE Journal

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