Name: Deteção e quantificação de Plasmodium falciparum em aquosa glóbulos vermelhos por atenuadas Total reflexão espectroscopia de infravermelho e análise de dados multivariada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda a detectar e quantificar Plasmodium falciparum em glóbulos vermelhos usando espectroscopia ATR-FTIR e análise multivariada. Este método portátil e de baixo custo acelera o diagnóstico da malária em pontos de atendimento.

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Financiamento para os autores foi fornecido pelo Conselho australiano de pesquisa (futuro Fellowship FT120100926 a BRW), nacional de saúde e médico pesquisa Conselho da Austrália (programa grant e bolsa de pesquisa sênior para JGB; Bolsas de carreira precoce JSR; Infraestrutura para pesquisa institutos de concessão de regime de apoio ao Instituto Burnet), e a infra-estrutura operacional de governo de Victorian estado apoiar Grant ao Instituto de Burnet. Reconhecemos o Sr. Finlay Shanks para apoio instrumental.

Por favor, consultar apropriado folhas de dados de segurança Material (MSDS) e buscam a formação adequada do nível de biossegurança 2 (BSL-2). Todas as etapas de cultivo devem ser feitas em um gabinete de BSL-2 usando uma técnica asséptica, ou seja, há um risco de exposição à radiação UV prejudicial de medidas de descontaminação, ferimentos de agulha e exposição potencial biológica e infecção, se a cultura de parasita entra em todos os ferimentos. Além disso, o sangue das ações de bancos de sangue é somente selecionados para certas doenças e o potencial de propagação de doenças de sangue é um risco potencial. Procure ajuda médica imediata na ocorrência de lesões.
1. preparação e medição de 7 3 séries de diluições de parasita Plasmodium falciparum
Nota: Plasmodium SP. cultura é altamente sensível. Usar reagentes frescos/prescrita e alimentar os parasitas regularmente, alterando os meios de comunicação. Alimentar as culturas abaixo de 5% parasitemia cada segundo dia; alimentação de culturas entre 6-10% parasitemia uma ou duas vezes por dia; e alimentar de culturas entre 11-20% até 4 vezes por dia. Parasitas que estão começando a passar fome perderá sua forma e começam a se contrair. Nesse caso, alimentar e diluir imediatamente alterando os meios de comunicação e adicionar estoque RBCs. coletar o sangue do doador em tubos de colheita de sangue contendo heparina como anticoagulante e medida dentro as primeiras 6 horas.
<ol><li>Cultura um total de 30 mL de 3-7 estirpe parasitas Plasmodium falciparum de acordo com o protocolo padrão até a parasitemia atinge 10% anéis.</li>
	<li>
Sincronização de parasitas
	<ol>
<li>11 h após shizogeny no ciclo de vida do parasita, Ressuspender a cultura e transferir para um tubo cônico de 50 mL com uma pipeta automática.</li>
		<li>Centrifugar a cultura de 300 – 400 x g e condições padrão de laboratório (25° C e 100 kPa) por 5 min.</li>
		<li>Retire o sobrenadante por desenhá-lo com uma pipeta ou com uma pipeta Pasteur anexada a um vácuo sem perturbar o sedimento. Descarte resíduos de mídia em uma solução 10%.</li>
		<li>Lentamente, adicionar 12 – 15 mL de solução a 4% sorbitol ao pellet usando uma pipeta automática e misturar a cultura por tampando e inversão do tubo até que a cultura é homogênea.</li>
		<li>Incube a cultura a 37 ° C por 15 min.</li>
		<li>Centrifugar a cultura de 300 – 400 x g e condições padrão de laboratório por 5 min.</li>
		<li>Remova o sobrenadante conforme descrito na etapa 1.2.3.</li>
		<li>Adicionar 10 a 15 mL de soro fisiológico a 0,9% para a pelota e misturar a solução por tampando e inversão do tubo até que a cultura é homogênea.</li>
		<li>Repita as etapas 1.2.6–1.2.8 mais duas vezes para lavar todos os vestígios de sorbitol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da série de diluição de parasitemia
	<ol>
<li>Lave o estoque RBCs como em passos 1.2.6–1.2.9.</li>
		<li>Centrifugar a cultura em condições de laboratório padrão, estoque hemácias em 300 – 400 x g durante 5 min e descartar o sobrenadante como na etapa 1.2.3.</li>
		<li>Rotular microcentrifuga tubos como 0%, 0,010%, 0,025%, 0.075%, 0,100%, 0,250%, 0.750% e 1.000% e adicionar 0 µ l, 1 µ l, 2,5 µ l, 7,5 µ l, 10 µ l, 25 µ l, 75 µ l e 100 µ l de cultura respectivamente, usando uma pipeta de µ l de 0.2-20.</li>
		<li>Adicione 100 µ l µ l 99, 97,5 µ l, 92,5 µ l, 80 µ l, 75 µ l, 0 e 25 µ l de estoque hemácias ao tubos rotulados 0%, 0,010%, 0,025%, 0.075%, 0,100%, 0,250%, 0.750% e 1.000%, respectivamente.</li>
		<li>Centrifugue o fresco dador de sangue colhida em tubos anticoagulantes em 1.200 x g e condições padrão de laboratório para 10 min.</li>
		<li>Remova o plasma por desenhá-lo com uma pipeta e descartando conforme descrito na etapa 1.2.3.</li>
		<li>Adicionar 900 µ l de hemácias isoladas em cada tubo microcentrifuga e homogeneizar por inversão x 10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aquisição de espectral
	<ol>
<li>Usando o programa de aquisição espectral que acompanha, clique em "Configuração do instrumento" e definir os parâmetros de coleta de dados para o seguinte: 128 varreduras para plano de fundo; 32 varreduras para amostra; e resolução de 8/cm sobre o intervalo de amostra máxima do instrumento.</li>
		<li>Regule a temperatura do espectrómetro ATR-FTIR por recomendação do fabricante ou durante a noite.</li>
		<li>Limpe o cristal esfregando suavemente em movimentos circulares usando algodão livre lenços umedecido com água ultrapura. Em seguida, seque cuidadosamente usando outra limpeza livre de fiapos.</li>
		<li>Tome uma medida de fundo do ar, clicando em "Medição de fundo". Cada 20 min, limpe o cristal como na etapa 1.4.3 e repita essa medição.</li>
		<li>Abra a visualização ao vivo clicando em "Visualizar". Observe uma linha de base plana, horizontal que indica que o cristal está limpo.</li>
		<li>Pipete 10 µ l de água desionizada directamente para o meio do cristal e clique em "Amostra de medida". Repita esta medição de água após cada amostra quinta.</li>
		<li>Seque o cristal usando uma limpeza livre de fiapos e suaves movimentos circulares.</li>
		<li>Pipete 10 µ l de amostra e clique em "Amostra de medida".</li>
		<li>Limpe o cristal entre as amostras como na etapa 1.4.3.</li>
		<li>Repita até 3 repetições são adquiridas, certificando-se de embaralhar a ordem de ambas as amostras e as repetições.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. análise de dados multivariada (MVDA)
Nota: Tratamento de dados deve ser feito ao longo de todo o conjunto de dados a fim de evitar o ruído e a adição de picos de origem não biológica. Em contraste, analisar sobre as regiões biologicamente relevantes: 2980-2800/cm e 1750-850/cm.
<ol><li>
Tratamento de dados Nota: Dois software, por exemplo, Matlab (doravante referido como software 1) e The Unscrambler X (doravante referido como software 2) são utilizados como exemplos para MVDA. 1 o software tem a capacidade de executar MVDA sem a adição de uma interface de usuário gráfica (GUI). No entanto, é aconselhável comprar um GUI (Tabela de materiais). As instruções a seguir quando se referindo ao software 1 assumirá que é em conjunto com a caixa de ferramentas GUI disponível comercialmente, e o script de tratamento de dados de exemplo foi anexado.<ol>
<li>Abra o software de análise de dados multivariada apropriado, clique em "Importar dados" e selecione o tipo de arquivo para análise.<ol>
<li>Em software 1, entrada "Análise" na janela de comando para abrir o GUI. Botão direito do mouse na caixa de X para encontrar "Importar dados".</li>
			<li>Em 2 de software, clique na guia "Arquivo" para encontrar a "Importação".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Importar os espectros de amostra, a água e a linha de base como conjuntos de dados na área de trabalho selecionando todos os espectros em cada conjunto separadamente e clicando em "Abrir" e dar a cada conjunto um nome curto, por exemplo, 'wat' para conjunto de dados de espectros de água.</li>
		<li>Selecione a nova tabela/matriz, clicando em "nova matriz/vetor" e gerar um vetor n × 1, onde n é o número de amostras. A parasitemia de cada amostra de entrada e dê o vetor o nome 'Parasitemia'.<ol>
<li>Em software 1, clique em "Nova variável" na janela de comando.</li>
			<li>Em 2 de software, clique no ícone "Nova matriz".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plotar os dados clicando no "plotar dados ícone". Inspecione os espectros para efeitos de vapor de água clicando em "Zoom" e zoom em 1800-1400/cm; mais claramente observado como picos curtos, afiados, estreitos ao longo das encostas de Amida eu e Amida bandas II.</li>
		<li>Em casos extremo de vapor de água, abra a guia Editar/pre-process de dados e selecione "Smoothing". Reduzir o ruído e/ou contribuições de vapor de água forte, alisando os espectros de amostra e água usando até 25 pontos de suavização ou usar um método de correção de vapor de água.</li>
		<li>Correta não horizontais linha de base usando o algoritmo de correção de base, se for o caso, sob a guia de edição/pre-process dados mesmo na etapa 2.1.4.</li>
		<li>Média água espectros e copie as linhas em uma matriz de m × n equivalente para o conjunto de dados de amostra e reduzi-la a intensidade de 70%, multiplicando-o por 0,7.<ol>
<li>Em software 1, fazê-lo na janela de comando inserindo o seguinte script "AverageWater=mean(WaterDataset)". Em seguida, copiar e colar as linhas para coincidir com o conjunto de dados de amostra. Para reduzir a intensidade, a entrada "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Subtrai os espectros de água média de cada espectro da amostra.<ol>
<li>Em software 1, fazê-lo na janela de comando inserindo o seguinte script "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Abra a guia Editar/pre-process dados para aplicar uma segunda função de derivativos e em seguida normalizar os dados, selecionando a função única normal variada (SNV) e dados do centro.<ol>
<li>Em software 1, fazê-lo de uma só vez. Primeiro, selecione "Derivativos" e entrados 25 pontos de suavização, ordem polinomial de 3 e derivado ordem na amostra definida usando uma função de Savitzky-Golay e 25 pontos de suavização. Em seguida, selecione "SNV" e "Quer dizer centro". Clique em "Okey/aplicar".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Abra a guia Editar/pre-process de dados e na "Coluna variáveis", selecione 2.980 – 2.800/cm e 1.750 – 850/cm, certificando-se que apenas suas caixas estão marcadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de dados
	<ol>
<li>Análise de componentes principais (PCA)<ol>
<li>Clique em "análise | Decomposição"e selecione PCA.<ol>
<li>Em 1 de software, clique em "Construir o modelo".</li>
				<li>Em software 2, os PCA métodos de entrada. -No presente trabalho, 7 - o número ideal de componentes principais (PCs) de entrada e um máximo de 100 iterações e selecione a validação cruzada para o método de validação. Clique em "Executar".</li>
			</ol>
</li>
			<li>Observe o limite de confiança de 95%, o anel tracejado, sobre a trama de escores entre PC1 e PC2.</li>
			<li>Marca os espectros de amostra com pontuações que ocorrem fora do limite como outliers potenciais usando a "ferramenta de espectros selecione".</li>
			<li>Se os espectros marcados tem alto Hotellings T2 valores e altos resíduos Q excluem-los de uma análise mais aprofundada.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Regressão de mínimos quadrados parciais (PLS-R)<ol>
<li>Clique em "análise | Regressão"e selecione"PLS-R".<ol>
<li>Em software 1, clique direito Y bloco e selecione o vetor "Parasitemia | Construa o modelo".</li>
				<li>Em software 2, os PLS-R métodos de entrada. Selecione o vetor "Parasitemia" como a referência de"Y" e o conjunto de dados de amostra como "X conjunto dados" e selecione a validação cruzada como o método de validação. Clique em "Executar".</li>
			</ol>
</li>
			<li>Analise o modelo de regressão. Valores de2 R acima de 0,80 e raiz quadrada erro de validação cruzada (RMSECV) valores de menos de 0,1% parasitemia são modelos aceitáveis.</li>
			<li>Analisar o vetor de regressão e identificar as bandas biológicas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Topley_Wilson_s_Microbiology_and_Microbi.html?id=vs_3lgEACAAJ">Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology</a>. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).</li>
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<li>Rogers, W. Chapter 105. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRogers%2C+W+%22Manual+of+Clinical+Microbiology%22">Manual of Clinical Microbiology</a>. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. , American Society for Microbioogy, USA. 1355(1999).</li>
<li>White, N. J. Chapter 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+NJ+%22Manson%27s+Tropical+Infectious+Diseases%22">Manson's Tropical Infectious Diseases</a>. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).</li>
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<li>Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank+and+limit+of+detection+of+Plasmodium+falciparum+thick+blood+smear+microscopy+in+a+routine+setting+in+Central+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa.</a> Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).</li>
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<li>Khoshmanesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+early-stage+malaria+parasites+in+laboratory+infected+erythrocytes+by+attenuated+total+reflectance+infrared+spectroscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis.</a> Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).</li>
<li>Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+common+anticoagulants+in+detection+and+quantification+of+malaria+parasitemia+in+human+red+blood+cells+by+ATR-FTIR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal%22%5BJournal%5D)">The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy.</a> Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).</li>
<li>Fabian, H., Mäntele, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFabian%2C+H+%22Handbook+of+Vibrational+Spectroscopy%22">Handbook of Vibrational Spectroscopy</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).</li>
<li>Whelan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscoptMonitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy.</a> Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).</li>
<li>Wood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+hydration+and+DNA+conformation+in+interpreting+infrared+spectra+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues.</a> Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).</li>
<li>Plyler, E. K. <a target="_blank" href="http://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/jres/048/jresv48n4p281_A1b.pdf">Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol.</a> J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

PLS-R modelo é um método multivariado supervisionado que encontra uma relação linear, Y = bX + E, entre as variáveis preditivas X (aqui, a absorvância a cada número de onda) e uma variável Y contínua (aqui, o nível de parasitemia). Em suma, o modelo combina as variáveis em X para criar um novo conjunto de variáveis latentes (LVs) que captam a variação no X correlacionada com Y e calcula um vetor de regressão (b) que multiplicado por um novo resulta de espectro na estimativa do valor y. A força do modelo pode ser tomada a...

Malária está entre as doenças mais devastadoras do nosso tempo; mais de metade da população vive em risco em regiões endêmicas e encargos desproporcionalmente o pobre1,2,3,4. Uma grande parte da questão é a portadores assintomáticos e primeiros pacientes de palco que atuam como reservatórios para mosquitos vetores5, causando picos de infecção durante a época chuvosa e permitindo que persistem nas comunidades. A malária é causada por parasitas de Plasmodium cinco, é o mais mortal do que por p. falciparum , que faz com que a forma mais grave da doença2.
Atualmente, técnicas para o diagnóstico da malária são menos do que perfeito. Microscopia óptica, o atual padrão-ouro, pode somente detectar parasitas 62-88 / µ l dependendo do método usado6. Além disso, devido à intensidade e alta habilidade necessária, em muitas regiões microscopia diagnósticos errados > 50% dos casos, especialmente aqueles com baixa parasitemia níveis2, que pode ser directamente atribuída à falta de recursos na área e resultados em o uso indevido de drogas contra a malária. Outros 2 principais métodos de diagnóstico são testes de diagnóstico rápido (RDTs), que utilizam anticorpos para a detecção e ensaios de reação em cadeia da polimerase (PCR), que discriminam e quantificar parasitas de DNA. Atualmente, o RDTs só são capazes de detectar por p. falciparum e p. vivax de pelo menos 100 parasitas / µ l de sangue, resultando em formas mais raras da doença a ser tratada. 7 , 8 em contraste, os ensaios PCR discriminar e quantificar as diferentes espécies de Plasmodium em uma sensibilidade de 0,0004-5 parasitas / µ l de sangue. No entanto, isso requer habilidade técnica, os equipamentos e reagentes caros e, portanto, não é adequado para o campo de aplicação.
Uma técnica altamente sensível, confiável e acessível é essencial para melhorar os tempos de diagnóstico e melhorando os resultados dos pacientes e possibilitando a eliminação da doença. Atenuada espectroscopia de Total reflexão Fourier transform (ATR-FTIR) oferece uma solução para este problema em potencial. Trabalhos anteriores mostraram que era possível detectar e quantificar por p. falciparum em metanol fixada filmes de sangue atingir os limites de detecção de < 1 parasita / µ l de sangue (< 0,0002% parasitemia)9, que é comparável aos métodos PCR. Estudos recentes têm mostrado que é possível detectar e quantificar parasitas em amostras aquosas e, assim, eliminar a etapa de fixação. No entanto, fatores tais como o vapor de água, ruído espectral e tratamento de dados precisam ser tomadas em consideração para obter melhores resultados10.
Este protocolo tem como objetivo mostrar novos usuários como adquirir espectros de FTIR-ATR e preparar um modelo de regressão para a detecção de p. falciparum de amostras aquosas glóbulos vermelhos (RBC)10.

<table><tbody><tr><td>Sangue do doador</td> <td>-</td><td></td> <td>Deve ser coletado por um médico treinado</td></tr><tr><td>Sangue de estoque</td><td>Cruz Vermelha Australiana '</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>3D7 Plasmodium falciparum</td><td>A cepa do Burnet</td> <td>Institute-Laboratory</td> <td>equivalente ao tipo selvagem</td></tr><tr><td>RPMI-1640 mídia com L-hepes sem bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Albumax (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>E003000PJ</td><td>Alíquota em tubos de falcão de 50 mL e armazenar no freezer</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1876</td><td>Deve ser filtrado antes do uso em cultura</td></tr><tr><td>Tubos de coleta de sangue (Vacutainers)</td> <td>Becton, Dickonson and Company</td><td>367671</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de imersão</td><td>Thermofisher</td><td>M3004</td><td></td></tr><tr><td>50 mL placas de cultura</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>pontas de pipeta de 25mL</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td></td></tr><tr><td>pontas de pipeta de 10mL</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipeta automatizado</td><td>Integra-biosciences</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Legend X1R</td><td>Thermofisher</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Forma&trade; 310 Incubadoras de CO2 de Calor Direto</td><td>Thermofisher</td><td>310TS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E-100 Microscópio Binocular</td><td>Nikon Instruments</td><td>E100_2CE-MRTK-1</td><td>Ao comprar, certifique-se de que a lente 100x é um óleo lente de imersão</td></tr><tr><td>Espectrômetro Bruker Alpha Ft-IR com Acessório ATR Quick Snap</td><td>Bruker</td><td>9308-3700 Certifique-se</td><td>de solicitar o acessório "Eco-ATR" ao comprar</td></tr><tr>o <td>software de análise de dados multivariados</td><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc</td><td></td></tr><tr><td>O Unscrambler X</td><td>CAMO</td><td></td><td>Software de análise de dados multivariados</td></tr><tr><td>PLS-Toolbox</td><td>Mathworks, Inc.</td><td></td><td>GUI para Matlab</td></tr></tbody></table>

deteção e quantificação de plasmodium falciparum em aquosa glóbulos vermelhos por atenuadas total reflexão espectroscopia de infravermelho e análise de dados multivariada

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Vamos demonstrar um método de quantificação e detecção de parasitas em aquosas células vermelhas do sangue (hemácias) usando uma simples bancada espectrômetro atenuadas Total reflexão Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) em conjunto com a análise de dados multivariada ( MVDA). 3 7 por p. falciparum foram cultivadas para parasitas de palco 10% parasitemia anel e usado para spike hemácias do doador fresco isolado para criar uma diluição de série entre 0 – 1%. 10 µ l de cada amostra foram colocadas no centro da janela de diamante ATR para adquirir o espectro. Os dados da amostra foi tratados para melhorar a relação sinal / ruído e remover a contribuição da água, e então aplicou-se a segunda derivada para resolver características espectrais. Os dados foram então analisados usando dois tipos de MVDA: primeiro Principal componente análise (PCA) para determinar quaisquer valores atípicos e regressão de mínimos quadrados parciais (PLS-R) para construir o modelo de quantificação.

Plotagem de mínimos quadrados parciais (PLS-R) e seu vetor de regressão associado, Figura 1a e 1b respectivamente, mostram que o sinal dos parasitas são bastante distintas de hemácias que podem ser usados para formar uma regressão linear do modelo a ser usado para o Previsão de parasitas em futuros conjuntos de dados.
Um modelo robusto, linear de PLS-R foi gerado com um valor de R-q...

Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de Plasmodium falciparum em infectados aquosas glóbulos vermelhos usando um espectrômetro infravermelho de reflexão total atenuada e análise multivariada de dados.

Deteção e quantificação de Plasmodium falciparum em aquosa glóbulos vermelhos por atenuadas Total reflexão espectroscopia de infravermelho e análise de dados multivariada

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

O objetivo geral deste procedimento é construir um modelo de regressão para a previsão da parasitemia da malária utilizando espectroscopia ATR-FTIR com análise de dados multivariados. Esse método pode ajudar a agilizar o diagnóstico de ponto de atendimento que pode ajudar a melhorar os resultados dos pacientes no futuro. A principal vantagem dessa técnica é que, embora o modelo possa levar algum tempo para ser construído, ele é altamente portátil, fácil de usar, altamente sensível e de baixo custo.Embora este método permita a quantificação de parasitas da malária, também pode ser usado para observar a resposta fenotípica a mudanças ambientais, como alterações na composição de parasitas devido a agentes antimicrobianos. A ideia desenvolveu-se a partir do trabalho que fizemos no Síncrotron Australiano em células infectadas pela malária. Isso foi no nível de célula única.A partir daí, decidimos usar espectroscopia ATR-FTIR para realmente desenvolver o teste de diagnóstico. Antes de iniciar o procedimento de sincronização, cultura 30 mililitros de 3D7 cepa Plasmodium falciparum parasitas como descrito no protocolo de texto. Usando uma pipeta automatizada, resuspend a cultura e transferi-la para um tubo cônico de 50 mililitros.Centrifugar a cultura de 300 a 400 vezes g sob condições laboratoriais padrão por cinco minutos. Remova o supernatante desenhando-o com uma pipeta automatizada sem perturbar a pelota. Descarte a mídia de resíduos em uma solução de 10% alvejante.Adicione lentamente de 12 a 15 mililitros de uma solução de 4%sorbitol à pelota e misture a cultura tampando e invertendo o tubo até que a cultura fique homogênea. Incubar a cultura a 37 graus Celsius por 15 minutos. Depois de 15 minutos, centrifugar a cultura por cinco minutos.Use uma pipeta automatizada para remover o supernatante sem perturbar a pelota. Adicione 10 a 15 mililitros de 0,9% salino à pelota e misture a solução tampando e invertendo o tubo até que a cultura fique homogênea. Repita a centrifugação e a solução salina lave mais duas vezes para remover todos os restos de sorbitol.Para iniciar este procedimento, centrifugar os glóbulos vermelhos do estoque, ou RBCs. Remova o supernasce e lave com 0,9% salino um total de três vezes. Centrifugar os RBCs de estoque e a cultura a 300 a 400 vezes g por cinco minutos e descartar o supernasciente de cada tubo.Rotule oito tubos de microcentrifuuagem conforme indicado. Em seguida, use uma pipeta de 0,2 a 20 microliter para adicionar a quantidade apropriada de cultura a cada tubo. Em seguida, adicione a quantidade apropriada de RBCs de estoque a cada tubo para obter a diluição de parasitamia desejada.Centrifugar o sangue fresco do doador coletado em tubos anticoagulantes a 1.200 vezes g e condições laboratoriais padrão por 10 minutos. Remova o plasma desenhando-o com uma pipeta e descartando-o em uma solução de alvejante de 10%. Adicione 900 microliters de RBCs doadores isolados em cada tubo de microcentrifuuagem e misture completamente invertendo 10 vezes.Um simples espectrômetro de reflexão total atenuado Fourier Transform, ou espectrômetro ATR-FTIR será usado para adquirir o espectro. Prepare e limpe o cristal usando lenços sem fiapos umedecidos com água ultra-pura para esfregar suavemente o cristal em um movimento circular. Em seguida, use outro lenço sem fiapos para secar completamente o cristal.Faça uma medição de fundo do ar clicando na medição de fundo. A cada 20 minutos, limpe o cristal e repita esta medida. Abra a exibição ao vivo clicando em Visualização.Observe uma linha de base plana e horizontal que indique que o cristal está limpo. Pipeta 10 microliters de água deionizada diretamente no meio do cristal e clique em Medir Amostra. Seque o cristal usando um lenço sem fiapos e um movimento circular suave.Pipeta 10 microliters de amostra no meio do cristal e clique em Medir amostra. Limpe o cristal entre as amostras. Nesta demonstração, a análise de dados multivariados será realizada por meio do MATLAB.Para iniciar o tratamento de dados, a análise de entrada na janela de comando para abrir a interface gráfica do usuário. Clique com o botão direito do mouse na caixa X para encontrar dados de importação. Selecione o tipo de arquivo para análise.Importe a amostra, a água e o espectro da linha de base como conjuntos de dados no local de trabalho selecionando todos os espectros em cada conjunto separadamente, clicando em Abrir e dando a cada conjunto um nome curto. Clique em Nova Variável na janela de comando e dê ao vetor o nome Parasitemia. Insira a Parasitemia de cada amostra.Clique com o botão direito do mouse na caixa X para encontrar dados de parcela. Clique no ícone Plot Data para traçar os dados. Inspecione o espectro para obter efeitos de vapor de água clicando em Zoom e ampliando em 1.800 a 1.400 por centímetro, mais claramente observado como picos curtos, afiados e estreitos ao longo das encostas das bandas Amide I e Amide II.Em casos de vapor de água extrema, abra a guia editar dados pré-processo e selecione Suavizar. Reduza o ruído e/ou as fortes contribuições de vapor de água, suavizando a amostra e o espectro da água. Após mais tratamento de dados, conforme descrito no protocolo de texto, abra a guia Editar dados e, em variáveis de coluna, selecione 2980 a 2800 por centímetro e de 1750 a 850 por centímetro, certificando-se de que apenas suas caixas estejam marcadas.Os dados estão prontos para análise. Para realizar a análise dos componentes principais, ou PCA, clique em Decomposição de Análise e selecione PCA. Clique em Build Model.Observe o limite de confiança de 95%, o anel tracejado, no gráfico de pontuação entre PC 1 e PC 2. Use a ferramenta Selecionar espectros para marcar o espectro de amostra com pontuações que ocorrem fora do limite como potenciais outliers. Para realizar a regressão parcial dos quadrados, ou PLSR, clique em Regressão de Análise e selecione PLSR.Clique com o botão direito do mouse no bloco Y e selecione o modelo de compilação de Parasitemia vetorial. Analisar o modelo de regressão e o vetor de regressão e identificar as bandas biológicas. Um parcela parcial de regressão de menos quadrados de RBCs aumentou entre zero a um por cento A Parasitemia gerou um valor R-quadrado de 0,87 e um erro médio de validação cruzada ao quadrado de 0,13%.Isso demonstra a capacidade do modelo de prever a Parasitemia em cada amostra com a conhecida Parasitemia no eixo x e a Parasitamia prevista no eixo y. O coeficiente de regressão associado descreve a contribuição de cada banda para a capacidade preditiva do modelo. Quanto mais intensa a banda, mais ela contribui para o modelo e, assim, como o parasita altera a composição química do sangue.Os resultados mostram que o sinal dos parasitas são distintos o suficiente dos RBCs para que eles possam ser usados para formar um modelo de regressão linear para a previsão de parasitas em conjuntos de dados futuros. Uma vez dominada, essa técnica pode levar menos de três minutos por amostra se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de limpar os cristais ATR de todos os resíduos.Após este procedimento, outras espécies de malária como P vivax e P malária podem ser modeladas para responder a tais perguntas como, a espectroscopia ATR-FTIR é sensível o suficiente para distinguir entre espécies? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biospectroscopia explorarem a detecção e quantificação de outros patógenos transportados pelo sangue e até mesmo analisarem no sangue, como glicose e ureia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão da espectroscopia ATR-FTIR e análise NVDA para construir um modelo de regressão.Não se esqueça que trabalhar com amostras de sangue e malária do paciente pode ser perigoso, e o treinamento e contenção adequados do nível de biossegurança deve ser sempre feito ao tentar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Este protocolo descreve um ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche para detectar esporozoítos de glândulas salivares em mosquitos. Usando anticorpos monoclonais facilmente disponíveis, o método permite a detecção econômica e de alto rendimento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. O método é adequado para pesquisas de transmissão da malária, incluindo pesquisas vetoriais.

Detecção de esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando um ensaio imunoenzimático

O ensaio padrão de alimentação de membrana (SMFA) é considerado como o padrão-ouro para a avaliação e identificação de potenciais compostos antimaláricos. Este sistema de alimentação artificial é usado para infectar mosquitos para avaliar ainda mais os efeitos desses compostos na intensidade e prevalência do parasita Plasmodium falciparum .

Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles

Aqui descrevemos um novo método para ajudar a elucidar os mecanismos de imunidade celular ao Plasmodium durante a fase sanguínea da infecção. Este é um ensaio in vitro que mede a morte de hemácias infectadas por linfócitos citotóxicos.

In vitro Ensaio de Morte de Hemácias Infectadas por Plasmodium por Linfócitos Citotóxicos

Aprenda a detectar e quantificar Plasmodium falciparum em glóbulos vermelhos usando espectroscopia ATR-FTIR e análise multivariada. Este método portátil e de baixo custo acelera o diagnóstico da malária em pontos de atendimento.

Deteção e quantificação de Plasmodium falciparum em aquosa glóbulos vermelhos por atenuadas Total reflexão espectroscopia de infravermelho e análise de dados multivariada (Vídeo) | JoVE Journal

Deteção e quantificação de Plasmodium falciparum em aquosa glóbulos vermelhos por atenuadas Total reflexão espectroscopia de infravermelho e análise de dados multivariada

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