Deteção e quantificação de Plasmodium falciparum em aquosa glóbulos vermelhos por atenuadas Total reflexão espectroscopia de infravermelho e análise de dados multivariada

O objetivo geral deste procedimento é construir um modelo de regressão para a previsão da parasitemia da malária utilizando espectroscopia ATR-FTIR com análise de dados multivariados. Esse método pode ajudar a agilizar o diagnóstico de ponto de atendimento que pode ajudar a melhorar os resultados dos pacientes no futuro. A principal vantagem dessa técnica é que, embora o modelo possa levar algum tempo para ser construído, ele é altamente portátil, fácil de usar, altamente sensível e de baixo custo.

Embora este método permita a quantificação de parasitas da malária, também pode ser usado para observar a resposta fenotípica a mudanças ambientais, como alterações na composição de parasitas devido a agentes antimicrobianos. A ideia desenvolveu-se a partir do trabalho que fizemos no Síncrotron Australiano em células infectadas pela malária. Isso foi no nível de célula única.

A partir daí, decidimos usar espectroscopia ATR-FTIR para realmente desenvolver o teste de diagnóstico. Antes de iniciar o procedimento de sincronização, cultura 30 mililitros de 3D7 cepa Plasmodium falciparum parasitas como descrito no protocolo de texto. Usando uma pipeta automatizada, resuspend a cultura e transferi-la para um tubo cônico de 50 mililitros.

Centrifugar a cultura de 300 a 400 vezes g sob condições laboratoriais padrão por cinco minutos. Remova o supernatante desenhando-o com uma pipeta automatizada sem perturbar a pelota. Descarte a mídia de resíduos em uma solução de 10% alvejante.

Adicione lentamente de 12 a 15 mililitros de uma solução de 4%sorbitol à pelota e misture a cultura tampando e invertendo o tubo até que a cultura fique homogênea. Incubar a cultura a 37 graus Celsius por 15 minutos. Depois de 15 minutos, centrifugar a cultura por cinco minutos.

Use uma pipeta automatizada para remover o supernatante sem perturbar a pelota. Adicione 10 a 15 mililitros de 0,9% salino à pelota e misture a solução tampando e invertendo o tubo até que a cultura fique homogênea. Repita a centrifugação e a solução salina lave mais duas vezes para remover todos os restos de sorbitol.

Para iniciar este procedimento, centrifugar os glóbulos vermelhos do estoque, ou RBCs. Remova o supernasce e lave com 0,9% salino um total de três vezes. Centrifugar os RBCs de estoque e a cultura a 300 a 400 vezes g por cinco minutos e descartar o supernasciente de cada tubo.

Rotule oito tubos de microcentrifuuagem conforme indicado. Em seguida, use uma pipeta de 0,2 a 20 microliter para adicionar a quantidade apropriada de cultura a cada tubo. Em seguida, adicione a quantidade apropriada de RBCs de estoque a cada tubo para obter a diluição de parasitamia desejada.

Centrifugar o sangue fresco do doador coletado em tubos anticoagulantes a 1.200 vezes g e condições laboratoriais padrão por 10 minutos. Remova o plasma desenhando-o com uma pipeta e descartando-o em uma solução de alvejante de 10%. Adicione 900 microliters de RBCs doadores isolados em cada tubo de microcentrifuuagem e misture completamente invertendo 10 vezes.

Um simples espectrômetro de reflexão total atenuado Fourier Transform, ou espectrômetro ATR-FTIR será usado para adquirir o espectro. Prepare e limpe o cristal usando lenços sem fiapos umedecidos com água ultra-pura para esfregar suavemente o cristal em um movimento circular. Em seguida, use outro lenço sem fiapos para secar completamente o cristal.

Faça uma medição de fundo do ar clicando na medição de fundo. A cada 20 minutos, limpe o cristal e repita esta medida. Abra a exibição ao vivo clicando em Visualização.

Observe uma linha de base plana e horizontal que indique que o cristal está limpo. Pipeta 10 microliters de água deionizada diretamente no meio do cristal e clique em Medir Amostra. Seque o cristal usando um lenço sem fiapos e um movimento circular suave.

Pipeta 10 microliters de amostra no meio do cristal e clique em Medir amostra. Limpe o cristal entre as amostras. Nesta demonstração, a análise de dados multivariados será realizada por meio do MATLAB.

Para iniciar o tratamento de dados, a análise de entrada na janela de comando para abrir a interface gráfica do usuário. Clique com o botão direito do mouse na caixa X para encontrar dados de importação. Selecione o tipo de arquivo para análise.

Importe a amostra, a água e o espectro da linha de base como conjuntos de dados no local de trabalho selecionando todos os espectros em cada conjunto separadamente, clicando em Abrir e dando a cada conjunto um nome curto. Clique em Nova Variável na janela de comando e dê ao vetor o nome Parasitemia. Insira a Parasitemia de cada amostra.

Clique com o botão direito do mouse na caixa X para encontrar dados de parcela. Clique no ícone Plot Data para traçar os dados. Inspecione o espectro para obter efeitos de vapor de água clicando em Zoom e ampliando em 1.800 a 1.400 por centímetro, mais claramente observado como picos curtos, afiados e estreitos ao longo das encostas das bandas Amide I e Amide II.

Em casos de vapor de água extrema, abra a guia editar dados pré-processo e selecione Suavizar. Reduza o ruído e/ou as fortes contribuições de vapor de água, suavizando a amostra e o espectro da água. Após mais tratamento de dados, conforme descrito no protocolo de texto, abra a guia Editar dados e, em variáveis de coluna, selecione 2980 a 2800 por centímetro e de 1750 a 850 por centímetro, certificando-se de que apenas suas caixas estejam marcadas.

Os dados estão prontos para análise. Para realizar a análise dos componentes principais, ou PCA, clique em Decomposição de Análise e selecione PCA. Clique em Build Model.

Observe o limite de confiança de 95%, o anel tracejado, no gráfico de pontuação entre PC 1 e PC 2. Use a ferramenta Selecionar espectros para marcar o espectro de amostra com pontuações que ocorrem fora do limite como potenciais outliers. Para realizar a regressão parcial dos quadrados, ou PLSR, clique em Regressão de Análise e selecione PLSR.

Clique com o botão direito do mouse no bloco Y e selecione o modelo de compilação de Parasitemia vetorial. Analisar o modelo de regressão e o vetor de regressão e identificar as bandas biológicas. Um parcela parcial de regressão de menos quadrados de RBCs aumentou entre zero a um por cento A Parasitemia gerou um valor R-quadrado de 0,87 e um erro médio de validação cruzada ao quadrado de 0,13%.

Isso demonstra a capacidade do modelo de prever a Parasitemia em cada amostra com a conhecida Parasitemia no eixo x e a Parasitamia prevista no eixo y. O coeficiente de regressão associado descreve a contribuição de cada banda para a capacidade preditiva do modelo. Quanto mais intensa a banda, mais ela contribui para o modelo e, assim, como o parasita altera a composição química do sangue.

Os resultados mostram que o sinal dos parasitas são distintos o suficiente dos RBCs para que eles possam ser usados para formar um modelo de regressão linear para a previsão de parasitas em conjuntos de dados futuros. Uma vez dominada, essa técnica pode levar menos de três minutos por amostra se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de limpar os cristais ATR de todos os resíduos.

Após este procedimento, outras espécies de malária como P vivax e P malária podem ser modeladas para responder a tais perguntas como, a espectroscopia ATR-FTIR é sensível o suficiente para distinguir entre espécies? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biospectroscopia explorarem a detecção e quantificação de outros patógenos transportados pelo sangue e até mesmo analisarem no sangue, como glicose e ureia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão da espectroscopia ATR-FTIR e análise NVDA para construir um modelo de regressão.

Não se esqueça que trabalhar com amostras de sangue e malária do paciente pode ser perigoso, e o treinamento e contenção adequados do nível de biossegurança deve ser sempre feito ao tentar este procedimento.