Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR)

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear, ou RMN, é um método importante para determinar a estrutura molecular e a pureza de amostras em química orgânica.

Na espectroscopia de RMN, as amostras são expostas a um forte campo magnético. Após a exposição, certos núcleos transitam, ou ressoam, entre níveis discretos de energia. A lacuna de energia entre esses níveis pode ser medida e visualizada como espectros. Esses dados podem ser usados para elucidar a estrutura química da amostra.

Nem todos os núcleos têm as propriedades necessárias para serem ativos em RMN. Os isótopos comuns estudados são 1H, 2H, 13C, 19F e 31P.

Este vídeo apresentará os princípios por trás da RMN, percorrerá exemplos de preparações de amostras de RMN de diferentes estágios de uma reação química e discutirá várias aplicações.

No instrumento de RMN, nitrogênio líquido e hélio são usados para resfriar um ímã supercondutor. O ímã aplica um campo magnético constante a uma amostra. Dentro da amostra, núcleos atômicos com um número ímpar de prótons e / ou nêutrons se alinharão com o campo, adotando um estado de baixa energia, ou contra ele, adotando um estado de alta energia.

A diferença de energia entre os dois níveis é a frequência de ressonância, que depende da força do campo aplicado e do tipo de núcleo. Para os ímãs usados na RMN, o valor está na faixa de radiofrequência, ou RF.

Uma bobina de RF excita a amostra com um pulso de radiofrequência, movendo os núcleos de baixa energia para o estado superior, antes de reverter. A bobina detecta essas mudanças na magnetização, que são exibidas como picos.

A força da RMN reside em sua capacidade de distinguir núcleos, neste caso hidrogênio, por seu ambiente químico. Os elétrons nos átomos vizinhos bloqueiam, ou "protegem", os núcleos de parte do campo magnético. Esse campo efetivo altera a frequência de ressonância para os núcleos específicos, chamada de deslocamento químico. No etanol, os prótons metileno, hidroxila e metil têm frequências de ressonância únicas. Determinar a área sob cada pico elucida o número de cada tipo de próton.

Como instrumentos com diferentes intensidades magnéticas mudam as frequências ressonantes, eles são referenciados a uma molécula padrão adicionada à amostra, geralmente tetrametilsilano, ou TMS. A mudança química das frequências é muito pequena, muitas vezes relatada em partes por milhão, ou ppm.

Ao usar um ímã forte com alta resolução, os picos às vezes se dividem em subpicos. Isso é causado pelos núcleos vizinhos, alguns dos quais estão alinhados com o campo magnético, outros contra; alterando ainda mais o campo efetivo aplicado aos núcleos. No etanol, os 2 prótons de metileno dividem o pico de metila duas vezes em um tripleto, e os 3 prótons de metil dividem o pico de metileno três vezes em um quarteto. A distância da divisão, ou acoplamento J, está relacionada à distância dos núcleos, auxiliando na descoberta qualitativa.

Agora que você entende os princípios básicos por trás da RMN, vamos revisar um exemplo de procedimento que usa RMN de prótons para monitorar a síntese de chalcona a partir de um aldeído e cetona.

Comece usando uma pipeta Pasteur para adicionar uma pequena quantidade do material de partida a um copo. Passar para a hotte e diluir a matéria-prima com 0,7 ml de solvente deuterado. Solventes deuterados são usados, pois a frequência de ressonância do deutério está fora da faixa de prótons.

Use uma pipeta Pasteur para adicionar 0,7 mL do material de partida diluído em um tubo de RMN limpo de 5 mm, enchendo os 4,5 a 5 cm inferiores. Tampe o tubo de RMN e etiquete-o. Agite suavemente o tubo, tomando cuidado para evitar o contato entre a amostra e a tampa. Em seguida, insira o tubo no spinner.

Limpe a parte externa do tubo e do spinner usando 2-propanol e tecidos de laboratório. Em seguida, coloque o sample conjunto no medidor de profundidade e calibre a profundidade de inserção.

Após a calibração, carregue o sample conjunto no espectrômetro de RMN manualmente ou usando um amostrador automático. Finalmente, use uma estação de trabalho de computador para adquirir o espectro de RMN.

Gere espectros de RMN usando este procedimento para cada um dos materiais de partida da reação. Para a síntese de chalcona, devem ser gerados espectros tanto para o metoxibenzaldeído quanto para a metilacetofenona.

Em seguida, execute a síntese da amostra combinando os materiais de partida e reagentes em um frasco para iniciar a reação.

Em intervalos de 30 minutos, remova uma pequena alíquota da mistura de reação usando uma pipeta Pasteur e adicione 3 gotas a um tubo de RMN limpo.

Diluir este produto bruto da reacção com solvente deuterado e preparar a RMN utilizando o procedimento descrito anteriormente.

À medida que a reação progride, um precipitado amarelo se formará. Quando a reação estiver completa, lave e filtre o precipitado e gere espectros de RMN para o produto da reação purificada.

Agora que geramos espectros de RMN em cada estágio da reação química, vamos analisá-los.

Os picos dos espectros de RMN para cada um dos materiais de partida são atribuídos a diferentes grupos de prótons dentro da molécula de acordo com seus deslocamentos químicos e o número de prótons que contribuem para cada pico. Aqui, atribuímos os 4 principais grupos de prótons para metilacetofenona e metoxibenzaldeído, observando o pico de aldeído entre 9,5 e 10,5 ppm. Ao comparar os espectros de RMN dos produtos brutos da reação em diferentes momentos, a evolução da reação química que sintetiza a chalcona é elucidada. Por exemplo, o pico de aldeído do material de partida metoxibenzaldeído ainda está presente após 30 minutos de reação, mas desaparece completamente após 3 h, significando a conclusão da reação.

Ao examinar o espectro do produto purificado, podemos atribuir cada pico a um grupo de prótons na estrutura da chalcona. Por exemplo, examinando os picos 3 e 4, vemos que suas integrais são uma, correspondendo a grupos contendo apenas um próton.

Os picos 3 e 4 são chamados de dupletos, indicando um próton vizinho. Ambos têm constantes de acoplamento J de 16 Hz, sugerindo que os prótons estão situados em uma ligação dupla E. Ao atribuir todos os picos de RMN do produto da reação purificada, confirmamos a síntese de uma chalcona pura.

A espectroscopia de RMN tem uma ampla gama de aplicações e é usada em muitos campos científicos e médicos.

Nesta aplicação, a RMN de prótons é usada para verificar a síntese e a estrutura do diamidocarbeno e da mononoamidocarbina, cujos espectros de RMN têm diferentes padrões de divisão de pico. Esses carbenos também geraram produtos de reação aparentemente diferentes quando combinados com fósforo branco; O DAC1 gerou um produto de reação vermelho brilhante, enquanto o MAAC2 produziu um produto laranja brilhante. Essas diferenças nos produtos de reação foram confirmadas usando uma segunda aplicação de RMN, 31P? RMN, que gera espectros com base em diferenças na frequência ressonante dos núcleos de fósforo.

Aqui, a ressonância magnética nuclear, ou MRI, foi usada para gerar um mapa anatômico do cérebro e selecionar as regiões cerebrais de interesse. Em seguida, a espectroscopia de RMN foi usada para gerar espectros de metabólitos chave. Finalmente, por meio de ressonância magnética, foram avaliadas alterações no metabolismo cerebral em diferentes condições experimentais.

Nesta aplicação, a RMN foi usada para analisar as propriedades de ligação e propor uma estrutura 3D de um peptídeo de ligação ao cobre. Primeiro, os espectros de RMN foram comparados para os estados não ligado e ligado ao cobre do peptídeo. Em seguida, usando técnicas de RMN bidimensional mais avançadas, diferentes conformações potenciais da estrutura do peptídeo foram avaliadas. Finalmente, essas restrições estruturais derivadas de RMN foram usadas para desenvolver uma estrutura tridimensional proposta para o peptídeo não ligado.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE à análise de RMN. Agora você deve entender os princípios subjacentes por trás da geração e análise de espectros de RMN, bem como um procedimento para preparação de amostras de RMN.

Obrigado por assistir!