Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

O objetivo geral deste procedimento de imagem de fluorescência enzimática repórter é facilitar a detecção sensível e específica de Mycobacterium tuberculosis em modelos animais pré-clínicos para patogênese, terapêutica e pesquisa de vacinas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da tuberculose, incluindo mecanismos de virulência de espécies bacterianas, bem como a criação de terapêuticas e a compreensão de vacinas. Portanto, a principal vantagem dessa técnica é que ela permite que o mesmo grupo de animais seja fotografado em vários pontos de tempo.

Isso reduz muito o custo, nos permite estudar as interações patógeno do hospedeiro e também aumenta o poder estatístico porque um número maior de animais pode ser mantido prontamente ao mesmo tempo. Para começar, cresça qualquer bactéria M.tuberculosis em meio MOADCTW a 37 graus Celsius até uma densidade óptica de 0,5 medida a 600 nanômetros. Todos os procedimentos que envolvam a manipulação de materiais infecciosos devem ser realizados em gabinetes de biossegurança ou outros dispositivos de contenção física aprovados.

Quando estiver pronto, fazer uma série de uma a 10 diluições da cultura no mesmo meio. Em seguida, colocar as diluições em triplicado em placas selectivas de 7H11 para determinar com precisão o UFC. Incube as placas por quatro semanas a 37 graus Celsius ou até que as colônias possam ser contadas com precisão para determinar o UFC.

Antes de configurar uma inoculação, certifique-se sempre de que a coifa de biossegurança esteja fluindo ar a 50 litros por minuto. Para preparar um inóculo que pode infectar até 90 camundongos, meça a UFC desejada em um tubo de falcão de 15 mililitros. Entre 10.000 e 1 milhão de UFC são normalmente usados.

Em seguida, pegue as bactérias. Em seguida, lave as bactérias uma vez com 10 mililitros de solução salina. Em seguida, suspenda-os em 15 mililitros de solução salina.

Em seguida, em um gabinete de biossegurança, carregue o inóculo em uma jarra de vidro que pode ser conectada a um nebulizador. Em seguida, conecte a unidade nebulizadora e ajuste o tubo vertical de aço inoxidável de modo que a extremidade inferior fique cerca de um quarto de polegada abaixo do menisco da suspensão. Agora transfira o conjunto para a câmara de inoculação em um recipiente de transporte à prova de vazamentos.

Para prosseguir, carregue animais de peso conhecido na câmara de inoculação energizada. A câmara pode acomodar até 90 ratos. Em seguida, feche todas as travas da porta.

Em seguida, conecte o nebulizador usando um clamp de aço. Em seguida, pressione o botão Iniciar na câmara. E defina a taxa de fluxo de ar entre três e cinco litros por minuto.

O ar comprimido fluirá a cerca de 22 a 26 libras por polegada quadrada e, o mais importante, deve ser possível ver a névoa de inóculo na câmara. Após 15 minutos, uma luz vermelha na frente do painel de controle aparecerá e um sinal sonoro indicará o fim da corrida. Em seguida, pressione o botão de reinicialização para redefinir os temporizadores.

Para liberar o vácuo, pressione o pequeno botão vermelho na porta da câmara. Em seguida, abra a porta da câmara e devolva os ratos às gaiolas de suas casas. Daqui para frente, mantenha os animais na sala de contenção.

Em seguida, devolva o frasco e o recipiente de transporte ao gabinete de biossegurança. Lá, descarte a suspensão bacteriana restante em um recipiente de lixo designado. Em seguida, coloque o frasco nebulizador usado dentro de um saco de risco biológico e feche o saco para transporte para a autoclave.

Para limpar a câmara, borrife as superfícies internas com fenol tamponado e etanol a 70%. Deixe essas soluções reagirem nessas superfícies por 10 minutos. Em seguida, limpe-os completamente.

Descarte todos os lenços no lixo de risco biológico. Em seguida, autoclave o lixo, o recipiente de lixo e os frascos nebulizadores usados. Transfira os animais para a sala de imagem.

Lá, anestesiar um animal de acordo com o protocolo de texto e injetá-lo com substrato de contraste por injeção intraperitoneal. No software de sistemas de imagem, inicialize o sistema e prossiga quando a barra de temperatura ficar verde. Depois de inicializar o sistema, coloque o mouse na câmara de imagem.

Certifique-se de que suas narinas estejam dentro do cone do nariz para que receba anestésico durante a imagem. Agora volte para o computador. No painel de controle de aquisição, selecione fluorescência, transiluminação, para visualização de animais inteiros ou epiiluminação para visualizar os tecidos pulmonares.

Para um único mouse, defina o campo de view para B e o nível da lâmpada para alto. Para a exposição, use tempo automático, binning médio e dois ou três para o F / Stop. Em seguida, defina o filtro de excitação para 745 nanômetros e os filtros de emissão de 780 a 840 nanômetros.

Em seguida, vá para a configuração da sequência e selecione de nove a 12 pontos de transiluminação na área de interesse. Agora pressione o botão adquirir para coletar imagens. A análise de imagem é abordada no protocolo de texto.

Para analisar a extensão da infecção, eutanasiar o camundongo usando pentobarbital sódico. Certifique-se de verificar se há um reflexo pedal para garantir que o animal seja sacrificado. E então explante os pulmões usando uma dissecção padrão.

Em seguida, homogeneizar o tecido pulmonar em um mililitro de PBS. Em seguida, fazer uma diluição serial de dez vezes da homogeneína usando PBS. Colocar a homogeneidade diluída em triplicado e incubar a placa a 37 graus Celsius até que as colónias possam ser contadas.

Em seguida, use a pontuação da UFC para medir a gravidade da infecção. Os camundongos foram tratados conforme descrito. Um substrato REF foi usado para visualizar a progressão de M. tuberculosis.

A fluorescência foi quantificada usando transiluminação. E aumentou da segunda para a sexta semana nos camundongos infectados. A ligeira queda no sinal nos camundongos de controle pode ser atribuída ao aumento da massa corporal e do volume durante o período de seis semanas.

A reconstrução 3D FLIT de fontes de fluorescência foi feita a partir de vários pontos de transiluminação usando a mesma excitação e série de filtros de emissões. Mapas de eficiência de NTF foram feitos para verificar a qualidade da reconstrução. A imagem retirada do filtro de excitação específico foi normalizada para a imagem de transmissão feita com o mesmo filtro de emissão e um filtro de excitação aberto.

Isso fornece um sinal produzido apenas pelo substrato. Quase não houve erro na reconstrução. Examinando a eficiência NTF dos dados na visão horizontal e vertical mostrou uma correlação estreita.

Assim, a reconstrução 3D teve poucos artefatos, melhor localização de sinal e sensibilidade aprimorada em relação a outros métodos. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de tuberculose explorarem a eficácia terapêutica de medicamentos contra o Mycobacterium tuberculosis. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como infectar camundongos por via aerossol com mycobacterium tuberculosis com imagens ópticas de acompanhamento usando o substrato REF.