Name: Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprenda a detectar Mycobacterium tuberculosis em camundongos usando imagem por fluorescência de enzima repórter. Este método permite estudos longitudinais do progresso da infecção e avaliação de terapêuticas.

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Estudos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê de Texas A & M University. Revisão e aprovação de um oficial de segurança de risco biológico ou comitê em sua instituição podem ser necessárias.
Atenção: Todos os procedimentos requerem BSL3 contenção. Os funcionários são obrigados a usar equipamentos de proteção individual em todos os momentos. Todas as manipulações são executadas dentro do gabinete de biossegurança (BSC) e todos os farelos são descartados em recipientes para objectos cortantes. BSC e superfícies de trabalho são limpas com álcool etílico fenol e 70% tamponado antes de iniciar o trabalho e depois do trabalho. Procedimentos normalmente seria feitos no nível de biossegurança 3 com Mycobacterium tuberculosis, mas para fins de filmagens e ilustração, os autores demonstram esses procedimentos no nível de biossegurança 2 com bactérias menos virulentas.
1. cepas e as condições de cultura
Nota: Cepa de M. tuberculosis CDC1551 é utilizada neste estudo, mas qualquer estirpe de M. tuberculosis pode ser usado da mesma maneira.
<ol><li>Crescem as bactérias em M-OADC-TW (7H 9 caldo suplementado com 0,5% de glicerol, ácido oleico de 10% dextrose complexo da catalase e 0,05% Tween-80) médio pé a 37 ° C para uma OD600 de 0.5 (~ 0.2 x 107 UFC).</li>
	<li>Diluir a cultura em M-OADC-TW (série de 01:10 diluições das bactérias). As diluições das bactérias da placa (105, 106, 107, 108) em triplicado em seletiva placas de 11 7 H para permitir a determinação de UFC.</li>
	<li>Incube as placas durante quatro semanas a 37 ° C ou até colônias podem ser contadas com precisão.</li>
	<li>Centrifugue o inóculo bacteriano a 8.534 x g por 5 min obter uma pelota. Lave o pellet uma vez com 10 mL de solução salina (0,9% NaCl) e ressuspender o sedimento em 15 mL de solução salina (0,9% NaCl).</li>
</ol>2. infecção de aerossol de ratos utilizando uma câmara de Madison
<ol><li>Permitir que os ratos se adaptar ao novo ambiente por uma semana.</li>
	<li>Pese os ratos antes de carregá-los para a câmara.</li>
	<li>Ligue os cabos de três para a faixa de poder: o poder da câmara principal, bomba de vácuo e o compressor de ar, nessa ordem.</li>
	<li>Cuidadosamente desparafuse o frasco de vidro. Trazer o frasco de vidro para a biossegurança do armário e adicionar o inóculo de desafio suspendido em 15 mL de solução salina (0,9% NaCl) para alcançar ~ 104 - 106 UFC de bactérias nos pulmões.</li>
	<li>Feche a tampa da jarra de vidro no armário a biossegurança. Anexar o frasco para a unidade de nebulização e ajustar o tubo vertical de aço inoxidável, de modo que a extremidade inferior (ingestão) é cerca de um quarto de uma polegada abaixo do nível do líquido no frasco.</li>
	<li>Carregar todos os animais que precisava para a experiência (a câmara pode conter até 90 ratos) na câmara e feche todas as travas na porta.</li>
	<li>Verifique a principal (quarto) medidor de fluxo de ar. Certifique-se de que o centro da boia (bola) funciona cerca de 50 L/min, medida na escala à esquerda.</li>
	<li>Pressione o botão Start no painel de controle da câmara. Defina a taxa de fluxo de ar através do medidor de fluxo de ar do compressor (o menor medidor no canto esquerdo) como 4 L/min na escala. Verificar visualmente para garantir que o inóculo de desafio é ser nebulizado.</li>
	<li>Depois de 15 min, quando a luz vermelha na parte frontal do painel de controle aparece, e um sinal sonoro indica o final da corrida, pressione o botão Reset no canto inferior direito do painel de controle para redefinir o timers.</li>
	<li>Mantenha pressionado o botão vermelho pequeno na porta da câmara para liberar o vácuo.</li>
	<li>Abra a porta da câmara e remover os animais. Coloque os ratos volta em suas gaiolas.</li>
	<li>Retire o copo do nebulizador e coloque em um recipiente de transporte selado, à prova de vazamentos. Coloque o recipiente dentro do armário de bio-segurança e descarte a suspensão de desafio dentro de um recipiente de recolha designado.</li>
	<li>Coloque o frasco nebulizador usado dentro de um saco de risco biológico e selar o saco para o transporte para a autoclave.</li>
	<li>No final do processo de infecção, pulverizar o interior da câmara com fenol e 70% de etanol tamponada e permitir que a câmara se sentar por 10 min.</li>
	<li>Em seguida, limpe todas as superfícies interiores acessíveis muito cuidadosamente. Elimine todas as toalhas de papel contaminadas, etc. para o lixo de risco biológico. Autoclave o lixo, recipiente de resíduos e utilizados frascos de nebulização.</li>
	<li>Coloca os animais na sala de contenção até o tempo-ponto de imagem.</li>
	<li>No dia da imagem latente, transferi os animais em um recipiente secundário para a sala da imagem latente.</li>
</ol>3. animal anestesia
<ol><li>Anestesia os ratos com isoflurano, usando um sistema de anestesia de gás personalizado.</li>
	<li>Pese cada uma cuba do filtro carvão dois, localizado no topo da unidade de anestesia.</li>
	<li>Substitua com um novo cilindro se o peso é de 50 g acima do peso inicial.</li>
	<li>Verificar se a unidade de vaporizador para garantir isoflurano suficiente para o procedimento.</li>
	<li>Coloque o suporte do cone de nariz dentro da câmara de imagem. Coloque o número de cones de nariz, necessário para o procedimento e selar as aberturas restantes com bloqueadores de cone de nariz.</li>
	<li>Ligue o fornecimento de oxigênio do cilindro de alta pressão e defini-lo em 55 libras por polegada quadrada.</li>
	<li>Ligue a bomba de evacuação, localizada em frente a unidade de anestesia e configurá-lo para 8 L/min.</li>
	<li>Ative a alternância de oxigênio localizada na frente da unidade de anestesia.</li>
	<li>Liga o fluxo de gás para a câmara de indução da anestesia para definir o fluxo de gás em vez de 1,5 L/min, o fluxo de gás fora.</li>
	<li>Liga o fluxo de gás para a câmara de imagem para definir o fluxo de gás em vez de 0,25 L/min, o fluxo de gás fora.</li>
	<li>Ligue o vaporizador de isoflurano e configurá-lo de 2-2,5%. Ajuste o nível de isoflurano, de acordo com o número e o peso dos animais sendo utilizados para o experimento, girando o dial sobre o vaporizador de isoflurano (2-2,5% para um mouse pesando ~ 20 g; 4% para um porquinho da Índia, pesando 300 g).</li>
	<li>Coloque os ratos na câmara de anestesia e feche a tampa. Liga o fluxo de gás para a câmara de indução da anestesia.</li>
	<li>Deixe os ratos na câmara de indução de anestesia, por 5-10 min até completamente anestesiada.</li>
	<li>Uma vez que os ratos são anestesiados, aplica uma pomada ótica para os olhos para protegê-los enquanto imagem.</li>
	<li>Coloque os ratos em prostração ventral ou esternal, tal que seus narizes são colocados no nariz cone para facilitar a anestesia de ratos durante o procedimento da imagem latente.</li>
</ol>4. imagens de fluorescência (REF) enzima repórter
<ol><li>Injete o substrato (20 µM, 2,5 µ l/g de peso) por injeção intraperitoneal para os infectados, bem como os ratos controle. Os ratos estão sob anestesia no interior da câmara de imagem por menos de 1 min.</li>
	<li>Inicie o sistema da imagem latente.</li>
	<li>Inicialize o sistema, clicando em Initialize. Espere até que a barra de temperatura se transforma em verde. Nota: A câmara de imagem consiste em uma plataforma aquecida para manter a temperatura corporal do animal enquanto imagem.</li>
	<li>Para configuração de aquisição de imagem, selecione fluorescente | Trans-iluminação para todo animal ou para os tecidos do pulmão, estrutura e sobreposição no painel de controle de aquisição de Epi-iluminação.</li>
	<li>Definir campo de visão de B para único rato e nível de lâmpada de alta.</li>
	<li>Definir o tempo de exposição para auto, binning médio, 2-3 para o f/stop e filtro de excitação em 745 filtros nm e emissão de 780 nm a 840 nm.</li>
	<li>Para configuração de sequência, clique em sequência de instalação, selecione 9-12 pontos de Trans-iluminação na área de pulmão.</li>
	<li>Clique em Acquire para aquisição de imagens.</li>
	<li>Coloque o mouse para a pós-imagem gaiola.</li>
	<li>Monitorar os ratos até totalmente recuperada ou sacrificar para quantificar o UFC se de imagem em um tempo-ponto do experimento. Execute uma pontuação de Karnofsky modificada para monitorar o bem estar dos ratos pós-imagem latente.</li>
</ol>5. análise de REF de imagem
<ol><li>Abra o software de imagem.</li>
	<li>Carrega arquivos de imagem clicando no ícone procurar.</li>
	<li>Para desagregação espectral, clique em desfazer espectral na paleta de ferramentas e clique em espectros de necessário para atrás. Clique em Iniciar desagregação.</li>
	<li>Para reconstrução da superfície óptica, clique na topografia de superfície.</li>
	<li>Selecione a orientação para dorsal, objecto de rato de peles e, clique em gerar superfície.</li>
	<li>Desenhar cortar imagem e conjunto imagem de limiar para uma região de interesse. Clique em concluído.</li>
	<li>Para o registro do órgão, vá para a aba de registro em 3D menu suspenso de instrumentos ópticos.</li>
	<li>Registre-se órgãos de interesse em um atlas do órgão.</li>
	<li>Ajuste tamanho do órgão ou local para a topografia da superfície gerada usando a ferramenta de transformação de ligar/desligar localizada sobre as ferramentas do painel de registro.</li>
	<li>Vá para tomografia computadorizada fluorescente reconstrução 3D (FLIT), e selecione analisar Tab. Selecione as imagens para ser incluído para análise, tipo a eficiência de fluorescência de transmissão normalizados (NTF) de imagem, clique em Iniciar.</li>
	<li>Verifique em selecionar tudo e reconstruir na guia de visualização de dados.</li>
	<li>Para quantificação de fluorescência, vá para ferramentas da região de interesse (ROI), adicionar o cubo ROI ao órgão de interesse e ajustar o tamanho do cubo para cobrir o órgão de interesse. Clique em medir ROIs 3D.</li>
	<li>Na janela de medições de ROI, ir para medições de ROI 3D, selecione o tipo de dados para unidade voxels e medições da fonte de pmolM-1cm-1.</li>
	<li>Salvar e/ou exportar o resultado da análise de reconstrução 3D de FLIT em um arquivo de dados ou figura.</li>
</ol>6. quantificação de bactérias pela UFC
<ol><li>Eutanásia em ratos por injeção intraperitoneal de 0,1 mL pentobarbital de sódio (390 mg/mL).</li>
	<li>Verifique se há reflexo pedal apertando as almofadas dos pés de ratos para assegurar que não há nenhuma reação reflexa.</li>
	<li>Explantes de tecido pulmonar de ratos usando uma tesoura e pinça estéril. Homogeneizar o tecido pulmonar em 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x.</li>
	<li>Faça 10 vezes diluições em série do homogenate pulmão em PBS 1x estéril.</li>
	<li>Para o chapeamento, identificar três alíquotas de 20 µ l cada as respectivas diluições na placa de ágar.</li>
	<li>Incube as placas em uma incubadora a 37 ° C e monitor para o crescimento bacteriano.</li>
	<li>Contagem de colônias em cada local após o tempo de incubação e expressam como CFU / mL corrigindo para volume e diluição utilizando a seguinte equação: UFC / mL = (C/V) x M Onde C = colônia contagens por ponto, V = volume da amostra inoculada em cada placa (mL) e M = fator de multiplicação (recíproca da diluição utilizada). Nota: Se 11 colônias são contadas em um local para um volume de amostra de 0,002 mL a uma diluição de amostra de 10-4, utilizando a equação, a contagem de colônia será calculada como (11/0.02) x 104 = 5,5 x 106 UFC / mL</li>
</ol>

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Ao usar técnicas de imagem, tais como REF, existem estratégias-chave que permitem a geração de dados robustas e consistentes. Imagem latente ótica produz luz espalhada em tecidos que podem afetar a profundidade de penetração, uma vez que é difícil de captar a luz emitida em todas as direções. Uso de um fluoróforo de infravermelho próximo (NIR) substrato para REF tendo um comprimento de onda de excitação e emissão no Querange de 700-900 nm de imagem facilita a absorção mínima do sinal fluorescente por tecidos de mamíferos. O substrato personalizado projetado foi construído, ligando um fluoróforo NIR, IRDye 800Cw para um quencher, QC IRDye-1, por um anel lactâmico permitindo fluorescência ressonância energética baseada em transferência têmpera. IRDye tem penetração de tecido excelente e características de dispersão de luz e não tem qualquer efeito prejudicial evidente mamíferos36, sendo liberado do sangue e órgãos por 24 h. fluorescência sinal significativamente aumenta começando 4 h após Administração de substrato, atingir o máximo níveis 6 h após a administração.
A dose infecciosa bacteriana, modo de administração da dose infecciosa e o substrato, bem como os pontos de tempo de imagem post infecção através da realização de estudos-piloto deve ser padronizada antes de embarcar em grandes e complexas, experiências. Estudos-piloto podem reduzir tempo e custo quando a imagem de um grande número de animais porque um procedimento padrão pode ser otimizado antes de fazer o experimento chave. Cargas bacterianas devem ser determinadas nos órgãos/tecidos de interesse, seguindo a imagem de corpo inteiro usando trans-iluminação e ex vivo pulmão imagem usando epi-iluminação para validar a fonte do sinal e determinar a qualidade da correlação com números bacteriana presente8. Estudos-piloto irão fornecer insights sobre o limiar da deteção, gama dinâmica da técnica, bem como a determinação das condições experimentais ideais para a imagem latente.
As principais vantagens de usar REF imagem como em comparação com outras estratégias de fluorescentes e bioluminescentes são sua alta sensibilidade e capacidade de imagem natural M. tuberculosis estirpes. REF de imagem utiliza a enzima cataliticamente robusta BlaC que é conservada em todos os isolados clínicos de M. tuberculosis e cepas de tuberculose-complexo. A grande sensibilidade de REF de imagem é devido à rápida taxa catalítica de BlaC em combinação com a retenção do produto fluorescente clivada pela célula hospedeira. O sinal continuamente aumenta enquanto o substrato está disponível, resultando em acúmulo quase ilimitado do sinal dentro da células infectadas e tecidos. Este aumento da sensibilidade de REF de imagem em comparação com abordagens alternativas de imagem permite a detecção específica de M. tuberculosis ambos em vitro e em vivo8,23,24, 29.
REF de imagem pode ser usado para a deteção bacteriana sem modificações genéticas, permitindo sua aplicação direta para qualquer modelo de infecção, de qualquer laboratório animais8,37 ou materiais clínicos humanos29,38 . REF pode ser usado para detectar e imagem de uma grande variedade de patógenos39,40, desde fluorogenic carcaças podem ser desenvolvidas para inúmeros alvos enzimáticos diferente BlaC como proteases, quinases, ureases e β-galactosidases. No entanto, cuidado pensamento deve ser dada ao alvo para garantir ele exibe as características ideais para a imagem latente. BlaC representa uma enzima bom modelo para características que garantam a aplicação bem sucedida desta estratégia. REF de imagem fornece uma leitura imediata na carga bacteriana presente nos pulmões durante infecções, que se apressa muito progresso no estudo da patogênese da tuberculose, uma vez que a determinação dos números bacterianas normalmente requer três a seis semanas, mas mesmo no mais organismos de crescimento rápido esta abordagem vai poupar uma grande quantidade de tempo. REF também pode ser usado para discriminar carcinomas de tuberculose, dos principais problemas no diagnóstico de lesões nodulares em pacientes41,42. REF serve como uma nova ferramenta para acelerar a imagem latente de tuberculose translacional e pode ser aplicada aos seres humanos, potencialmente permitindo rápida predição dos resultados terapêuticos.

A taxa de crescimento lento de M. tuberculosis é um obstáculo importante no diagnóstico rápido da tuberculose1,2,3. Enquanto a cultura com base em diagnóstico leva semanas para produzir resultados, esfregaço ácido-álcool resistentes tem limitações de diagnóstico4 em crianças de5 e pacientes co infectados com o vírus da imunodeficiência humana6,7. Tecnologias de imagem ópticas têm sido reconhecidas recentemente como uma alternativa aos tradicionais métodos de diagnóstico para tuberculose8,9. Fluorescência e bioluminescência podem ser usados para a imagem opticamente M. tuberculosis em animais vivos em tempo real10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Imagem latente ótica tem o benefício de uma avaliação rápida e específica de uma infecção com M. tuberculosis20,21,22.
Nós esboçamos detalhes para a imagem latente ótica de M. tuberculosis em ratos ao vivo usando REF. Este método é muito específico e sensível23,24 e, semelhante a outros métodos ópticos, é menos caro do que outros métodos de tuberculose (TB) de imagem25, incluindo tomografia computadorizada (CT)26, magnético ressonância de imagem (MRI)27e F-fluorodeoxyglucose a tomografia por emissão de pósitrons/CT (F-FDG PET-CT)28. REF utiliza personalizados substratos fluorescentes ou bioluminescentes que após clivagem por uma enzima bacteriana, produzir um produto fluorescente8,29. Portanto, tem a vantagem de não exigir uma estirpe de recombinantes repórter micobacteriana30,31. O substrato FRET descrito é composto por um fluorocromo e um quencher conectado por um anel β-lactâmico que é hidrolisado pela BlaC (β-lactamases), naturalmente constitutivamente expressado por tuberculose-complexo Mycobacterium8, 32. as bactérias diretamente geram sinal devido à atividade catalítica de REF que permite a amplificação por muitas ordens de magnitude e detecção sensível de M. tuberculosis.
O substrato REF utilizado neste estudo tem tecido excelente penetração em animais vivos e reduzido fundo devido ao seu longo comprimento de onda. Com esse substrato de longo comprimento de onda é possível alcançar um limite de detecção para M. tuberculosis de quase 100 formadoras de unidades (CFU) em vitro e < 1000 CFU nos pulmões de ratos na vivo (todo animal)8, 33. REF pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para expectoração, materiais clínicos e até mesmo diretamente em pacientes com micro sistemas endoscópica16,32,33,34 devido a sua alta sensibilidade e especificidade. REF pode ser aplicado a qualquer tensão clínica de tuberculose, porque usa uma enzima bacteriana produzida naturalmente, BlaC, para a deteção presente em todas as estirpes. Estas características fazem REF imagem uma ferramenta valiosa na pesquisa pré-clínica tuberculose em geral para facilitar a terapêutica e avaliação de vacinas, bem como a análise de patogênese, mas também, em última análise, podem ser aplicadas ao diagnóstico de tuberculose pacientes.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td> Solução <td>Fatal Plus sintetizada</td><td></td><td></td>personalizada</tr><tr><td></td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 Caldo Middlebrook</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC Enriquecimento Middlebrook</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Esporcidina</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook Agar</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>Madison Câmara</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-gas Sistema de anestesia</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem viva</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cones de nariz transparentes</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M. tuberculosis cepa CDC1551</td><td></td> camundongos BALB/C fêmeas ATCC<td></td><td></td></tr><tr><td>, 5-7 semanas</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Fluorescência de enzima repórter (REF) utiliza substratos específicos para enzimas presentes em organismos alvo de interesse para a imagem latente ou detecção por fluorescência ou bioluminescência. Nós utilizamos BlaC, uma enzima constitutivamente expressada por todas as cepas de M. tuberculosis . REF permite rápida quantificação de bactérias nos pulmões de ratos infectados. O mesmo grupo de ratos pode ser fotografado em muitos pontos do tempo, extremamente reduzindo custos, enumerando as bactérias mais rapidamente, permitindo que novas observações em interações patógeno-hospedeiro e aumentar o poder estatístico, desde que mais animais de cada grupo são facilmente mantidos . REF é extremamente sensível devido à natureza catalítica do repórter enzimática BlaC e específicas devido à transferência de energia de ressonância de flourescence personalizado (FRET) ou fluorogenic carcaças usadas. REF não requer cepas recombinantes, garantindo interações patógeno-hospedeiro normal. Descrevemos a imagem latente da infecção por M. tuberculosis utilizando um substrato de traste com emissão máxima em 800 nm. O comprimento de onda do substrato permite que a imagem sensível tecido profundo em mamíferos. Nós irá delinear a infecção de aerossol de ratos com M. tuberculosis, anestesia de ratos, a administração do substrato REF e óptico de imagem. Este método tem sido aplicado com sucesso para avaliar interações patógeno-hospedeiro e a eficácia dos antibióticos visando o M. tuberculosis.

REF imagem de camundongos infectados com M. tuberculosis juntamente com rato de controle não infectados são mostrados na Figura 1A. Os ratos infectados produziram um significativamente (P = 0.0057) maior sinal de fluorescência dos pulmões a pós-infecção 6 semanas, em relação ao controle após a administração de substrato. Um curso de tempo típico para estudar a eficácia terapêutica contra M. tuberculosis usando REF poderia ser imagens na semana 1, 2, 4, 6, 15, 24 pós infecção. Intensidade da fluorescência é quantificada usando epi-iluminação para tecidos do pulmão (Figura 1B). O sinal constantemente crescente de semana 2 para semana 6 nos pulmões de ratos infectados sugere que REF com sucesso capaz de detectar o M. tuberculosis in vivo. Uma gota no sinal de fundo de ratos controle em um momento posterior do tempo (Figura 1B) poderia ser atribuída ao aumento do corpo massa e volume de ratos durante um período de 6 semanas, reduzindo assim a penetração de comprimento de onda de excitação. Reconstrução 3D do FLIT de fontes de fluorescência em camundongos infectados com M. tuberculosis é representada na Figura 2. As sequências de imagem são adquiridas em vários pontos trans-iluminação do mouse usando a mesma excitação e série de filtros de emissão. Essas sequências de imagem são usadas para reconstrução 3D de FLIT para distribuição fonte fluorescente no âmbito da disciplina de animais. Figura 2 A-D demonstra as diferentes direções (coronal, sagital e transaxial) da tomografia computadorizada do mouse com o registro do órgão de pulmão. Eficiência NTF mapas para verificar a qualidade da reconstrução são representados na Figura 2,E. NTF permite subtrair o vazamento de luz de fundo de imagens trans-iluminação através de uma imagem extra capturado com filtro de densidade neutra. A imagem feita com o filtro de excitação específica (Figura 2E-medido) é normalizada para a imagem de transmissão, medida com o mesmo filtro de emissão e um filtro de excitação aberto (Figura 2E simulada) para dar o sinal produzido pelo substrato sozinho. O semelhante medido e simulado perfil de eficiência NTF tanto na horizontal (Figura 2-F) e vertical (Figura 2G) perfis com quase 0% percentagem erro (Figura 2E-% erro) fornece a evidência de uma reconstrução 3D de boa qualidade com redução de artefatos e sinal melhor localização e sensibilidade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Figura 1 . Imagem de M. tuberculosis com REF. (A) imagem na vivo de ratos infectados e infectados com M. tuberculosis em 2, 4 e 6 semanas pós infecção. A barra de cor representa a intensidade do sinal fluorescente em fótons por segundo por cm2 de baixo (amarelo) para alto (vermelho). (B) a quantificação da intensidade de fluorescência de camundongos infectados com M. tuberculosis. Valores de fluorescência para ambos controle (preto) e infectado (vermelho) é representado junto com o erro-padrão para cada ponto de tempo. O significado dos resultados foi determinado por estudantes t-teste, valores de p de &lt; 0,05 foram considerados significativos. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Figura 2 . Reconstrução 3D do FLIT de fontes de fluorescência em camundongos infectados com M. tuberculosis. Tomografia computadorizada de mouse representada em diferentes direções; A) coronal, B) sagital e C) transaxial com registro de órgão de pulmão D). A região 3D de interesse (ROI) é representada como um cubo vermelho no pulmão para medições de fonte. (E) eficiência NTF mapas do medido e simulado para verificação da qualidade da reconstrução. O perfil de eficiência medido e simulado NTF foi comparado, providing de boa qualidade da reconstrução 3D (eficiência semelhante medida e simulada de NTF). F) Horizontal e G) sinal vertical perfis representando medido (azul) e simulado a curva de eficiência NTF (vermelha). As barras vermelhas horizontais e verticais indicam a posição de origem. A barra de cor representa a intensidade do sinal fluorescente em fótons por segundo por cm2 de baixa (azul) para alto (vermelho). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Descrevemos a imagem óptica de camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) usando fluorescência de enzima repórter (REF). Esse protocolo proporciona uma detecção sensível e específica de M. tuberculosis em modelos animais pré-clínicos para investigação patogenia, terapêutica e vacina.

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

O objetivo geral deste procedimento de imagem de fluorescência enzimática repórter é facilitar a detecção sensível e específica de Mycobacterium tuberculosis em modelos animais pré-clínicos para patogênese, terapêutica e pesquisa de vacinas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da tuberculose, incluindo mecanismos de virulência de espécies bacterianas, bem como a criação de terapêuticas e a compreensão de vacinas. Portanto, a principal vantagem dessa técnica é que ela permite que o mesmo grupo de animais seja fotografado em vários pontos de tempo.Isso reduz muito o custo, nos permite estudar as interações patógeno do hospedeiro e também aumenta o poder estatístico porque um número maior de animais pode ser mantido prontamente ao mesmo tempo. Para começar, cresça qualquer bactéria M.tuberculosis em meio MOADCTW a 37 graus Celsius até uma densidade óptica de 0,5 medida a 600 nanômetros. Todos os procedimentos que envolvam a manipulação de materiais infecciosos devem ser realizados em gabinetes de biossegurança ou outros dispositivos de contenção física aprovados.Quando estiver pronto, fazer uma série de uma a 10 diluições da cultura no mesmo meio. Em seguida, colocar as diluições em triplicado em placas selectivas de 7H11 para determinar com precisão o UFC. Incube as placas por quatro semanas a 37 graus Celsius ou até que as colônias possam ser contadas com precisão para determinar o UFC.Antes de configurar uma inoculação, certifique-se sempre de que a coifa de biossegurança esteja fluindo ar a 50 litros por minuto. Para preparar um inóculo que pode infectar até 90 camundongos, meça a UFC desejada em um tubo de falcão de 15 mililitros. Entre 10.000 e 1 milhão de UFC são normalmente usados.Em seguida, pegue as bactérias. Em seguida, lave as bactérias uma vez com 10 mililitros de solução salina. Em seguida, suspenda-os em 15 mililitros de solução salina.Em seguida, em um gabinete de biossegurança, carregue o inóculo em uma jarra de vidro que pode ser conectada a um nebulizador. Em seguida, conecte a unidade nebulizadora e ajuste o tubo vertical de aço inoxidável de modo que a extremidade inferior fique cerca de um quarto de polegada abaixo do menisco da suspensão. Agora transfira o conjunto para a câmara de inoculação em um recipiente de transporte à prova de vazamentos.Para prosseguir, carregue animais de peso conhecido na câmara de inoculação energizada. A câmara pode acomodar até 90 ratos. Em seguida, feche todas as travas da porta.Em seguida, conecte o nebulizador usando um clamp de aço. Em seguida, pressione o botão Iniciar na câmara. E defina a taxa de fluxo de ar entre três e cinco litros por minuto.O ar comprimido fluirá a cerca de 22 a 26 libras por polegada quadrada e, o mais importante, deve ser possível ver a névoa de inóculo na câmara. Após 15 minutos, uma luz vermelha na frente do painel de controle aparecerá e um sinal sonoro indicará o fim da corrida. Em seguida, pressione o botão de reinicialização para redefinir os temporizadores.Para liberar o vácuo, pressione o pequeno botão vermelho na porta da câmara. Em seguida, abra a porta da câmara e devolva os ratos às gaiolas de suas casas. Daqui para frente, mantenha os animais na sala de contenção.Em seguida, devolva o frasco e o recipiente de transporte ao gabinete de biossegurança. Lá, descarte a suspensão bacteriana restante em um recipiente de lixo designado. Em seguida, coloque o frasco nebulizador usado dentro de um saco de risco biológico e feche o saco para transporte para a autoclave.Para limpar a câmara, borrife as superfícies internas com fenol tamponado e etanol a 70%. Deixe essas soluções reagirem nessas superfícies por 10 minutos. Em seguida, limpe-os completamente.Descarte todos os lenços no lixo de risco biológico. Em seguida, autoclave o lixo, o recipiente de lixo e os frascos nebulizadores usados. Transfira os animais para a sala de imagem.Lá, anestesiar um animal de acordo com o protocolo de texto e injetá-lo com substrato de contraste por injeção intraperitoneal. No software de sistemas de imagem, inicialize o sistema e prossiga quando a barra de temperatura ficar verde. Depois de inicializar o sistema, coloque o mouse na câmara de imagem.Certifique-se de que suas narinas estejam dentro do cone do nariz para que receba anestésico durante a imagem. Agora volte para o computador. No painel de controle de aquisição, selecione fluorescência, transiluminação, para visualização de animais inteiros ou epiiluminação para visualizar os tecidos pulmonares.Para um único mouse, defina o campo de view para B e o nível da lâmpada para alto. Para a exposição, use tempo automático, binning médio e dois ou três para o F / Stop. Em seguida, defina o filtro de excitação para 745 nanômetros e os filtros de emissão de 780 a 840 nanômetros.Em seguida, vá para a configuração da sequência e selecione de nove a 12 pontos de transiluminação na área de interesse. Agora pressione o botão adquirir para coletar imagens. A análise de imagem é abordada no protocolo de texto.Para analisar a extensão da infecção, eutanasiar o camundongo usando pentobarbital sódico. Certifique-se de verificar se há um reflexo pedal para garantir que o animal seja sacrificado. E então explante os pulmões usando uma dissecção padrão.Em seguida, homogeneizar o tecido pulmonar em um mililitro de PBS. Em seguida, fazer uma diluição serial de dez vezes da homogeneína usando PBS. Colocar a homogeneidade diluída em triplicado e incubar a placa a 37 graus Celsius até que as colónias possam ser contadas.Em seguida, use a pontuação da UFC para medir a gravidade da infecção. Os camundongos foram tratados conforme descrito. Um substrato REF foi usado para visualizar a progressão de M. tuberculosis.A fluorescência foi quantificada usando transiluminação. E aumentou da segunda para a sexta semana nos camundongos infectados. A ligeira queda no sinal nos camundongos de controle pode ser atribuída ao aumento da massa corporal e do volume durante o período de seis semanas.A reconstrução 3D FLIT de fontes de fluorescência foi feita a partir de vários pontos de transiluminação usando a mesma excitação e série de filtros de emissões. Mapas de eficiência de NTF foram feitos para verificar a qualidade da reconstrução. A imagem retirada do filtro de excitação específico foi normalizada para a imagem de transmissão feita com o mesmo filtro de emissão e um filtro de excitação aberto.Isso fornece um sinal produzido apenas pelo substrato. Quase não houve erro na reconstrução. Examinando a eficiência NTF dos dados na visão horizontal e vertical mostrou uma correlação estreita.Assim, a reconstrução 3D teve poucos artefatos, melhor localização de sinal e sensibilidade aprimorada em relação a outros métodos. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de tuberculose explorarem a eficácia terapêutica de medicamentos contra o Mycobacterium tuberculosis. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como infectar camundongos por via aerossol com mycobacterium tuberculosis com imagens ópticas de acompanhamento usando o substrato REF.

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Fonte: de Vries, C. R., et al., Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de feridas por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra uma técnica de imagem bioluminescente para monitorar a progressão da infecção bacteriana em um modelo de camundongos vivo. Bactérias patogênicas modificadas com o sistema repórter luxABCDE emitem luz no local da infecção, permitindo a visualização de bactérias metabolicamente ativas. Ao imagear o camundongo ao longo do tempo, os...

Imagem por Bioluminescência de Infecções Bacterianas em Camundongos

Fonte: Valentine, M. E., et al., Geração de mutantes de deleção gênica em quadro em Pseudomonas aeruginosa e Teste para Atenuação de Virulência em um Modelo Simples de Infecção em Camundongo. J. Vis. Experiência (2020)Este vídeo demonstra o uso de uma abordagem de imagem baseada em bioluminescência para monitorar infecção bacteriana em um modelo de camundongo vivo. Imagens bioluminescentes e por raios X sequenciais permitem visualização em tempo real e localização anatômica da infecção...

Imagem em tempo real de infecção bacteriana em um modelo de camundongo usando bioluminescência

Fonte: Behera, R. K., et al. Um método baseado em fluorescência para estudar a regulação gênica bacteriana em tecidos infectados. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um método para preparar tecido renal de camundongos infectado, colorir DNA e detectar expressão gênica bacteriana usando repórteres fluorescentes duplos. O vermelho marca todas as bactérias, e o verde destaca células sensíveis a infecções.

Imagem por fluorescência da colonização bacteriana em tecido renal de camundongos

Este vídeo demonstra a imagem de fluorescência enzimática repórter (REF) para detecção in vivo da infecção por Mycobacterium tuberculosis. Os camundongos infectados são injetados intraperitonealmente com um substrato para imagens REF. Ao ser hidrolisado pela enzima β-lactamase bacteriana, o substrato emite fluorescência, cuja detecção auxilia na avaliação da infecção.

Imagem de fluorescência enzimática repórter para rastreamento in vivo de infecção bacteriana

Este vídeo demonstra um método para rastrear infecções virais em modelos de camundongos usando um vírus Influenza A bi-repórter recombinante com luciferase e proteína de fluorescência. Este método permite estudos in vivo e ex vivo, permitindo que os pesquisadores obtenham insights sobre a dinâmica viral e os efeitos das intervenções.

Um vírus da gripe repórter fluorescente luciferase para rastrear infecções virais

De imagem multi-modalidade é uma abordagem útil para estudar a colonização bacteriana em modelos de animais pequenos. Este protocolo descreve a infecção de camundongos com...

4D Multimodalidade de imagens de<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecções em Ratos

Combinado imagiologia óptica e μCT num modelo de rato com infecção de implante ortopédico, utilizando uma estirpe bioluminescente engenharia de Staphylococcus aureus, desde a capacidade de forma não invasiva e longitudinalmente controlar a dinâmica da infecção bacteriana, assim como a resposta inflamatória correspondente e alterações anatómicas na osso.

Combinado<em&gt; In vivo</em&gt; Optical e μCT imagem para monitorar infecções, inflamações, and Bone Anatomy em uma infecção Orthopaedic Implant em Ratos

Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

Os vírus da influenza A (IAVs) são patógenos respiratórios contagiosos que causam epidemias anuais e pandemias ocasionais. Aqui, nós descrevemos um protocolo para rastrear infecções virais in vivo usando uma novela recombinante luciferase e fluorescência-expressando o bi-repórter IAV (BIRFLU). Esta abordagem fornece aos pesquisadores uma excelente ferramenta para estudar IAV in vivo.

Um luciferase-vírus da gripe do repórter fluorescente para A imagem latente viva e a quantificação da infecção viral

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem intravital de um Mycobacterium tuberculosis aprovado por BSL-2 atenuado. Cepa no pulmão murino usando uma janela pulmonar permanente. Essa abordagem permite a análise longitudinal com resolução de célula única das interações precoces hospedeiro-patógeno, incluindo localização bacilar, dinâmica vascular e captação de macrófagos dentro do mesmo microambiente pulmonar.

Imagem intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado no pulmão murino durante infecção intravascular precoce

Aprenda a detectar Mycobacterium tuberculosis em camundongos usando imagem por fluorescência de enzima repórter. Este método permite estudos longitudinais do progresso da infecção e avaliação de terapêuticas.

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

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