Name: Avaliação de terapias de células-tronco em um modelo de lesão do tendão patelar Bilateral em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a avaliar terapias com células-tronco em um modelo bilateral de lesão do tendão patelar em ratos. Este método controla a variação interindividual e reduz o número de animais necessários para detectar diferenças entre tratamentos ortopédicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Su, PhD, a análise estatística dos dados. Os autores também agradecer Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, seus conselhos sobre a anestesia e dor gestão protocolos usados no estudo. Este projecto foi apoiado por concessões do Western University of Health Sciences escritório do Vice-Presidente de pesquisa (12678v) e USDA seção 1433 fundos (2090).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) de Western University of Health Sciences e institucional Cuidado Animal.
1. isolamento e expansão de MSCs da matriz equina do Cordão Umbilical
<ol><li>Obter a placenta de uma égua adulta (grávida), depois observou parto e isolar assepticamente o cordão umbilical da placenta. Mantenha o cordão umbilical em solução salina tamponada fosfato (PBS) com 1% penicilina-estreptomicina (P/S) a 4 ° C durante a transferência até o processamento.</li>
	<li>Lavar o cordão umbilical duas vezes com temperatura PBS com 1% P/S em um tubo de 50 mL. Secção do cordão umbilical em fragmentos de 2 polegadas-longa na placa de 150 mm e lavar em temperatura ambiente PBS com 1% P/S em um tubo de 50 mL, duas ou três vezes, até a maior parte do sangue é lavado para fora.</li>
	<li>Corte o cordão umbilical longitudinalmente para expor os navios. Remova os navios, incluindo 2 artérias, uma veia e uma haste alantoico da medula usando fórceps e a tesoura. Coletar o cordão umbilical matriz (geleia de Wharton), que é os matriz gelatinosa circundante dos navios, em uma placa de 150 mm por raspagem com um bisturi, e picar a gelatina em pedaços bem.</li>
	<li>Geleia lugar da Wharton dos fragmentos do cordão umbilical de 2 – 3 (cerca de 12 a 15 g) em um tubo de 50 mL com 15 mL de solução de tipo IA de colagenase de 0,1% (p/v) em PBS. Incube a 37 ° C, com agitação suave para 3-4 h até dissolver.</li>
	<li>Centrifugue o tecido digerido a 300 x g durante 15 min e aspire o sobrenadante. Resuspenda tecido digerido em 15 mL de temperatura PBS com 1% P/S, misture por pipetagem, centrifugar a 150 x g por 5 min e aspire o sobrenadante (lavagem). Repeti a lavagem duas vezes mais.</li>
	<li>Ressuspender lavada as células em 15 mL de temperatura PBS com 1% P/S, misture por pipetagem, estique por com filtro de célula 100 µm, centrifugar x 150 g por 5 min e aspire o sobrenadante.</li>
	<li>Preparar o meio de cultura (CM) misturando baixa glicose Dulbecco meio do modificado águia (LG-DMEM) com soro fetal bovino (FBS) e 1% P/S. esterilizar o meio por filtração.</li>
	<li>Ressuspender as células tensas em 10 mL de CM pré aquecido a 37 ° C, misture por pipetagem, transferir para um balão de cultura de tecidos de2 25 cm e incubar em 5% CO2 em 90% de umidade e 37,0 ° C. Mudança CM cada 3 dias até que a cultura atinja a confluência de 70 a 80%, quando a cultura vai ser passada.</li>
	<li>Para a passagem da cultura, Aspire CM do frasco, lavar duas vezes com 5 mL de temperatura PBS e separe com 3 mL de 0,25% ácido de tripsina/ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 37 ° C por 5 min.</li>
	<li>Neutralizar a tripsina/EDTA com 6 mL de CM pré aquecido de 37,0 ° C, misture por pipetagem, transferir para um tubo de 15 mL, centrifugar x 150 g por 5 min e aspire o sobrenadante. Resuspenda desanexadas células em 1 mL de CM, misture por pipetagem. Conte as células viáveis usando trypan azul e hemocytometer. Re-sementes para um balão de cultura de tecidos de2 25 cm em 5.000 células/cm2e incubar em 5% CO2 em 90% de umidade e 37,0 ° C.</li>
</ol>2. preparação de esferoides com UCM-MSCs cultivadas em filmes de quitosana
<ol><li>Para preparar 100 mL de solução de quitosana de 1% (p/v), adicionar 1 g de quitosana em 99 mL de água destilada (dH2O) e misture bem com um agitador magnético.</li>
	<li>Adicionar 670 µ l de ácido acético glacial e continue misturando até a quitosana dissolve-se e torna-se viscoso. Isso geralmente leva 3-4 h.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l de solução de quitosana em cada poço da placa de cultura de tecidos de 12 poços, e a placa para distribuir uniformemente o solução de quitosana e cobrir toda a superfície inferior do redemoinho.</li>
	<li>Seque a placa de solução revestida de quitosana sob fluxo laminar sem uma cobertura durante a noite por 24 h. Uma vez seco, película fina será formada e se adere à placa.</li>
	<li>Neutralizar o filme de quitosana, adicionando 1 mL de solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,5 N em cada poço e incubar durante 2 h à temperatura ambiente. NaOH de cada poço de aspirar e lavar cada bem com 1 mL de dH2O três vezes. Cada um Lave bem com 1 mL de 70% de etanol (EtOH) uma vez.</li>
	<li>Para esterilizar o filme de quitosana, adicione 1 mL de 70% EtOH em cada bem e incubar durante a noite no gabinete de fluxo laminar. No dia seguinte, Aspire EtOH restante de cada poço. Cada um Lave bem com 1 mL de PBS estéril três vezes. Esterilize o filme de quitosana com luz ultravioleta sob fluxo laminar durante a noite sem uma capa.</li>
	<li>Esferoides de formulário da UCM-MSCs, semente expandiu e passadas as células em cada poço de 5.000 células/cm2e incuba em 5% CO2 em 90% de umidade e 37,0 ° C. Nota: As células podem ser incubadas sob hipoxia ou normoxia, dependendo do interesse do investigador.</li>
</ol>3. a expressão de marcadores de superfície analisada através de citometria de fluxo
<ol><li>
Preparação de uma suspensão de célula única
	<ol>
<li>Placa padrão<ol>
<li>Remover o meio de cada poço e duas lavagens com temperatura PBS.</li>
			<li>Separe células com 500 µ l de reagente de dissociação uma célula em cada poço de uma placa de 12 para 5 a 10 min à temperatura ambiente.</li>
			<li>Após a incubação, adicionar 1 ml de tampão (PBS contendo 0,5% BSA) de coloração em cada poço e misture pipetando para destacar células.</li>
			<li>Transferi a suspensão de células em tubo cônico de 15 mL e centrifugar 150 x g por 5 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Placa de quitosana<ol>
<li>Colete todos os esferoides por meio de aspiração com uma pipeta com uma ponta de 1.000 µ l. Transferência médio coletado em um tubo cônico de 15 mL. Depois de coletar médio, lavar bem, adicionando 1 mL de PBS e transferir PBS lavado para o mesmo tubo cônico de 15 mL.</li>
			<li>Centrifugue esferoides a 150 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.</li>
			<li>Adicionar 500 µ l de reagente de dissociação de célula (por exemplo, accutase) e incube por 5 a 10 min à temperatura ambiente. Misture por pipetagem usando uma ponta de 1 mL até esferoides dissociam e não são mais visíveis.</li>
			<li>Adicione 1 mL de tampão de coloração para a suspensão de célula única e centrifugar 150 x g por 5 min.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavagem de células
	<ol>
<li>Remover o sobrenadante do tubo cónico e ressuspender as células em 3 mL de coloração reserva de frio. Manter as células no gelo durante todo o experimento desta etapa.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g por 5 min (lavagem).</li>
		<li>Lave duas vezes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloração de células
	<ol>
<li>Centrifugar a 300 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.</li>
		<li>Contagem de células viáveis usando um azul trypan e hemocytometer. Re-suspender 1 x 106 células em 50 µ l de bloqueio buffer (PBS com cavalo 10% soro) e incubam por 30 min no gelo.</li>
		<li>Adicionar 10 µ l fluoresceína isotiocianato (FITC) conjugado anticorpos (CD44, CD90, CD105, CD34, histocompatibilidade complexo (MHC) classe II ou do isotipo controle para cada anticorpo) e 40 µ l de tampão de coloração e, em seguida, incubar protegido da luz por 1h no gelo.</li>
		<li>Adicionar 3 mL de coloração reserva de frio e misture, centrifugar a 300 x g por 5 min e aspire o sobrenadante (lavagem).</li>
		<li>Repita duas vezes de lavagem.</li>
		<li>Ressuspender o sedimento celular em 0,5 mL de tampão de coloração</li>
		<li>Adicionar 5 µ l de 7-AAD (tintura de viabilidade) e incube por 30 min no gelo</li>
		<li>Analise amostras de células coradas pelo citômetro de fluxo. Excluir os detritos por sua menor SSC e FSC e identificar células viáveis com baixa absorção de 7-AAD. Lote FL1 e FL2 no e x-eixos y, respectivamente. Use o isotipo controle para criar um portão acima da linha diagonal. Medir a porcentagem de células coradas positivamente na área. Conte pelo menos 20.000 eventos/amostra (complementar a Figura 1).</li>
		<li>Medir a porcentagem de células coradas com anticorpos por retenção de células viáveis e autofluorescência e subtrair a porcentagem de células coradas com isotipo controle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. modelo de defeito bilateral do tendão patelar em ratos
<ol><li>Selecione ratos Sprague-Dawley (adultos masculinos, 4-5 meses de idade, peso corporal 350-375 g). Observe o tamanho relativamente grande dos ratos usados para este modelo.</li>
	<li>Anestesia e aplique o lubrificante do olho artificial o rato com 8% de sevoflurano em 2L/min 100% oxigênio entregue via máscara, até o desaparecimento do reflexo de pitada-dedo do pé na câmara de indução.</li>
	<li>Administre uma injeção intramuscular de Meloxicam (1 mg/kg) como analgesia preemptiva.</li>
	<li>Coloque o rato entre duas garrafas de água de 0,5 L com água morna e coberta com um pano para manter a temperatura corporal e posição, enquanto a prevenção de lesões de pele. Fita a cada extremidade da mesa. Para reduzir o risco de hipotermia, cobrir o corpo com plástico bolha (Figura 1).</li>
	<li>Manter a anestesia com fluxo contínuo de sevoflurano 5% na mistura de oxigênio 100% 1L através do cone de nariz, com o animal na prostração dorsal na almofada de aquecimento de água.</li>
	<li>Para evitar o trauma de pele, não clip os sítios cirúrgicos. Em vez disso, aplique o creme removedor do cabelo sobre ambos os reprima. Use o abaixador de língua para remover o creme e o cabelo.</li>
	<li>Esfregue o local cirúrgico com esfoliante de Digluconato de clorexidina e enxágue com etanol a 70% 3 vezes.</li>
	<li>Faça uma incisão na pele com uma lâmina de bisturi 15 # estéril no sentido proximal para distal, no aspecto craniomedial da asfixiar. Iniciar a incisão de cerca de 1 cm proximal ao nível da patela e estendê-lo a cerca de 5 mm distal ao tubérculo tibial.</li>
	<li>Refletir a pele para expor o tendão patelar, libertando o tecido subcutâneo subjacente com uma lâmina de bisturi #15.</li>
	<li>
Utilizando a lâmina de bisturi 15 #, impostos especiais de consumo o terço central da cada tendão patelar (1 mm) do aspecto distal da patela à tuberosidade da tíbia.
	<ol>
<li>Alinhe um fio de Kirschner 0.99 mm de diâmetro contra o tendão como um modelo para padronizar o tamanho do defeito em cada membro (Figura 2).</li>
		<li>Fazer 2 incisões da cheio-espessura de cada lado do fio de Kirschner com uma lâmina de bisturi 15 # para isolar a parte central do tendão (Figura 3). Ressecar a secção central proximalmente e distalmente com a tesoura de Iris fina (Figura 4).</li>
		<li>Antes de fechar a fáscia da sufocar, inserir o coágulo (suspensão de células mistas e ACP) para os grupos de tratamento adequado, conforme descrito em 5.5. Feche a fáscia com um padrão cruzado e pele com um padrão intradérmico usando 5-0 Poliglactina 910 as suturas (Figura 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita o procedimento na asfixiar contralateral. Nota: Um defeito é aleatoriamente para um tratamento (células-tronco condicionada à quitosana ou cultivadas em placas padrão). O defeito contralateral é deixado vazio, para servir como controle interno.</li>
	<li>Após a cirurgia, administrar 4 comprimidos de enrofloxacina (2 mg/comprimido, por via oral, uma vez por dia) e um comprimido de meloxicam (2 mg/comprimido, por via oral, uma vez por dia) por 7 dias. Essas doses foram recomendadas por um veterinário de animais de laboratório e aprovadas no protocolo IACUC.</li>
</ol>5. entrega do MSCs dentro o defeito do tendão patelar
<ol><li>Anestesia um rato saudável, que não é usado para criação de defeito do tendão patelar com 8% de sevoflurano em 2L/min 100% oxigênio entregado via máscara, até o desaparecimento do reflexo de pitada-dedo do pé na câmara de indução.</li>
	<li>Colete sangue 5ml por punção cardíaca de rato Sprague-Dawley anestesiado (adultos masculinos, 4-5 meses de idade, peso corporal 350-375 g), em uma seringa de 5 mL com agulha 20g contendo 1 mL de ácido-citrato-dextrose (5:1 v/v).</li>
	<li>Eutanásia o rato após punção cardíaca e coleta de sangue, por Injeção intracardíaca de pentobarbital (100 mg/kg), enquanto sob a mesma anestesia.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 350 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferir o líquido sobrenadante e armazenar (120 µ l cada) de alíquotas a-20 ° C até o uso.</li>
	<li>Imediatamente antes da implantação na vivo , descongelar a alíquota acima e misture 20 µ l com 0,5 x 106 MSCs (de 1,9 ou 3.1.2.1) retirados placas padrão usando tripsina/EDTA ou coletar de quitosana placas de rubor (com PBS/médio).</li>
	<li>Adicione 6 µ l de 10% de cloreto de cálcio (CaCl2) para os restantes 100 µ l de plasma descongelado num poço da placa de 96 poços para ativar o plasma e induzir a formação de um coágulo (ativado condicionado plasma: ACP).</li>
	<li>Misturar a suspensão de células (20 µ l) e ACP (100 µ l) para formar um coágulo (Figura 6). Coloque o coágulo dentro do tendão patelar defeito criado antes de fechar a fáscia da asfixiar (consulte a etapa 4.10.3).</li>
</ol>6. resultado funcional
<ol><li>Monitorar ratos duas vezes por dia para sinais de dor, com base no rato careta escala (RGS)37,38 e inchaço sobre os locais de implantação. Nota: Um sistema de Pontuação (0-6) foi desenvolvido para avaliar a função ambulatorial com base em 3 atividades, incluindo cronometrado membro posterior permanente com membros dianteiros suportados (0-3), cronometrado desassistida membro posterior permanente (0-2) e a capacidade de escalar um 17cm gaiola plástica (de parede (0-1) A tabela 1).</li>
	<li>Avalie as duas atividades permanentes de membro posterior de ratos de manhã e à noite de cada ponto de tempo para calcular um escore médio.</li>
	<li>Avalie os ratos para a capacidade de com êxito, escalar uma parede de gaiola plástica de 17 cm com ambas as patas chegar ao topo.</li>
</ol>7. bruto aparência e Histopatologia do tendão patelar
<ol><li>Eutanásia em ratos em 7 dias (para avaliar a inflamação) ou 28 dias (para avaliar a cicatrização tecidual) pós tratamento por Injeção intracardíaca de pentobarbital (100 mg/kg), sob anestesia com sevoflurano 8% e 100% de oxigênio de 2 L entregadas via máscara.</li>
	<li>Unidades da tuberosidade da tíbia-patela-tendão por bisturi e tesouras de colheita após eutanásia. Remova os tecidos moles e ligamentos em torno a asfixiar, exceto para o tendão patelar.</li>
	<li>Examine cada espécime de aparência bruta e espessamento do tendão (Figura 7).</li>
	<li>Oriente o espécime, colocando um cirurgião do nó de Polydioxanone 5.0 no aspecto proximal e lateral do tendão. Corrigir cada amostra em solução de formol tamponado neutro de 10% e obter secções transversais (5 µm) da porção média da cada tendão.</li>
	<li>Manche as seções usando hematoxilina e eosina e Trichrome de Masson seguindo protocolos padrão de coloração.</li>
	<li>Examine a seção para detectar a presença de hematoma dentro do defeito, bem como alterações patológicas, tais como inflamação.</li>
	<li>Avalie o resultado histológico das seções usando o sistema de Pontuação publicado anteriormente, com base no grau de colágeno, grau de angiogênese e cartilagem de formação (tabela 2)39.</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

Células de equinos foram Selecionadodas para este projeto porque pretendemos eventualmente testar abordagens de candidato na gestão de tendinopatias naturais em cavalos. De fato, lesões dos tendões em cavalos são atraentes como modelos naturais de tendinopatia no homem por causa da similaridade biológica entre os equino flexor digital superficial e tendão de Aquiles em seres humanos41. Marcadores superfície celular CD44, CD90, CD105, CD34 e MHC II foram selecionados para immunophenotyping das célu...

Lesão no tendão é uma das causas mais comuns de significativa atrofia muscular e dor em toda a espécie1. Em medicina veterinária, lesões de tendões e ligamentos são de especial interesse em cavalos, 82% de todas as lesões em cavalos de corrida envolvem o sistema músculo-esquelético, e 46% daqueles afetam os tendões e ligamentos2,3. Formação de tecido cicatricial afeta as propriedades biomecânicas dos tendões cicatrizadas e explica o prognóstico guardado para retorno ao Atlético uso após lesões dos tendões flexores; re-ferimento ocorre dentro de 2 anos em até 67% de cavalos tratados conservadoramente4. Medicina regenerativa fornece novas alternativas para uma condição que desafia os tratamentos tradicionais. Terapia de células-tronco autólogas produziu alguns animadores resultados5,6 , mas é limitada pela morbidade associada com a coleção de tecido, administração retardada devido ao processamento/reprogramação de células e a influência da Estado de saúde do paciente (tais como a idade) nas propriedades do tronco células7,8. Estas limitações fornecem uma lógica para a investigação de células-tronco alogênico como uma alternativa de prateleira. Células derivadas de seus anexos fetais são candidatos atraentes porque eles contornar as preocupações éticas e o risco de formação de teratoma associado com células-tronco embrionárias. Entre seus anexos fetais, matriz de cordão umbilical (UCM), também chamada geleia de Wharton, é abundante e fácil de coletar.
Independentemente da fonte da célula, aumentar stemness é essencial para estabelecer um banco de células para a medicina regenerativa alogênico. Do ponto de vista funcional, stemness pode ser definido como o potencial para diferenciação de auto-renovação e linhagem multi9. Provas de stemness se baseia em proliferação e diferenciação ensaios, juntamente com a expressão de genes marcadores Oct4, Sox2 e Nanog9. Uma estratégia para melhorar a stemness se baseia na utilização de biomateriais para servir como nulo enchimentos e transportadoras, realçando a proliferação e diferenciação de UCM-MSCs. Essa abordagem elimina preocupações em relação a manipulação de fatores transcricionais para reprogramar células maduras em células pluripotentes induzidas. Entre os biomateriais considerados como portadores de potenciais para as células-tronco, quitosana é atraente por sua biocompatibilidade e degradabilidade10. Este aminipolissacarídeo natural é formado por alcalina deacetilação da quitina, a segunda mais abundante polissacarídeo natural, principalmente obtida como um subproduto de marisco10. Temos anteriormente investigados interações entre MSCs e andaimes de quitosana e observou a formação de esferoides11,12,13,14,15, 16. também informamos sobre a superioridade da condrogênese em quitosana matrizes12,13,14,15,16,17, 18. Mais recentemente, dois estudos independentes descreveram formação de esferoides pelo tecido adiposo e tecido de placenta derivada MSCs cultivadas em um filme de quitosana19,20. Esta formação de esferoides não apenas reforçada stemness, mas também melhorou a retenção das células estaminais após na vivo implantação20.
A prevalência e morbidade de tendinopatia em toda espécie tem solicitado o desenvolvimento de modelos experimentais para estudar a fisiopatologia de tendinopatias e testar novas terapias tais como injeções de células-tronco. Em cavalos, tendinite induzida por colagenase é um modelo comum para demonstrar a eficácia usando MSCs no tendão reparação21. A relevância desta abordagem é limitada, como as injeções causam alterações inflamatórias agudas, Considerando que tendinopatias clínicas geralmente resultam de crônica overstrain22,23. Além disso, a indução química de doença do tendão induz uma resposta curativa e não replica o processo de cicatrização prejudicado presente em casos clínicos22,23. Excisão de um segmento do tendão flexor digital superficial tem sido descrito como um modelo cirúrgico da tendinite em cavalos24. Mais recentemente, uma abordagem minimamente invasiva foi usada para restringir o dano traumático para o núcleo central do tendão flexor digital superficial25. Modelos cirúrgicos não simular o mecanismo de fadiga que pode levar à doença natural do tendão e tendem a falta de reprodutibilidade na extensão do dano criado25. Independentemente do modelo, a morbidade e custo associado com equinos modelos do tendão doenças são limitações adicionais, que justificam o interesse em modelos de roedores como um primeiro passo na vivo avaliação de novas terapias.
Uma das principais vantagens de modelos experimentais em roedores consiste o custo e a capacidade de controlar a variabilidade inter-individual. Roedores podem ser padronizados em relação a vários fatores fisiológicos devido a suas taxas de crescimento rápido e relativamente curta expectativa de vida, limitando as fontes de variação e, portanto, reduzindo o número de animais necessários para detectar diferenças. Estratégias para induzir doenças tendão em roedores têm confiado na indução química, mas também na criação cirúrgica de tendão parcial defeitos21. Modelos cirúrgicos podem simular melhor do que os modelos químicos naturais tendinopatias, mas podem levar a maior morbidade e falha catastrófica do tendão danificado. A esse respeito, ratos parecem candidatos melhores do que os ratos para estes modelos, como seu tamanho permite a criação de defeitos maiores, facilitando a avaliação da cicatrização tecidual. Foram utilizados ratos Sprague Dawley em estudos experimentais de tendinopatias em quatro grupos principais do tendão: manguito rotador, flexor, Aquiles e tendões patelar26. Entre estes, modelos envolvendo o tendão patelar são especialmente atraentes por causa do tamanho maior deste tendão e a facilidade de acessá-lo27. O tendão patelar anexa o músculo quadríceps a tuberosidade tibial. No âmbito deste mecanismo extensor, a patela é um osso sesamoide que direciona a ação do quadríceps e delineia a extensão proximal do tendão patelar. A presença de âncoras ósseas nas extensões proximais e distais do tendão patelar facilita testes biomecânicos. Modelos envolvendo o tendão patelar normalmente dependem de defeitos cirúrgicos unilaterais, com um tendão intacto contralateral, servindo como um controle28,29. O modelo mais comum de defeito do tendão patelar envolve a excisão da porção central (1 mm de largura) do tendão patelar partir do ápice distal da patela para a inserção da tuberosidade da tíbia, enquanto o tendão patelar contralateral é deixado intacto. Medidas de resultados incluíram, histologia, testes biomecânicos não-destrutivos ou testes biomecânicos para falha, ultra-sonografia, ex vivo imagens de fluorescência, observação bruta e testes funcionais28,30 ,31. Modelos unilaterais não permitir a comparação de um tratamento proposto com tratamento conservador de lesão semelhante dentro do mesmo animal. Da mesma forma, a comparação entre os vários tratamentos requer animais separados. Um modelo bilateral seria eliminar variações inter individuais e reduzir o número de animais necessários para um estudo de32. No entanto, lesões bilaterais podem aumentar a morbidade e claudicação bilateral poderia comprometer a avaliação do tratamento. Alguns estudos relatam brevemente o uso do tendão patelar bilateral defeitos em ratos mas foco sobre os efeitos dos tratamentos, ao invés de gestão peri-operatório e morbidade do modelo33,34.
Objetivo a longo prazo do presente estudo é desenvolver uma estratégia para melhorar a sobrevivência de stemness e na vivo da UCM-MSCs destinado a transplante alogênico. Para atingir este objetivo, recentemente informamos stemness melhorada da UCM-MSCs por formação de esferoides em filme de quitosana e incubação sob ambiente hipóxico35. Essas propriedades em vitro foram associadas com melhoria propriedades biomecânicas do tendão patelar defeitos tratados com condicionado UCM-MSCs. com base nestes resultados, o modelo de defeito do tendão patelar bilateral de rato parece apropriado para testar o candidato tratamentos para lesões de tendão36. A finalidade do estudo relatado aqui é fornecer protocolos detalhados para isolamento e caracterização de UCM-MSCs, elaboração de um sistema biológico de células-tronco, criação e tratamento de defeitos de tendão patelar bilateral e pós-operatório recuperação e avaliação de cura dentro dos defeitos de tecido.

<table><tbody><tr><td>PBS 10x</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Colgenase tipo IA</td><td>Worthington</td><td>LS004197</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>DMEM baixa glicose</td><td>Hyclone</td><td>SH30021. </td><td>Soro</td></tr><tr><td>bovino fetal</td> consumível <td>FS Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina consumível 100x</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Tripsina</td></tr><tr><td>consumível 0,25%</td> <td>Hyclone</td><td>SH30042,01</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>Hyclone</td><td>SV30084.01</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Quitosana</td><td>Consumível Sigma</td><td>C3646</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td> Consumível <td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>Consumível Hyclone</td><td>SH30574.01</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Tubo de poliestireno de fundo redondo</td><td>Corning</td><td>149591A</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Rato anti-cavalo CD44 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1082F</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Rato anti-rato CD90 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA47FT</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Rato anti-cavalo MHC-II (FITC)AbD</td> <td>serotec</td><td>MCA1085F</td><td></td></tr><tr><td>Consumível Rato IgG1 (FITC) - Controle de Isotipo</td><td>AbD serotec</td><td>MCA928F</td><td></td></tr><tr><td>Consumível Rato monoclonal [SN6] a CD105 (FITC)</td><td>abcam</td><td>ab11415</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 (FITC) - Controle de Isotipo</td><td>abcam</td><td>ab91356</td><td></td></tr><tr><td>Consumível Mouse anti-humano CD34 (FITC)</td> <td>BD</td><td>BDB560942</td><td></td></tr><tr><td>Consumível Mouse IdG1 kappa (FITC)</td> <td>BD</td><td>BDB555748</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD</td><td>BDB559925</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Citômetro de Fluxo</td><td>BD</td><td></td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Vacutainer 5 mL</td><td>Med Vet International</td><td>RED5.0</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Ácido-citrato-dextrose</td><td>Sigma</td><td>C3821</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>JD Medical</td><td>60307-320-25</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Ratos</td><td>Charles River</td><td>Código de cepa: 400</td><td>Animal experimental</td></tr><tr><td>Kit cirúrgico de rato</td><td>Aparelho de Harvard</td><td>728942</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento Lâmina Cirúrgica #15</td><td>MEDLINE</td><td>MDS15115</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Rat MD's Baytril (2 mg/Comprimido), Rimadyl (2 mg/Tablet)</td><td>Bio Serv</td><td>F06801</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Polyglactin 910, 5-0</td><td>Ethicon</td><td>J436G</td><td>Consumível</td></tr><tr><td>Eosin alchol shandon</td><td>Thermo Consumível científico</td><td>de 6766007</td><td></td>científico</tr><tr><td>Harris Hematoxilina</td><td>Thermo</td><td>143907</td><td>consumível</td></tr></tbody></table>

avaliação de terapias de células-tronco em um modelo de lesão do tendão patelar bilateral em ratos

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Medicina regenerativa fornece novas alternativas às condições que desafiam os tratamentos tradicionais. A prevalência e morbidade de tendinopatia em toda a espécie, combinada com as propriedades curativas limitadas deste tecido, ter solicitado a busca de terapias celulares e impulsionou o desenvolvimento de modelos experimentais para estudar a sua eficácia. Cordão umbilical matriz-derivados mesenquimais células-tronco (UCM-MSC) são candidatos atraentes porque eles são abundantes, fácil de coletar, contornar as preocupações éticas e o risco de formação de teratoma, ainda assemelham-se a células-tronco embrionárias primitivas mais pròxima do que adulto derivado de tecido MSCs. significativo interesse centrou-se na quitosana como uma estratégia para melhorar as propriedades do MSCs através da formação de esferoide. Este papel detalhes técnicas para isolar a UCM-MSCs, preparar esferoides no filme de quitosana e analisar o efeito da formação de esferoide na expressão do marcador de superfície. Consequentemente, a criação de um modelo de lesão do tendão patelar bilateral em ratos é descrita para implantação na vivo de esferoides UCM-MSC formada-se em filme de quitosana. Nenhuma complicação foi observada no estudo em relação a morbidade, estresse crescentes efeitos, ou infecção do tecido. O escore funcional total dos ratos operados em 7 dias foi menor do que ratos normais, mas retornou ao normal dentro de 28 dias após a cirurgia. Golo de histológico da cicatrização tecidual confirmou a presença de um coágulo em defeitos tratados avaliada em 7 dias, ausência de reação de corpo estranho e progredindo cura em 28 dias. Este modelo de defeito do tendão patelar bilateral controla variação inter-individual, através da criação de um controle interno em cada rato, foi associado com morbidade aceitável e permitiu a deteção das diferenças entre os tendões não tratados e tratamentos.

No estudo atual, os resultados são apresentados como média ± DP (desvio padrão). As células foram isoladas a partir do cordão umbilical de 6 mares e porcentagem de linhas de células isoladas expressando cada marcador de superfície celular sob condicionamento standard ou quitosana foram comparados com um teste de Friedman, como uma análise de variância não-paramétrica com repetidas medidas. Para a criação de modelo de defeito do tendão, 8 ratos foram utilizados para avaliação de pós-operat...

Este paper descreve a preparação e avaliação do cordão umbilical células-tronco mesenquimais derivadas de matriz de esferoides com um modelo de defeito bilateral do tendão patelar em um rato. Este modelo foi associado com uma morbilidade aceitável e foi encontrado para detectar diferenças entre tendões tratados e não tratados e entre os dois tratamentos testado.

Avaliação de terapias de células-tronco em um modelo de lesão do tendão patelar Bilateral em ratos

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Os objetivos gerais deste modelo bilateral de ratos são otimizar o uso de animais e avaliar os candidatos ao tratamento para defeitos tendinosos. Este método pode ajudar a responder a quaisquer perguntas-chave no campo ortopédico. Como a avaliação da terapia celular na tendinopatia.A principal vantagem desse modelo é que ele controla a variação interindividual, reduzindo assim o número de animais necessários para detectar diferenças entre os tratamentos. A demonstração visual do modelo é crítica porque a criação de defeitos bilaterais padronizados do tendão patelar em ratos é difícil de aprender. O modelo requer um bom conhecimento da anatomia local, fortes habilidades cirúrgicas básicas e precisão ao trabalhar em pequenas estruturas.Para começar, lave um cordão umbilical equino colhido duas vezes em um tubo de 50 mililitros usando PBS em temperatura ambiente contendo antibióticos. Em seguida, transfira o tecido para uma placa de 150 milímetros e corte-o em fragmentos de duas polegadas de comprimento. Em seguida, transfira os fragmentos para um tubo de 50 mililitros e lave-os com PBS contendo antibióticos para remover o sangue.Faça isso duas ou três vezes em temperatura ambiente. Em seguida, corte as partes fragmentadas do cordão umbilical longitudinalmente para expor os vasos que percorrem seu comprimento. Usando fórceps e tesouras, remova esses vasos, que incluem duas artérias e uma veia.Agora, a partir de dois ou três fragmentos, colete a matriz gelatinosa ao redor dos vasos. Raspe-o com um bisturi. Em seguida, pique a matriz gelatinosa, também conhecida como Jelley de Wharton, em pedaços finos.Em seguida, transfira a geléia para um tubo de 50 mililitros com 15 mililitros de 0,1% de colagenase tipo 1A em PBS e incube o tecido a 37 graus Celsius com agitação suave por três a quatro horas até que esteja completamente dissolvido. Em seguida, centrifugue o tecido digerido e aspire o sobrenadante. Agora, suspendemos o tecido digerido em 15 mililitros de PBS e misturamos por pipetagem.Em seguida, repita esta lavagem com PBS três vezes usando uma centrifugação mais lenta. Após a última lavagem, ressuspenda as células em 15 mililitros de PBS e, em seguida, use um filtro de células de 100 mícrons para filtrar as células e centrifugue por cinco minutos a 150 vezes g para coletar as células. Ressuspenda as células em 10 mililitros de meio de cultura recém-feito a 37 graus Celsius.Transferir a suspensão para um balão de cultura de 25 centímetros quadrados e incubar as células, mudando o meio de três em três dias. Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, passe-as, aspire o meio e lave as células duas vezes com PBS em temperatura ambiente sem antibióticos. Em seguida, use três mililitros de 0,25% de tripsina edta para separar as células.Termine a reação com uma adição de seis mililitros de meio quente. Colete as células suspensas e pegue-as. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um mililitro de meio.Para completar a passagem, semeie novamente um frasco de cultura de tecidos com 5.000 células por centímetro quadrado e continue cultivando a cultura. Para começar, prepare uma solução de quitosana fresca. Em seguida, carregue cada poço de uma placa de 12 poços com 500 microlitros de solução.Gire a placa para distribuir a solução por todas as superfícies. Em seguida, seque a placa sob um gabinete de fluxo laminar. Após 16 a 24 horas, uma fina película de quitosana se formará nos poços da placa.Neutralize este filme adicionando um mililitro de hidróxido de sódio normal 0,5 a cada poço. Em seguida, incube a placa por duas horas em temperatura ambiente. Posteriormente, aspire o hidróxido de sódio de cada poço e lave cada poço com um mililitro de água destilada.Execute três lavagens com água e lave cada poço com um mililitro de etanol 70% uma vez. Depois de remover a lavagem com etanol, substitua-a por outro mililitro de etanol a 70% e incube a placa durante a noite em um gabinete de fluxo laminar para esterilizar o filme de quitosana. Então, no dia seguinte, aspire o etanol restante de cada poço e lave cada poço com PBS três vezes.Remova o PBS e esterilize ainda mais o filme de quitosana usando uma exposição direta durante a noite à luz ultravioleta sem a tampa. Agora, para formar esferóides de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical, semeie os poços com 20.000 células e incube a placa em condições normais ou hipóxicas. Coloque um rato anestesiado entre duas garrafas de 0,5 litro cheias de água morna e cubra as garrafas com um pano para manter o rato aquecido sem sofrer lesões na pele.Para reduzir o risco de hipotermia, cubra o corpo com plástico bolha. Em seguida, para evitar traumas na pele, aplique creme removedor de pelos sobre os dois joelhos e use um abaixador de língua para remover o creme e os pelos. Em seguida, cole cada membro na mesa.Agora, esfregue o local da cirurgia com digluconato de clorexidina e enxágue com etanol a 70%. Faça isso três vezes e prossiga com a cirurgia. Com um bisturi número 15 estéril, incisar a pele na direção proximal a distal na face medial cranial do joelho.Inicie a incisão cerca de um centímetro proximal ao nível da patela e estenda-a aproximadamente cinco milímetros distalmente ao tubérculo tibial. Em seguida, libere o tecido subcutâneo subjacente com o bisturi e reflita a pele para expor o tendão patelar. Agora, alinhe um fio de kirschner de 0,99 milímetro de diâmetro contra o tendão patelar entre a face distal da patela e a tuberosidade tibial.Em seguida, mantendo o fio estável, use o bisturi para fazer incisões em ambos os lados do fio, liberando uma porção do tendão com cerca de um milímetro de largura. Em seguida, ressece a seção central proximal e distalmente usando uma tesoura de íris fina. Paralelamente, peça a um assistente que prepare o coágulo.Para fazer isso, descongele a amostra de plasma e misture 20 microlitros com meio milhão de células-tronco mesenquimais. Em seguida, em um tubo de microcentrífuga, misture seis microlitros de cloreto de cálcio a 10% com 100 microlitros de plasma descongelado, isso ativará esse plasma. Em seguida, misture a suspensão celular no plasma ativado, isso fará com que o plasma coagule.Agora, coloque o coágulo preparado dentro do defeito do tendão patelar. Limite a manipulação do coágulo para minimizar a liberação de fluido do coágulo. Em seguida, usando cinco suturas de poliglactina nove 10, feche cuidadosamente a fáscia com um padrão cruzado sem interferir no coágulo.Finalize fechando a pele com um padrão intradérmico. As células foram isoladas dos cordões umbilicais de seis éguas e cultivadas em condições padrão ou em filmes de quitosana. As células cultivadas em quitosana formaram esferoides.O modelo de defeito do tendão patelar foi testado em muitos ratos e uma bateria de testes comportamentais foi usada para estimar a recuperação. Aos 28 dias de pós-operatório, os ratos haviam retornado à força basal após um déficit inicial de força medido sete dias após a cirurgia. Após o exame histológico com coloração tricrômica de Masson, observou-se infiltração arterial e capilar moderada, juntamente com formação de colágeno moderada a extensa, enquanto a formação de cartilagem não foi suportada.No geral, o modelo bilateral de defeito do tendão patelar limita a variação interindividual sem morbidade significativa. Assim, reduzindo o número de animais necessários para testes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar um modelo de defeito bilateral da janela do tendão patelar de ratos e como os ratos se recuperam dessa cirurgia.Uma vez dominado, o procedimento pode ser feito em menos de 30 minutos com três investigadores. O primeiro investigador prepara a célula, o segundo realiza a cirurgia, enquanto o terceiro auxilia na cirurgia e monitora a anestesia. Após esse procedimento, métodos como testes biomecânicos, histologia e imuno-histoquímica podem ser utilizados para comparar o efeito do tratamento na cicatrização do tendão.

evaluation-stem-cell-therapies-bilateral-patellar-tendon-injury-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Uma técnica experimental para o tratamento de defeitos osteocondrais na articulação do joelho do coelho é descrito. A implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para defeitos osteocondrais proporciona um desenvolvimento promissor no campo da engenharia de tecidos. A preparação de fibrina de...

Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

Este protocolo descreve a radiomarcação de células-tronco mesenquimais equinas e sua implantação em lesões tendinosas no cavalo, a fim de determinar a sobrevivência celular e a distribuição tecidual usando cintilografia gama.

In Vivo Imaging and Rastreamento de Tecnécio-99m Rotulado de Medula Óssea Células-Tronco Mesenquimais em Equine Tendinopatia

Modelos animais são ferramentas importantes para a avaliação de enxertos de engenharia tecidual. Este trabalho apresenta o protocolo de preparação de um enxerto de polímero biodegradável eletrofiado para uso na engenharia de tecidos do ligamento cruzado anterior, bem como um protocolo cirúrgico para implantação em modelo de rato.

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

Descrevemos um protocolo in vivo para medir a dorsiflexão do pé após estimulação do nervo fibular e contração do compartimento crural anterior do membro posterior do rato. Essas medições são uma ferramenta translacional indispensável para avaliar a patologia do músculo esquelético e as abordagens de engenharia de tecidos para reparo e regeneração muscular.

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Este protocolo descreve o processo de avaliação de cura os tendões em ratos que foram injetados com plasma rico de alogênico plaquetas (PRP) ou solução salina após a remoção de parte do tendão de Aquiles. O progresso da cicatrização do tendão é avaliado em vários pontos de tempo usando diferentes tipos de análises.

Efeitos de alogênico Plasma rico em plaquetas (PRP) sobre o processo de cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados de ratos: uma descrição metodológica

Um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional é um bioreator ideal para diferenciação tenogênica específica de células-tronco derivadas do tendão e formação de neo-tendões.

Aplicando um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional para induzir a diferenciação tenogênica de células-tronco derivadas do tendão

Este protocolo estabelece um modelo de defeitos de cartilagem de espessura total (FTCD) através da perfuração de orifícios no sulco troclear femoral de ratos e mensuração do comportamento da dor e alterações histopatológicas subsequentes.

Desenvolvimento e Avaliação de um Modelo de Defeitos Cartilaginosos em Rato

Este estudo detalha os procedimentos para o estabelecimento de uma lesão crônica do manguito rotador (MR) de coelhos. Especificamente, a lesão é criada na unidade músculo-tendão/miotendíneo subescapular (SSC) para mimetizar a anatomia e fisiopatologia do MR humano, incluindo degeneração gordurosa muscular (DF) grave. Este protocolo pode ser aplicado para estudar lesões do MR e avaliar terapias regenerativas.

Desenvolvimento de um modelo de lesão crônica do manguito rotador de coelhos para estudo de fibrose e degeneração gordurosa muscular

Aqui, apresentamos um sistema modelo assemblóide para mimetizar o crosstalk celular do tendão entre o tecido central do tendão que suporta carga e um compartimento extrínseco contendo populações celulares ativadas por doença e lesão. Como um importante caso de uso, demonstramos como o sistema pode ser implantado para sondar a ativação de células endoteliais extrínsecas relevantes para a doença.

Engenharia de Assemblóides de Tendão para Sondar Crosstalk Celular em Doenças e Reparos

Um modelo do rato de No Utero Transplante

Aprenda a avaliar terapias com células-tronco em um modelo bilateral de lesão do tendão patelar em ratos. Este método controla a variação interindividual e reduz o número de animais necessários para detectar diferenças entre tratamentos ortopédicos.

Avaliação de terapias de células-tronco em um modelo de lesão do tendão patelar Bilateral em ratos

Explorar mais vídeos