Name: DNA-magnético partícula análise por dispersão de luz dinâmica e eletroforético de vinculação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprenda a analisar a ligação de DNA a partículas magnéticas usando dispersão de luz dinâmica e eletroforética. Este método permite visualizar mudanças no tamanho, polidispersidade e potencial zeta das partículas.

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1. síntese de nanopartículas magnéticas <ol><li>síntese de nanopartículas magnéticas estabilizado com citrato (MNPs) <ol><li>Adicionar 20 mmol de FeCl 3 &#8729; 6 H 2 O (g 5,406) e 10 mmol de FeCl 2 &#8729; 4 H 2 O (g 1,988) em 20 mL de água bidestilada venoso (água de ddd). Celeuma obtida solução vigorosamente no béquer sob atmosfera 2 N, utilizando um agitador mecânico, até à obtenção de uma solução transparente.</li>
		<li>Sob agitação mecânica rápida, adicionar 150 mL de 1 M NH 4 OH, gota a gota usando funil (tomar 1 h ou mais se necessário). Transferi a solução para um navio screwable depois todos NH 4 OH é adicionado. Dane-se a solução de navio e calor a 75 ° C por 30 min. 
		Cuidado: NH 4 OH é classificado como corrosivo e perigoso para o ambiente. 
		Nota: Preparar a solução de NH 4 OH de alto grau 28% NH 4 OH em água usando água pobre em oxigênio.</li>
		<li>Recolher o precipitado preto usando o ímã e lavagem usando 100 mL de água de ddd. Repeti 3 vezes. Adicione 50 mL de 0,5 M dihidrato de citrato tri-sódico para precipitar. Dane-se o navio. 
		Nota: Usar solução venoso de dihidrato de citrato de sódio-tri.</li>
		<li>Re-dispersar o precipitado via sonication (35 kHz, amplitude de 100%) e vaso de calor a 80 ° C, durante 1 h. 
		Nota: Um sonicador de alimentação suficiente é necessária.</li>
		<li>Deixe arrefecer o solução à temperatura ambiente. Recolher o precipitado usando um ímã e remover o sobrenadante. Re-dispersar lama negra em 50 mL de água ddd usando sonicador (35 kHz, amplitude de 100%).</li>
		<li>Transferir alíquotas (~ 25 mL) em tubos de centrífuga de 50 mL e adicionar 20 mL de acetona. Centrifugar a 2400 x g durante 10 minutos e remover os sobrenadantes.</li>
		<li>Re-dispersar precipitado e Dialize solução contra água utilizando dispositivo de diálise de corte baixo peso molecular (500-1.000 Da) de volume adequado para 24 h. 
		Nota: Preparar o aparelho de diálise, de acordo com o fabricante &#39; requisitos de s.</li>
	</ol></li> <li>Síntese de nanopartículas magnéticas modificadas com o polyethylenimine de cadeia ramificado (MNPs_PEI) <ol><li>Adicionar 2 mL de solução de MNPs obtida (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. 38 ml de água do ddd e proceda à sonicação (35 kHz, amplitude de 100%) a suspensão (10 min).</li>
		<li>Sob agitação mecânica rápida, adicionar 10 mL de 10% ramificado o polyethylenimine (média de 25 kDa). Agitar a solução para posterior h. 3</li>
		<li>Coletar precipitar usando o ímã e remove o sobrenadante. Re-disperse o precipitado em 20 mL de água de ddd. Repita 5 vezes, em seguida, proceda à sonicação a suspensão final (35 kHz, amplitude de 100%).</li>
	</ol></li> <li>Síntese de nanopartículas magnéticas partículas modificado com sílica (MNPs_TEOS) <ol><li>Adicionar 10 mL de solução de MNPs obtida (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. Adicione 60 mL de água e 130 mL de etanol. Proceda à sonicação solução e adicione 6 mL de 28% NH 4 OH.</li>
		<li>Sob agitação mecânica rápida, adicionar 1 mL de orthosilicate tetraetila. Agitar a solução para posterior h. 12</li>
		<li>Recolher precipitado preto usando o ímã e lavá-lo usando 50 mL de etanol (3 vezes) e 50 mL de água (3 vezes). Re-dispersar partículas em 10 mL de ddd de água e proceda à sonicação a suspensão (35 kHz, amplitude de 100%).</li>
	</ol></li> <li>Síntese de nanopartículas magnéticas modificadas com grupos aminoácidos (MNPs_APTES) <ol><li>Adicionar 5 mL de solução de MNPs_TEOS obtida (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. Adicione 45 mL de água e 50 mL de etanol. Proceda à sonicação solução (35 kHz, amplitude de 100%).</li>
		<li>Sob agitação mecânica rápida, adicionar 0,5 mL de triethoxysilane (3-aminopropil). Agitar a solução para posterior h. 3</li>
		<li>Recolher precipitado preto usando o ímã e lavá-lo usando 50 mL de etanol (3 vezes) e 50 mL de água (3 vezes). Re-dispersar partículas em 5 mL de ddd de água e proceda à sonicação a suspensão (35 kHz, amplitude de 100%).</li>
	</ol></li></ol> 2. Síntese de micropartículas magnéticas <ol><li>síntese de micropartículas magnéticas estabilizado com citrato (MMPs) <ol><li>Adicionar 25 mL de 2m KNO 3, 12,5 mL de 1m KOH e 205,875 mL de água ddd dentro de um vaso screwable. Adicione 6,675 mL de 1m Filipa 4 durante agitação magnética. Navio de transferência imediatamente para um banho de água pré-aquecida (90 ° C) por 2 h. 
		Nota: Preparar soluções KOH em ddd e KNO 3 água.</li>
		<li>Deixe arrefecer o solução à temperatura ambiente. Recolha o precipitado preto usando o ímã e lavagem com 50 mL de água de ddd (5 vezes). Adicione 50 mL de 0,5 M dihidrato de citrato tri-sódico para precipitar. Dane-se o navio.</li>
		<li>Redisperse o precipitado via sonication (35 kHz, amplitude de 100%) e vaso de calor a 80 ° C para o precipitado de preto coletar 1 h., usando o ímã e lavagem com 50 mL de água de ddd (10 vezes).</li>
		<li>Modificar MMPs com o polyethylenimine de cadeia ramificado (MMPs_PEI), sílica (MMPs_TEOS) e grupos aminoácidos (MMPs_APTES), semelhantes ao protocolo MNPs. Consulte seções 2.2, 2.3 e 2.4, respectivamente, para mais detalhes.</li>
	</ol></li> <li>Síntese de micropartículas magnéticas modificadas com o polyethylenimine de cadeia ramificado (MMPs_PEI) <ol><li>Adicionar 5 mL de solução de MMPs (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. 38 ml de água do ddd e proceda à sonicação a solução (35 kHz, amplitude de 100%, 10 min). Sob agitação mecânica rápida Adicione 10 mL de 10% ramificado o polyethylenimine (média de 25 kDa). Agitar a solução para posterior h. 3</li>
		<li>Recolher precipitado usando um ímã e remover o sobrenadante. Redisperse precipitado em 20 mL de água bidestilada. Repita 5 vezes, em seguida, proceda à sonicação a solução final (35 kHz, amplitude de 100%).</li>
	</ol></li> <li>Síntese de micropartículas magnéticas modificadas com sílica (MMPs_TEOS) <ol><li>Adicionar 5 mL de solução de MMPs (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. Adicione 60 mL de água e 130 mL de etanol. Proceda à sonicação suspensão (35 kHz, amplitude de 100%) e adicione 6 mL de 28% NH 4 OH.</li>
		<li>Sob agitação mecânica rápida, adicionar 1 mL de orthosilicate tetraetila. Agitar a solução para posterior h. 12</li>
		<li>Recolher precipitado preto usando um ímã e lavá-lo usando 50 mL de etanol (3 vezes) e 50 mL de água (3 vezes). Redisperse partículas em 5 mL de água ddd e proceda à sonicação a suspensão (35 kHz, amplitude de 100%).</li>
	</ol></li> <li>Síntese de micropartículas magnéticas modificadas com grupos aminoácidos (MMPs_APTES) <ol><li>Adicionar 3 mL de solução de MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. Adicione 45 mL de água e 50 mL de etanol. Proceda à sonicação a suspensão (35 kHz, amplitude de 100%).</li>
		<li>Sob agitação mecânica rápida, adicionar 0,5 mL de triethoxysilane (3-aminopropil). Agitar a solução para posterior h. 3</li>
		<li>Recolher precipitado preto usando o ímã e lavá-lo usando 50 mL de etanol (3 vezes) e 50 mL de água (3 vez). Redisperse partículas em 3 mL de água ddd e proceda à sonicação a suspensão (35 kHz, amplitude de 100%).</li>
	</ol></li></ol> 3. Magnético das partículas tamanho análise usando DLS <ol><li>tamanho de partícula em água <ol><li>uso um DLS instrumento que se aplica a um ângulo de detector de dispersão traseira (173 °) e um comprimento de onda do feixe de 633 nm. 
		Nota: Dispersão traseira DLS é adequado para amostras concentradas onde múltiplo espalhamento pode ser evitado. Dispersão de lado (ângulo 90° do detector) e espalhamento frontal (15° de ângulo de detector) DLS são adequados para partículas menores e misturadas partículas, respectivamente.</li>
		<li>Prévio para medição de água, proceda à sonicação partículas de 3 min. 
		Nota: Use uma solução diluída de partículas. Para este efeito, misture 9,6 µ l de partículas com 96 µ l de água.</li>
		<li>Cuidadosamente pipete 50 µ l de solução de partículas de látex de poliestireno cubetas e evitar a formação de bolhas. 
		Nota: Para cada amostra, use cubeta descartável (ver tabela de materiais).</li>
		<li>Observe a clareza da cubeta e a direção do feixe de luz. Insira o celular no porta-amostras e fechar a câmara.</li>
		<li>Use os seguintes parâmetros para medição: temperatura: 25 ° C; índice de refração da fase dispersiva (ferro): 2.344; índice de refração do ambiente dispersivo (água): 1.333 
		Nota: Realizar a medição do índice de refração usando um refratômetro para resultados mais precisos, especialmente quando o desenvolvimento de materiais de romance ou híbrido.</li>
	</ol></li></ol> 4. Preparação de DNA Stock, partículas magnéticas e Binding Buffer <ol><li>estoque de DNA <ol><li>uso buffer de 10 mM Tris-HCL (pH = 8) para diluição e armazenamento de DNA. Use uma padrão de DNA que pode ser amplificada especificamente com um protocolo PCR direto no laboratório (consulte a seção 5.2 para configurações de reação e condições). Para amplificar a 498 pares de base (PB) do gene da xis de controle de bacteriófago λ, use os seguintes primers. Encaminhar a cartilha: 5 &#39; - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Reverter a primeira demão: 5 &#39; - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 &#39;</li> <li>produto PCR purificar através do kit de purificação de DNA comercial. 
		Nota: Rendem de jogos comerciais usando o procedimento baseado em coluna de sílica &#62; 100 ng / µ l purificado DNA.</li>
		<li>Medida de concentração de DNA utilizando o método espectrofotométrico (absorvância a 260 nm). Diluir o estoque de DNA de 11 10 cópias / µ l, conforme as instruções acima para soluções de trabalho de 10 10, 10 9, 10, 8 e 10 7 cópias / µ l. 
		Nota: O número de cópias do produto do PCR pode ser calculado de acordo com a seguinte equação, supondo que o peso molecular médio é de 650 Da cada BP: cópias de DNA / µ l = (quantidade em ng / µ l * 6.022x10 23 cópias/mol) / (498 bp * 650 g/mol de bp * 1 x 10 9 ng/g)</li></ol></li> <li>partículas magnéticas <ol><li>permitem que as partículas de sedimentos sem o ímã e remover o sobrenadante. Misture 01:20 relação v/v das partículas magnéticas com água ddd (partículas: água). 
		Nota: Abordagem baseada em Volume é usada para descrever as quantidades de partículas magnéticas, desde massas iguais de MNPs e MMPs eram prontamente difícil comparar.</li>
	</ol></li> <li>Binding buffer de <ol><li>para a rápida preparação da solução de HCL de acetato de sódio 0,75 M (pH = 6), misturar 1 mL de acetato de sódio 3M com 3 mL de HCL de 1 mM. 
		Nota: Todas as soluções utilizadas na ligação podem ser armazenadas em 4 ° C. Observe que baixa temperatura aumenta significativamente a ligação, particularmente no caso de solução de etanol. Controlar cuidadosamente a temperatura de soluções para melhor reprodutibilidade e precisão da despistagem.</li>
	</ol></li></ol> 5. Teste de eficiência de DNA isolamento usando PCR quantitativo <ol><li>isolamento de DNA modificado MMPs ou MNPs <ol><li>usar uma placa de 96 poços e um ímã personalizado para placa de 96 poços para experimentos de pequeno volume.</li>
		<li>Usar a mistura de solução de ligação seguintes: 8 µ l modificado MMPs ou MNPs, 10 µ l de acetato de sódio-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µ l de 85% de etanol, 10 µ l de DNA (10 10 cópias solução).</li>
		<li>Mix bem pipetando e coloque a placa sobre o ímã por 3 min. Enquanto a placa é o imã, remover a solução e adicionar 100 µ l de 85% de etanol para lavar.</li>
		<li>Remover etanol. 
		Nota: Permitir que o etanol secar por alguns segundos, mas não deixe que as partículas excessivamente seco ou mostrar rachaduras. Se as partículas excessivamente seca eles serão difíceis de dissolver com solução de eluição.</li>
		<li>Remover a placa de ímã e adicionar 40 µ l de solução de eluição. Misture bem por pipetagem. Coloque a placa de volta sobre o ímã e coletar DNA eluted (~ 37 µ l). Armazenar o eluente a-20 º C até uma análise mais aprofundada.</li>
	</ol></li> <li>PCR quantitativo <ol><li>usar os primers que foram usados para preparar o estoque DNA na etapa 4.1.1 quantificar cópias do gene xis, de acordo com o protocolo por Haddad et al. 10</li> <li>preparar a solução de mistura de mestre de acordo com a quantidade de amostras a serem testadas e, em seguida, distribua a mistura em cadeia da polimerase ou uma placa de 96 poços de fundo branco.</li>
		<li>Utilizar as seguintes quantidades para um volume total da mistura PCR 20 µ l: polymerase de 10 µ l / intercalante mistura de corante (ver tabela de materiais), 2 µ l da amostra DNA, 2 µ l para a frente da primeira demão (10 µM), 2 µ l inversa da primeira demão (10 µM)</li>
		<li>Configurar o thermocycler de acordo com o seguinte programa: 95 ° C por 120 s, 40 ciclos (95 ° C por 15 s, 64 ° C por 15 s, 68 ° C por 45 s), 68 ° C por 5 min.</li>
		<li>Usando triplica para padrões e amostras, calcular o limiar de ciclo e construir uma curva padrão para estimar o número de cópias de DNA obtida em cada amostra. O instrumento utilizado aqui isso executa automaticamente.</li>
		<li>Aqui, o número de cópias de DNA é estimado para o volume total de eluição (~ 40 µ l). Porcentagem de DNA obtida, correspondente à quantidade original adicionada à solução (totalmente 10 11 cópias) de vinculação pode variar além do intervalo de 0 a 100.</li>
	</ol></li></ol> 6. DLS usando vinculação de análise de DNA-magnético partículas <ol><li>Ligação de DNA <ol><li>para grande volume de experimentos (em tubo de 1,5 mL), use a seguinte mistura de solução de vinculação: 96 µ l modificado MMPs ou MNPs, 120 µ l de acetato de sódio-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µ l de 85% de etanol, 120 µ l de DNA (10 10 cópias solução) ou 120 µ l-tampão Tris HCL (10 mM, pH = 8) para controle.</li>
	</ol></li> <li>Análise de potencial zeta <ol><li>Prepare duas soluções de ligação com o DNA e outro com tampão Tris-HCL para controle conforme instruído na etapa 6.1.1. Para evitar a formação de bolhas, cuidadosamente Pipetar 800 µ l da mistura de ligação para um celular descartável. 
		Nota: Use cubeta descartável para a medição de superfície zeta potencial (ver tabela de materiais).</li>
	</ol></li> <li>Use os seguintes parâmetros para medição no instrumento DLS: Smoluchowski modelo com um F(ka) de 1.5, temperatura: 25 ° C, índice de refração da fase dispersiva (ferro): 2.344, índice de refração do ambiente dispersivo (água): 1.333. 
	Nota: A taxa de interação de partículas magnéticas-DNA afeta diretamente a medição de repetições. Uma única medida pelo instrumento leva 60-70 s. Aqui, o instrumento foi instruído a tirar 10 medidas com 1 min intervalos de atraso. Para manter a simplicidade, o resultado será mostrado na tempo = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18 min da primeira leitura.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste protocolo, os princípios teóricos que explicam o emperramento do ADN para partículas magnéticas através de potencial zeta foram em questão. O protocolo descreve a síntese e modificação de nanopartículas magnéticas e micropartículas. Método para a preparação da solução de controle e vinculação de DNA também são descritos. Duas estratégias são mostradas aqui para triagem de interações DNA-partícula: PCR quantitativo e DLS se aproxima. DLS fornece três indicadores de alterações físico-químicas em partículas: granulome...

Isolamento do DNA é um dos passos mais importantes em biologia molecular. O desenvolvimento de métodos de extração de ácido nucleico tem grande impacto sobre os campos emergentes da genómica, metagenômica, epigenética e transcriptomics. Há uma ampla gama de aplicações biotecnológicas para isolamento de DNA, incluindo médicos (ferramentas forenses/diagnóstico e prognósticos biomarcadores) e aplicações ambientais (biodiversidade metagenomic, prevalência do patógeno e vigilância). Tem havido crescente demanda para purificar e isolar o DNA de diferentes materiais e em diferentes escalas tais como sangue, urina, solo, madeira e outros tipos de amostras. 1 , 2 , 3 , 4
E micropartículas nanométricas são apropriadas para isolamento de DNA devido à sua elevada área superficial e, em especial quando eles podem ser imobilizados por um campo magnético. Propriedades físico-químicas de partículas, tais como tamanho ou carga, grandemente podem influenciar a sua capacidade de biomoléculas alvo. 5 para aumentar ainda mais a vinculação de biomoléculas e estabilizar as partículas, as modificações químicas diferentes (revestimentos de superfície) podem ser utilizadas. As muitas estratégias diferentes para ligação são classificadas de acordo com interações não covalentes e covalentes. 6 o tamanho das partículas afeta diretamente suas propriedades de magnetização, Considerando que a composição da partícula pode ser costurada por incorporação de metálico, ligas ou outros materiais que podem influenciar a sua densidade, porosidade e superfície. 7 não há nenhuma maneira confiável para medir a carga superficial das partículas pequenas. Em vez disso, o potencial elétrico no plano de escorregamento (alguma distância longe da superfície de nanopartículas) pode ser medido. 8 este valor é chamado de zeta potencial e é uma ferramenta potente que geralmente é utilizada para avaliação da estabilidade de nano - e micropartículas através de DLS. 9 desde que seu valor é altamente dependente não só o pH e força iônica do meio ambiente dispersivo, mas também sobre as características de superfície das partículas, pode também provar as alterações nesta superfície causado pela interação entre o partículas e moléculas de interesse. 10
Por outro lado, a estrutura do DNA em condições desidratado (forma A-DNA) exposições compactado conformações que facilitam sua precipitação (agregação) quando comparado ao comumente ocorrendo formulário B-DNA. Eletrostática (iônica e ligação-H) são as principais forças controlando a ligação do DNA a outros materiais devido à sua estericamente acessível fosfato e bases nitrogenadas (particularmente a guanina). 7 , 10
Neste trabalho, analisam-se três modificações químicas representativas de nanopartículas magnéticas e micropartículas (figura 1A). São descritos o método de síntese e modificação química de nanopartículas e micropartículas. Uma solução de ligação, que acordos de princípios teóricos da precipitação do DNA (pH, força iônica e desidratação), é usada para avaliar a eluição e vinculação de DNA. PCR quantitativo é usado para avaliar a eficiência de eluição do DNA do representante nanopartículas e micropartículas (figura 1B). Granulometria, índice de polidispersividade e potencial zeta são importantes parâmetros que são usados para visualizar as alterações físico-químicas que ocorrem na superfície da partícula (Figura 1). É importante ressaltar sobre a caracterização química de superfície de partícula magnética. Enquanto esta etapa foi para além do âmbito do presente protocolo, várias técnicas modernas podem ser aplicadas para investigar a eficiência de modificações químicas. 11 , 12 , 13 , 14 a espectroscopia no infravermelho (FTIR) transformada de Fourier pode ser usada para avaliar o espectro infravermelho de superfície de partícula e compará-lo com o espectro de modificadores químicos livre. Espectroscopia de fotoelétron de raios x (XPS) é outra técnica que pode ser usada para identificar a composição elementar da superfície do material. Outros métodos eletroquímicos, microscópicos e espectroscópicos podem ser usados para lançar a luz sobre a qualidade da síntese de partículas. Este trabalho destaca uma nova perspectiva de análise de DNA-magnético interações de partículas via DLS.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de ferro (III) hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207926</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Cloreto de ferro (II) tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Sulfato de ferro (II) heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Penta</td><td>10060-11000</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Citrato de sódio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Ortossilicato de tetraetila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131903</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr> <tr><td>(3-aminopropil) trietoxissilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Polietilenimina, ramificada, média Mw ~ 25.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228-M&nbsp;</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Penta</td><td>71250-11000</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Nitrato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6083</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05012</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>membrana de corte de peso molecular (Mw = 1 kDa)</td> <td>Laboratórios de espectro</td><td>G235063</td><td>Síntese</td></tr> <tr><td>de partículas magnéticasAgitador suspenso</td><td>com Labortechnik GmbH</td><td>DH. WOS01035</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Memmert GmbH + Co.</td><td>84198998</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>795</td><td>Síntese de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>MARCA Cubeta UV micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759200-100EA</td><td>Cubeta para medição de tamanho</td></tr><tr><td>Tampa da MARCA para cubeta UV micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759240-100EA</td><td>Tampas de cubeta para medição de tamanho</td></tr><tr><td>Dobrado Capilar Zeta Cell</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td>Cubeta para medição de potencial zeta</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>Dispositivo para medição de tamanho e potencial zeta</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO Instrumento NanoQuant</td><td>Tecan</td><td>396 227 V1.0, 04-2010</td><td>dispositivo para medição da concentração de DNA</td></tr><tr><td>SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QR0100</td><td>Kit de PCR</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S instrumento</td><td>Eppendorf</td><td>6325 000.013</td><td>Termociclador</td></tr><tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>kit de purificação de DNA</td></tr><tr><td>acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td>ligação de DNA</td></tr></tbody></table>

dna-magnético partícula análise por dispersão de luz dinâmica e eletroforético de vinculação

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolamento de DNA utilizando partículas magnéticas é um campo de grande importância na pesquisa de biotecnologia e biologia molecular. Este protocolo descreve a avaliação de partículas magnéticas-DNA ligação via difusão dinâmica da luz (DLS) e espalhamento de luz eletroforético (ELS). Análise por DLS fornece informações valiosas sobre as propriedades físico-químicas das partículas, incluindo o tamanho de partícula, polidispersividade e potencial zeta. O último descreve a carga superficial da partícula que desempenha papel importante na ligação eletrostática de materiais tais como o DNA. Aqui, uma análise comparativa explora três modificações químicas de nanopartículas e micropartículas e seus efeitos sobre a ligação do DNA e eluição. Modificações químicas por ramificada o polyethylenimine, tetraetila orthosilicate e (3-aminopropil) triethoxysilane são investigados. Desde que o DNA apresenta uma carga negativa, espera-se que potencial zeta de superfície de partícula irá diminuir a ligação do DNA. Formação de clusters deve também afetam o tamanho de partícula. Para investigar a eficiência dessas partículas isoladamente e eluição do DNA, as partículas são misturadas com DNA em pH baixo (~ 6), alta força iônica e ambiente de desidratação. As partículas são lavadas no ímã e então DNA é eluída por tampão Tris-HCl (pH = 8). Número de cópia do DNA é estimado usando quantitativa cadeia da polimerase (PCR). Potencial zeta, tamanho de partícula, polidispersividade e dados quantitativos de PCR são avaliados e comparados. DLS é uma perspicaz e método de análise que adiciona uma nova perspectiva para o processo de triagem de partículas para isolamento de DNA de apoio.

Usando o protocolo descrito aqui por síntese química e modificação das partículas magnéticas, seis partículas magnéticas foram sintetizadas e analisadas para ligação de DNA. Um resumo da análise é mostrado na tabela 1. Comparando o tamanho de partícula em água e em solução de ligação, é claro que todas as partículas de agregado na solução de ligação por dobras 2-22. Algumas partículas mais agregados mais dobras na presença de DNA; no entanto isto não foi diretamente corre...

Este protocolo descreve a síntese de partículas magnéticas e avaliação de suas propriedades de ligação a DNA através de espalhamento de luz dinâmica e eletroforético. Este método concentra-se em acompanhamento de alterações no tamanho da partícula, sua polidispersividade e potencial zeta de superfície de partícula que desempenham grande papel na ligação de materiais tais como o DNA.

DNA-magnético partícula análise por dispersão de luz dinâmica e eletroforético de vinculação

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

O objetivo geral deste experimento é analisar a ligação de DNA e partículas magnéticas por meio de espalhamento de luz dinâmico e eletroforético. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biotecnologia, como quão rápida e forte é a ligação entre ácido nucléico e partículas magnéticas. A principal vantagem desta técnica é a visualização de alterações físico-químicas nas partículas, como tamanho, polidispersidade ou potencial zeta. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico molecular devido à crescente demanda por isolamento rápido e sensível do DNA. Neste procedimento, adicione 20 milimoles de cloreto férrico e dez milimoles de cloreto ferroso em 20 mililitros de água desoxigenada duplamente destilada.Em seguida, agite vigorosamente a solução obtida em béquer sob atmosfera de gás nitrogênio usando um agitador mecânico até obter uma solução transparente. Em seguida, sob agitação mecânica rápida, adicione 150 mililitros de um molar de amônia aquosa gota a gota usando o funil de gotejamento por mais de uma hora. Depois, transfira a solução para um recipiente aparafusável e aqueça a solução a 75

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Neste artigo, um simples, quantitativa, na fase líquida ensaio de captura de afinidade é apresentado. É uma técnica fiável baseada na interacção entre as esferas magnéticas e proteínas marcadas (por exemplo, nanocorpos), por um lado ea afinidade entre a proteína marcada e uma proteína, segundo rotulada (por exemplo, poliovírus) sobre o outro.

A fase líquida ensaio de captura de afinidade usando pérolas magnéticas para estudar interação proteína-proteína: O Exemplo Poliovírus Nanobody-

Um scanner para imagiologia de partículas magnéticas nas amostras planas foi desenvolvido utilizando a frequência plana mistura técnica de detecção magnética. A resposta magnética produto de intermodulação da magnetização nonhysteretic não linear das partículas é gravada em cima de uma excitação de dois frequência. Ele pode ser usado para captar imagens 2D de amostras biológicas finas.

Frequência mistura Scanner Detecção magnética for Imaging Partículas Magnéticas em amostras Planar

Apresentamos um plano estratégico e protocolo para identificar variantes genéticas não codificantes que afetam a ligação ao DNA do fator de transcrição (TF). Um protocolo experimental detalhado é fornecido para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e análise de ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) da ligação ao DNA TF dependente do genótipo.

Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção e purificação de proteínas que são rotulados com isótopos estáveis e posterior caracterização das interações da proteína-proteína usando espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (RMN) e microescala Experimentos de Thermophoresis (MST).

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Um protocolo para a aplicação de espectroscopia de RMN de realce por relaxação paramagnética para detectar interações inter e intramoleculares fracas e transitórias em proteínas intrinsecamente desordenadas é apresentado.

Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas

Aqui, descrevemos uma configuração de pinça magnética de alta velocidade que realiza medições nanomecânicas em biomoléculas sensíveis à força na taxa máxima de 1,2 kHz. Apresentamos sua aplicação a pinos de DNA e complexos SNARE como sistemas modelo, mas também será aplicável a outras moléculas envolvidas em eventos mecanobiológicos.

Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força

Relatamos um ensaio de conjunto híbrido e molécula única para obter imagens diretas e quantificar o movimento de helicase Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) totalmente reconstituída e marcada com fluorescência em moléculas de DNA lineares mantidas no lugar em uma armadilha óptica.

Conjunto híbrido e ensaio de molécula única para imagem do movimento de CMG totalmente reconstituído

Proteínas anticongelantes (AFPs) se ligam a planos específicos de gelo para prevenir ou retardar o crescimento do gelo. A análise de afinidade de aviões de gelo baseada em fluorescência (FIPA) é uma modificação do método original de gravação de gelo para determinação de aviões de gelo ligados à AFP. Os AFPs são rotulados fluorescentemente, incorporados em cristais de gelo simples macroscópicos, e visualizados sob luz UV.

Determinando os planos de ligação de gelo de proteínas anticongelantes pela afinidade do plano de gelo baseado em fluorescência

A nanoscopia de sonda coloidal pode ser usada em uma variedade de campos para obter informações sobre a estabilidade física e a cinética de coagulação de sistemas coloidais e auxiliar na descoberta de medicamentos e ciências de formulação usando sistemas biológicos. O método descrito fornece um meio quantitativo e qualitativo para estudar tais sistemas.

O exame quantitativo e qualitativo dos Interações partícula-partícula coloidal Usando Probe Nanoscopia

Nós descrevemos um protocolo para a geração de luz catalisada de peróxido de hidrogênio - um co-fator para transformações oxidativas.

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Aprenda a analisar a ligação de DNA a partículas magnéticas usando dispersão de luz dinâmica e eletroforética. Este método permite visualizar mudanças no tamanho, polidispersidade e potencial zeta das partículas.

DNA-magnético partícula análise por dispersão de luz dinâmica e eletroforético de vinculação

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