Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

O objetivo geral deste procedimento é identificar quais regiões do mRNA são traduzidas em proteínas, medir quantitativamente a tradução de proteínas em leveduras em brotamento Saccharomyces cerevisiae no nível de todo o genoma. O perfil de ribossomos pode ser usado para monitorar a taxa de proteínas e doenças e estudar os mecanismos de regulação translacional. A principal vantagem dessa técnica é que ela adiciona uma sensibilidade muito maior em comparação com outros métodos e, desses, a medição de proteínas e doenças in vivo na resolução de contato único.

Embora este protocolo seja específico para leveduras em brotamento, também é útil para pesquisadores que estão tentando estabelecer o perfil do ribossomo em outros sistemas modelo, como células e tecidos de mamíferos. Os extratos serão preparados a partir de células de levedura cultivadas até a fase logarítmica intermediária. Use um conjunto de filtro de suporte de vidro para filtrar a cultura através de filtros de micromembrana de 0,45.

Raspe o pellet com a espátula, congele rapidamente em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos. Coloque três contas de aço cromado de 3,2 milímetros em um tubo de aço inoxidável de 1,8 mililitro e pré-resfrie o tubo em nitrogênio líquido. Adicione os pellets congelados e cubra o tubo de aço com uma tampa de borracha de silicone.

Homogeneizar a amostra por crio-moagem durante 10 segundos a 4200 rpm. Para manter as amostras congeladas durante todo o procedimento de moagem, é fundamental resfriar o tubo em nitrogênio líquido por pelo menos 10 segundos entre cada moagem. Quando a homogeneização estiver concluída, adicione um mililitro de tampão de lise que contenha cicloheximida à amostra.

Misture bem pipetando e transfira a amostra para um novo tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar a 20 000 vezes g a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros.

Transfira 100 microlitros de lisado para outro novo tubo de 1,5 mililitro para isolamento de poli(A)mRNA. Congele rapidamente os tubos com as amostras de mRNA no restante do lisado, que será usado para extração de pegada em nitrogênio líquido, e armazene a 80 graus Celsius negativos. Na noite anterior à extração da pegada, descongele gradientes de sacarose previamente preparados a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, descongele o lisado celular no gelo. Transfira uma alíquota de lisado celular contendo 50 unidades OD260 para um novo tubo de 1,5 mililitro, adicione tampão de lise fresco até um mililitro e 10 microlitros de RNase um. Incube em temperatura ambiente com rotação suave em um rotador de cabeça para baixo por uma hora.

Em seguida, coloque suavemente a amostra de lisado em cima de um gradiente de sacarose de 10% a 50% em tubos de polímero. Usando um rotor SW41 ti, ultra centrífuga a 35.000 rpm a quatro graus Celsius por três horas. Durante a ultra cetrifugação, configure o sistema de fracionamento de gradiente.

Ligue os componentes e deixe o monitor UV aquecer por pelo menos 30 minutos. Encha a seringa com a solução de perseguição e remova quaisquer bolhas de ar dentro da seringa e da cânula. Quando a ultracentrifugação estiver concluída, instale e perfure o tubo de ultracentrífuga contendo o gradiente de sacarose.

Ligue a bomba da seringa a um mililitro por minuto e colete frações de um mililitro enquanto monitora os valores de A254. As frações que representam o pico do monossoma ADS são recolhidas e agrupadas. Filtrar as fracções através de filtros centrífugos de 0,5 mililitros a 12 000 vezes g a quatro graus Celsius durante 10 minutos, rejeitar o fluxo e repetir até que o volume seja inferior a 100 microlitros.

A 400 microlitros de tampão de liberação misturado por pipetagem e incubar em gelo por 10 minutos, transfira a unidade para um novo tubo de coleta e centrifugue a 12.000 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Colete o fluxo. Em seguida, purificar os fragmentos da pegada e precipitar as amostras usando precipitação de etanol, conforme descrito no protocolo de texto.

Para iniciar este procedimento, centrifugue a pegada precipitada e amostras de mRNA fragmentadas a 20.000 vezes g e quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a remoção do etanol e a secagem dos pellets ao ar, suspendemos cada pellet em 7,75 microlitros de água. Para cada pellet, adicione um microlitro de tampão polinucleotídeo quinase 10XT4, um microlitro de polinucleotídeo quinase T4 e 0,25 microlitros de inibidor de RNase.

Incube a 37 graus Celsius por uma hora. Adicione 10 microlitros de tampão de amostra de ureia 2X TBE a 10 microlitros de cada pegada e amostra de mRNA. Incube as amostras e os controles apropriados a 75 graus Celsius por três minutos, gire para baixo e coloque no gelo por um minuto.

Carregue cada amostra em dois poços de um gel de ureia a 15% TBE e separe os fragmentos de RNA por eletroforese em gel a 180 volts por uma hora. Manchar o gel com um corante de gel de ácido nucleico, protegido da luz durante cinco minutos. Ao visualizar o gel sob um transiluminador de luz azul, excise a banda adequada entre 28 e 32 nucleotídeos para amostras de pegada e cerca de 50 a 70 nucleotídeos para amostras de mRNA.

Congele os pedaços de gel de poliacrilamida excisados a menos 80 graus Celsius por pelo menos 10 minutos antes de extrair o RNA do gel de poliacrilamida. Antes da transcrição reversa, execute três ligações de adaptadores primários e precipite as amostras conforme descrito no protocolo de texto. Ressuspenda cada pellet em 11,5 microlitros de água livre de nuclease.

Em seguida, adicione 0,5 microlitros de oito primers micromolares de transcrição reversa e um microlitro de mistura dNTP. Incube a 65 graus Celsius por cinco minutos e depois coloque no gelo. Para cada amostra, adicione quatro microlitros de tampão de primeira fita 5x, dois microlitros de DTT 0,1 molar, 0,5 microlitros de inibidor de RNase e 0,5 microlitros de transcriptase reversa.

Incube a 48 graus Celsius por 30 minutos, 65 graus Celsius por um minuto e 80 graus Celsius por cinco minutos. Prossiga imediatamente para a hidrólise do RNA adicionando 0,8 microlitros de hidróxido de sódio de dois molares a cada amostra e incubando a 98 graus Celsius por 30 minutos. Adicione 0,8 microlitros de cloreto de hidrogênio de dois molares para neutralizar a reação.

Após precipitar as amostras conforme descrito no protocolo de texto, ressuspenda cada pellet em cinco microlitros de água livre de nuclease e adicione cinco microlitros de tampão de amostra de ureia 2x TBE. Incube a 75 graus Celsius por três minutos, gire para baixo e congele por um minuto. Carregue a amostra em um poço de um gel de ureia a 10% TBE.

Separar os produtos da reacção de transcrição inversa por electroforese em gel a 180 volts durante 50 minutos. Manchar o gel com uma mancha de gel de ácido nucleico protegida da luz durante cinco minutos. Usando um transiluminador de luz azul, excise a banda em torno de 128 nucleotídeos e superiores.

Congele os pedaços de gel de poliacrilamida a menos 80 graus Celsius por pelo menos 10 minutos antes de extrair o DNA do gel de poliacrilamida. Para circularizar o DNA, ressuspenda cada pellet de DNA em 16,75 microlitros de água livre de nuclease. Adicione dois microlitros de tampão de DNA ligase de fita simples 10x, um microlitro de cloreto de manganês 50 milimolar e 0,25 microlitros de DNA ligase de fita simples.

Incube a 60 graus Celsius por uma hora, seguido de 80 graus Celsius por 10 minutos. Sem precipitar, armazene o produto da reação de ligação de DNA de fita simples a menos 20 graus Celsius. Posteriormente, execute a amplificação da biblioteca de PCR seguida de quantificação da biblioteca e sequenciamento de alto rendimento, conforme descrito no protocolo de texto.

São mostrados perfis representativos de bioanalisadores da biblioteca de pegada amplificada por PCR e da biblioteca de sequenciamento obtida para amostras de mRNA. O tamanho médio esperado da biblioteca de pegadas é de 148 a 152 nucleotídeos, e o tamanho esperado da biblioteca de mRNA é de 170 a 190 nucleotídeos. Este gráfico mostra o número combinado de leituras de mRNA, pegada e rRNA obtidas para duas réplicas biológicas independentes de uma amostra de tipo selvagem e o mutante de deleção hbs1.

50% a 60% de todas as leituras sequenciadas nas bibliotecas de pegadas corresponderam a fragmentos de pegadas protegidas por ribossomos. Em contraste, apenas 3% dos fragmentos de rRNA foram observados em bibliotecas de mRNA, demonstrando que o isolamento de poli(A)mRNA permite a eliminação efetiva das leituras de rRNA. As bibliotecas de amostras de pegada e mRNA mostram boa reprodutibilidade, conforme indicado por um coeficiente de correlação de Pearson de cerca de 0,99 entre as amostras correspondentes.

Quando combinado com medições de abundância de mRNA, o perfil do ribossomo permite medir as mudanças na eficiência da tradução entre as condições experimentais. Genes significativamente regulados para cima e para baixo no mutante de deleção hbs1 são agrupados de acordo com se são afetados por uma mudança na transcrição do mRNA, eficiência da tradução ou por um efeito comum. Uma vez dominado, todo o protocolo pode ser realizado em aproximadamente 11 dias.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar luvas e realizar todas as etapas usando reagentes e consumíveis livres de RNase para evitar a contaminação por RNase e diminuir o risco de degradação do RNA nas amostras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar pegadas de ribossomos usando digestão de nuclease, isolar complexos de pegadas de ribossomos intactos por fracionamento de gradiente de sacarose e preparar bibliotecas de DNA para sequenciamento profundo. Não se esqueça de que trabalhar com nitrogênio líquido pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar óculos de segurança e luvas criogênicas devem sempre ser tomadas ao manusear materiais extremamente frios.