Name: Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Aprenda a quantificar a tradução em todo o genoma em Saccharomyces cerevisiae usando perfilamento de ribossomos. Este método de alta sensibilidade permite analisar regiões de mRNA traduzidas em proteínas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subvenções de saúde AG040191 e AG054566 de VML. Esta pesquisa foi realizada enquanto VML foi bolseiro de investigação um AFAR da Federação Americana para pesquisa do envelhecimento.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li>
<li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboDiff%3A+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li>
<li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194(2016).</li>
<li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li>
<li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboProfiling%3A+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309(2016).</li>
<li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid%3A+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).</li>
<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
<li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li>
<li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+poly%28A%29+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li>
<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

A abordagem de Ribo-Seq tem emergido como uma poderosa tecnologia de análise de mRNA tradução na vivo a todo o genoma de nível 3. Estudos utilizando esta abordagem, que permite o monitoramento de tradução com resolução de single-códon, tem contribuído para o nosso entendimento do Regulamento translacional. Apesar de suas vantagens, Ribo-Seq tem várias limitações. Fragmentos de RNA ribossómico (rRNA) são sempre co purificados durante o isolamento de pegadas Ribossoma-protegido, diminuindo ...

Tradução de mRNA é um dos processos fundamentais na célula, que desempenha um papel importante na regulação da expressão da proteína. Portanto, a tradução de mRNA é rigidamente controlada em resposta a diferentes estímulos fisiológicos internos e externos, 1,2. No entanto, os mecanismos de regulação traducional permanecem pouco estudados. Aqui, descrevemos o protocolo para a quantificação de todo o genoma da tradução em leveduras brotamento pelo Ribossoma perfilação. O objectivo geral da técnica de criação de perfil ribossoma é estudar e quantificar a tradução de mRNAs específicos sob diferentes condições de celulares. Esta técnica usa o sequenciamento de próxima geração para analisar quantitativamente a ocupação do ribossomo ao longo do genoma e permite monitorar a taxa de proteína síntese na vivo no códon única resolução 3,4. Atualmente, este método fornece os meios mais avançados de medição dos níveis de tradução da proteína e provou para ser uma ferramenta de descoberta útil, fornecendo informações que não podem ser reveladas por outras técnicas atualmente disponíveis, por exemplo, microarrays ou Tradução estado matriz análise (TSAA) 5. Como o ribossoma relatórios sobre as alterações combinadas em níveis de transcrição e translação saída de criação de perfil, ele também fornece sensibilidade muito maior em comparação com outros métodos.
Esta abordagem baseia-se na profundo sequenciamento de fragmentos de mRNA ribossomo-protegido 3. Durante a tradução de proteínas, ribossomas proteger ~ 28 porções de nt do mRNA (chamado pegadas) 6. Determinando a sequência dos fragmentos protegidos Ribossoma, Ribo-Seq pode mapear a posição dos ribossomas no mRNA traduzido e identificar quais as regiões de mRNA são susceptíveis de ser ativamente traduzido em proteína 3,7. Além disso, quantitativamente podemos medir a tradução de mRNA pela contagem do número de pegadas que se alinham para uma determinado transcrição de mRNA.
Para isolar os fragmentos protegidos Ribossoma, lisados celulares são inicialmente tratados com um inibidor de tradução para enrolar os ribossomas seguidos por digestão ribonuclease. Considerando que livre mRNA e porções de mRNAs traduzidos não protegidos por ribossomos são degradadas pela ribonuclease, os fragmentos do mRNA ribossomo-protegido podem ser recuperados por purificar complexos Ribossoma-pegada intacta. Estas pegadas de mRNA são então convertidas em biblioteca de cDNA e analisadas por sequenciamento profundo (Figura 1). Em paralelo ao Ribossoma perfilação, mRNA intacta é extraído da mesma amostra e sequenciados. Comparando o nível de tradução identificado por Ribo-Seq com medições de abundância de mRNA, podemos identificar os genes que são especificamente acima - ou para baixo-regulado ao nível da tradução e calcular a eficiência da tradução do mRNA a nível de todo o genoma. Enquanto o protocolo descrito neste artigo é específico para o fermento, é também útil para pesquisadores que tentarão estabelecer o protocolo Ribo-Seq em outros sistemas.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; Filtros de membrana M</td><td>Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Filtros centrífugos de 0,5 mL (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 a 4&deg; C)</td> <td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE tampão</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10% TBE-ureia gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-ureia gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X TBE-ureia tampão de amostra</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5.5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenylase (10 U/&mu; L)</td> <td>Epicentro</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Tampão de carregamento de amostra de ácido nucleico</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8% TBE gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol: Clorofórmio, pH 4,5 (com IAA, 125: 24: 1)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Contas de aço cromado, 3,2 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>Cryogrinder</td><td>Produto Biospec</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Aquisição de Dados</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de solução de desoxinucleotídeo (dNTP) (10 mM)</td> <td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de fracionamento gradiente</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerase de alta fidelidade (2.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>Fornecido com 5X Phusion HF Buffer</td></tr><tr><td>Kit de quantificação de biblioteca de sequenciamento de próxima geração</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Corante de gel de ácido nucleico</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 ultracentrífuga</td> Kit de isolamento de mRNA Poly(A) <td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J exonuclease (10 U/&mu; L)</td><td>Epicentro</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>transcriptase reversa (200 U/&mu; L)</td> <td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>Fornecido com tampão de primeira fita 5X e</td></tr><tr><td>tampão de fragmentação de RNA</td> DTT de 0,1 M <td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNase I (100 U/&mu; L)</td> Inibidor de RNase <td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>(20 U/&mu; L)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de borracha de silicone</td><td>Produtos BioSpec</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA ligase (100 U/&mu; L)</td> <td>Epicentro</td><td>CL9021K</td><td>Fornecido com tampão 10X CircLigase II e 50 mM MnCl2</td></tr><tr><td>Microfrascos de aço inoxidável, 1,8 mL</td><td>Produtos BioSpec</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleotídeo quinase T4 (10.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Fornecido com tampão polinucleotídeo quinase 10X T4 T4</td></tr><tr><td>RNA ligase 2 truncado KQ (200.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>Fornecido com tampão ligase de RNA 10X T4 e 50% PEG8000</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>tubos de polialômero de parede fina, 13,2 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Monitor UV Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de todo o genoma de tradução no fermento budding pelo ribossoma perfilamento

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Tradução do RNAm em proteínas é um processo complexo que envolve várias camadas do regulamento. Muitas vezes supõe-se que as alterações na transcrição de mRNA refletem alterações na síntese proteica, mas muitas exceções foram observadas. Recentemente, uma técnica chamada Ribossoma perfilação (ou Ribo-Seq) surgiu como um método poderoso que permite a identificação, com alta precisão, quais as regiões de mRNA são traduzidas em proteínas e quantificação de tradução a nível de todo o genoma. Aqui, apresentamos um protocolo de generalizadas para quantificação de todo o genoma de tradução usando Ribo-Seq no fermento de brotamento. Além disso, combinar dados Ribo-Seq com medições de abundância de mRNA nos permite quantificar simultaneamente a eficiência de conversão de milhares de transcrições de mRNA na mesma amostra e comparar alterações desses parâmetros em resposta a experimental manipulações ou nos diferentes Estados fisiológicos. Descreveremos um protocolo detalhado para geração de pegadas de Ribossoma usando digestão nuclease, isolamento de complexos de Ribossoma-pegada intacta através de fracionamento de gradiente de sacarose e preparação de bibliotecas de DNA para sequenciamento profundo juntamente com o apropriado controles de qualidade necessários para garantir uma análise precisa da tradução na vivo .

Encanamentos detalhados para a análise de bioinformatic do Ribossoma dados de perfil tem sido descrito anteriormente 8,9. Além disso, diversos grupos de pesquisa desenvolveram ferramentas de Bioinformática para análise de expressão diferencial do gene e processamento de dados de sequenciamento, que são específicos para o ribossoma perfilação método 10,11,<sup cl...

Regulamento translacional desempenha um papel importante no controle da abundância de proteína. Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para análise quantitativa de tradução em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae.

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar quais regiões do mRNA são traduzidas em proteínas, medir quantitativamente a tradução de proteínas em leveduras em brotamento Saccharomyces cerevisiae no nível de todo o genoma. O perfil de ribossomos pode ser usado para monitorar a taxa de proteínas e doenças e estudar os mecanismos de regulação translacional. A principal vantagem dessa técnica é que ela adiciona uma sensibilidade muito maior em comparação com outros métodos e, desses, a medição de proteínas e doenças in vivo na resolução de contato único.Embora este protocolo seja específico para leveduras em brotamento, também é útil para pesquisadores que estão tentando estabelecer o perfil do ribossomo em outros sistemas modelo, como células e tecidos de mamíferos. Os extratos serão preparados a partir de células de levedura cultivadas até a fase logarítmica intermediária. Use um conjunto de filtro de suporte de vidro para filtrar a cultura através de filtros de micromembrana de 0,45.Raspe o pellet com a espátula, congele rapidamente em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos. Coloque três contas de aço cromado de 3,2 milímetros em um tubo de aço inoxidável de 1,8 mililitro e pré-resfrie o tubo em nitrogênio líquido. Adicione os pellets congelados e cubra o tubo de aço com uma tampa de borracha de silicone.Homogeneizar a amostra por crio-moagem durante 10 segundos a 4200 rpm. Para manter as amostras congeladas durante todo o procedimento de moagem, é fundamental resfriar o tubo em nitrogênio líquido por pelo menos 10 segundos entre cada moagem. Quando a homogeneização estiver concluída, adicione um mililitro de tampão de lise que contenha cicloheximida à amostra.Misture bem pipetando e transfira a amostra para um novo tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar a 20 000 vezes g a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros.Transfira 100 microlitros de lisado para outro novo tubo de 1,5 mililitro para isolamento de poli(A)mRNA. Congele rapidamente os tubos com as amostras de mRNA no restante do lisado, que será usado para extração de pegada em nitrogênio líquido, e armazene a 80 graus Celsius negativos. Na noite anterior à extração da pegada, descongele gradientes de sacarose previamente preparados a quatro graus Celsius.No dia seguinte, descongele o lisado celular no gelo. Transfira uma alíquota de lisado celular contendo 50 unidades OD260 para um novo tubo de 1,5 mililitro, adicione tampão de lise fresco até um mililitro e 10 microlitros de RNase um. Incube em temperatura ambiente com rotação suave em um rotador de cabeça para baixo por uma hora.Em seguida, coloque suavemente a amostra de lisado em cima de um gradiente de sacarose de 10% a 50% em tubos de polímero. Usando um rotor SW41 ti, ultra centrífuga a 35.000 rpm a quatro graus Celsius por três horas. Durante a ultra cetrifugação, configure o sistema de fracionamento de gradiente.Ligue os componentes e deixe o monitor UV aquecer por pelo menos 30 minutos. Encha a seringa com a solução de perseguição e remova quaisquer bolhas de ar dentro da seringa e da cânula. Quando a ultracentrifugação estiver concluída, instale e perfure o tubo de ultracentrífuga contendo o gradiente de sacarose.Ligue a bomba da seringa a um mililitro por minuto e colete frações de um mililitro enquanto monitora os valores de A254. As frações que representam o pico do monossoma ADS são recolhidas e agrupadas. Filtrar as fracções através de filtros centrífugos de 0,5 mililitros a 12 000 vezes g a quatro graus Celsius durante 10 minutos, rejeitar o fluxo e repetir até que o volume seja inferior a 100 microlitros.A 400 microlitros de tampão de liberação misturado por pipetagem e incubar em gelo por 10 minutos, transfira a unidade para um novo tubo de coleta e centrifugue a 12.000 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Colete o fluxo. Em seguida, purificar os fragmentos da pegada e precipitar as amostras usando precipitação de etanol, conforme descrito no protocolo de texto.Para iniciar este procedimento, centrifugue a pegada precipitada e amostras de mRNA fragmentadas a 20.000 vezes g e quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a remoção do etanol e a secagem dos pellets ao ar, suspendemos cada pellet em 7,75 microlitros de água. Para cada pellet, adicione um microlitro de tampão polinucleotídeo quinase 10XT4, um microlitro de polinucleotídeo quinase T4 e 0,25 microlitros de inibidor de RNase.Incube a 37 graus Celsius por uma hora. Adicione 10 microlitros de tampão de amostra de ureia 2X TBE a 10 microlitros de cada pegada e amostra de mRNA. Incube as amostras e os controles apropriados a 75 graus Celsius por três minutos, gire para baixo e coloque no gelo por um minuto.Carregue cada amostra em dois poços de um gel de ureia a 15% TBE e separe os fragmentos de RNA por eletroforese em gel a 180 volts por uma hora. Manchar o gel com um corante de gel de ácido nucleico, protegido da luz durante cinco minutos. Ao visualizar o gel sob um transiluminador de luz azul, excise a banda adequada entre 28 e 32 nucleotídeos para amostras de pegada e cerca de 50 a 70 nucleotídeos para amostras de mRNA.Congele os pedaços de gel de poliacrilamida excisados a menos 80 graus Celsius por pelo menos 10 minutos antes de extrair o RNA do gel de poliacrilamida. Antes da transcrição reversa, execute três ligações de adaptadores primários e precipite as amostras conforme descrito no protocolo de texto. Ressuspenda cada pellet em 11,5 microlitros de água livre de nuclease.Em seguida, adicione 0,5 microlitros de oito primers micromolares de transcrição reversa e um microlitro de mistura dNTP. Incube a 65 graus Celsius por cinco minutos e depois coloque no gelo. Para cada amostra, adicione quatro microlitros de tampão de primeira fita 5x, dois microlitros de DTT 0,1 molar, 0,5 microlitros de inibidor de RNase e 0,5 microlitros de transcriptase reversa.Incube a 48 graus Celsius por 30 minutos, 65 graus Celsius por um minuto e 80 graus Celsius por cinco minutos. Prossiga imediatamente para a hidrólise do RNA adicionando 0,8 microlitros de hidróxido de sódio de dois molares a cada amostra e incubando a 98 graus Celsius por 30 minutos. Adicione 0,8 microlitros de cloreto de hidrogênio de dois molares para neutralizar a reação.Após precipitar as amostras conforme descrito no protocolo de texto, ressuspenda cada pellet em cinco microlitros de água livre de nuclease e adicione cinco microlitros de tampão de amostra de ureia 2x TBE. Incube a 75 graus Celsius por três minutos, gire para baixo e congele por um minuto. Carregue a amostra em um poço de um gel de ureia a 10% TBE.Separar os produtos da reacção de transcrição inversa por electroforese em gel a 180 volts durante 50 minutos. Manchar o gel com uma mancha de gel de ácido nucleico protegida da luz durante cinco minutos. Usando um transiluminador de luz azul, excise a banda em torno de 128 nucleotídeos e superiores.Congele os pedaços de gel de poliacrilamida a menos 80 graus Celsius por pelo menos 10 minutos antes de extrair o DNA do gel de poliacrilamida. Para circularizar o DNA, ressuspenda cada pellet de DNA em 16,75 microlitros de água livre de nuclease. Adicione dois microlitros de tampão de DNA ligase de fita simples 10x, um microlitro de cloreto de manganês 50 milimolar e 0,25 microlitros de DNA ligase de fita simples.Incube a 60 graus Celsius por uma hora, seguido de 80 graus Celsius por 10 minutos. Sem precipitar, armazene o produto da reação de ligação de DNA de fita simples a menos 20 graus Celsius. Posteriormente, execute a amplificação da biblioteca de PCR seguida de quantificação da biblioteca e sequenciamento de alto rendimento, conforme descrito no protocolo de texto.São mostrados perfis representativos de bioanalisadores da biblioteca de pegada amplificada por PCR e da biblioteca de sequenciamento obtida para amostras de mRNA. O tamanho médio esperado da biblioteca de pegadas é de 148 a 152 nucleotídeos, e o tamanho esperado da biblioteca de mRNA é de 170 a 190 nucleotídeos. Este gráfico mostra o número combinado de leituras de mRNA, pegada e rRNA obtidas para duas réplicas biológicas independentes de uma amostra de tipo selvagem e o mutante de deleção hbs1.50% a 60% de todas as leituras sequenciadas nas bibliotecas de pegadas corresponderam a fragmentos de pegadas protegidas por ribossomos. Em contraste, apenas 3% dos fragmentos de rRNA foram observados em bibliotecas de mRNA, demonstrando que o isolamento de poli(A)mRNA permite a eliminação efetiva das leituras de rRNA. As bibliotecas de amostras de pegada e mRNA mostram boa reprodutibilidade, conforme indicado por um coeficiente de correlação de Pearson de cerca de 0,99 entre as amostras correspondentes.Quando combinado com medições de abundância de mRNA, o perfil do ribossomo permite medir as mudanças na eficiência da tradução entre as condições experimentais. Genes significativamente regulados para cima e para baixo no mutante de deleção hbs1 são agrupados de acordo com se são afetados por uma mudança na transcrição do mRNA, eficiência da tradução ou por um efeito comum. Uma vez dominado, todo o protocolo pode ser realizado em aproximadamente 11 dias.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar luvas e realizar todas as etapas usando reagentes e consumíveis livres de RNase para evitar a contaminação por RNase e diminuir o risco de degradação do RNA nas amostras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar pegadas de ribossomos usando digestão de nuclease, isolar complexos de pegadas de ribossomos intactos por fracionamento de gradiente de sacarose e preparar bibliotecas de DNA para sequenciamento profundo. Não se esqueça de que trabalhar com nitrogênio líquido pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar óculos de segurança e luvas criogênicas devem sempre ser tomadas ao manusear materiais extremamente frios.

genome-wide-quantification-translation-budding-yeast-ribosome

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Ribossomas desempenham um papel central na síntese de proteínas. Polyribosome (polysome) fracionamento por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose permite a determinação direta da eficiência de tradução de mRNAs individuais em uma escala de todo o genoma. Além disso, este método pode ser usado para a análise bioquímica de ribossomas e factores associados--polissomas como acompanhantes e moléculas de sinalização.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

A capacidade das células de se adaptarem ao estresse é crucial para sua sobrevivência. A regulação da tradução do mRNA é uma dessas estratégias de adaptação, proporcionando uma regulação rápida do proteoma. Aqui, fornecemos um protocolo padronizado de perfil de polissoma para identificar mRNAs específicos que são traduzidos seletivamente sob condições de estresse.

Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

O protocolo descrito aqui baseia-se a quantificação de todo o genoma de mRNA recentemente sintetizadas purificada de células de levedura rotuladas com 4-thiouracil. Este método permite medir a síntese de mRNA desacoplada do decaimento do mRNA e, portanto, fornece uma medição precisa da transcrição do RNA polimerase II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

Aqui descrevemos os estágios de coleta e preparação da amostra para RIBO-seq em bactérias. O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com essas diretrizes resulta em dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é simples, utiliza equipamentos de laboratório padrão e leva sete dias desde a lise até a obtenção de bibliotecas.

RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

As interações co-translacionais desempenham um papel crucial nas modificações da cadeia nascente, na segmentação, na dobra e nas vias de montagem. Aqui, descrevemos o Perfil Ribossomo Seletivo, um método para in vivo, análise direta dessas interações no modelo eucariote Saccharomyces cerevisiae.

Identificação Global de Redes de Interação Co-Translacional por Perfil Seletivo Ribosome

Traduzindo ribossomos decodificam três nucleotídeos por codon em peptídeos. Seu movimento ao longo do mRNA, capturado pelo perfil ribossomo, produz as pegadas exibindo periodicidade trigêmea característica. Este protocolo descreve como usar o RiboCode para decifrar esse recurso proeminente de dados de criação de perfil ribossomos para identificar quadros de leitura abertos traduzidos ativamente no nível de transcriptome inteiro.

De novo Identificação de quadros de leitura abertos traduzidos ativamente com dados de perfil ribossomo

Aprenda a quantificar a tradução em todo o genoma em Saccharomyces cerevisiae usando perfilamento de ribossomos. Este método de alta sensibilidade permite analisar regiões de mRNA traduzidas em proteínas.

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

Explorar mais vídeos