Imagem latente funcional das fábricas de transcrição Viral usando microscopia de fluorescência 3D
18 de janeiro de 2018
Fábricas de transcriptional virais são estruturas discretas que são enriquecidas com celular RNA polimerase II para aumentar a transcrição do gene viral durante a reativação. Aqui, um método para localizar sites de ativamente transcrevendo cromatina viral em 3D espaço nuclear por uma combinação de hibridação de RNA de coloração e em situ de imunofluorescência é descrito.
O objetivo geral da combinação de RNA-FISH nascente com coloração amino de proteínas latentes virais é visualizar a transcrição ativa acoplada à formação da fábrica de transcrição viral. Este método pode ser usado para ajudar a responder a perguntas-chave nas áreas de genética, biologia celular, virologia e virologia de biologia celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela utiliza um modelo de minicromossomo viral induzível para estudar os detalhes moleculares por trás das alterações arquitetônicas genômicas.
Colete as células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugue as células por dois minutos a 200 Volts de gravidade. Lave as células três vezes com um mililitro de DEPC PBS estéril.
Em seguida, ressuspenda as células em 1,2 mililitros de DEPC PBS. Coloque as lamelas de cobertura no fundo de uma placa de seis poços. Pipete 200 microlitros da mistura de células DEPC PBS em cada lamínula.
Depois que as células se acomodarem por dois minutos, aspire o excesso de DEPC PBS, deixando apenas uma fina camada de células. Adicione cuidadosamente um mililitro de solução de fixação a cada lamínula. Deixe as células se fixarem por 10 minutos.
Lave as lamínulas três vezes com DEPC PBS. Após a lavagem, adicione cuidadosamente um mililitro de glicina DEPC PBS a uma concentração final de glicina de 100 milimolares a cada lamínula. Deixe as células resfriarem por cinco minutos.
Adicione 1,5 mililitros de DEPC PBS e coloque em uma coqueteleira por cinco minutos e agite com firmeza, mas suavemente, na mão por um minuto. Aspire o excesso de DEPC PBS e tome cuidado para não romper as células. Adicione cuidadosamente um mililitro de solução permeabilizante a cada lamínula.
Deixe as células permeabilizarem por 15 minutos. Adicione 1,5 mililitros de DEPC PBS. Coloque as células em uma coqueteleira por cinco minutos e agite com firmeza, mas suavemente, na mão por um minuto.
Aspire o excesso de DEPC PBS e tome cuidado para não romper as células. Rotule as lâminas do microscópio e umedeça uma toalha de papel e forre o fundo de um recipiente de plástico lacrado com a toalha. Em seguida, prepare a solução de anticorpo primário e multiplique a receita para cada lamínula presente.
Coloque 30 microlitros de solução de anticorpo primário em cada lâmina de microscópio rotulada. Certifique-se de que a concentração primária de anticorpos esteja correta segurando o canto da lamínula e sacudindo-a suavemente. Além disso, o canto de um lenço de papel pode ser usado para absorver o excesso de umidade.
Em seguida, coloque a lamínula nas lâminas de microscópio rotuladas, tomando cuidado para não introduzir bolhas. Cubra o exterior do recipiente com filme plástico. Mova o recipiente para uma incubadora ajustada para 37 graus Celsius por uma hora.
Durante a incubação, prepare os reagentes necessários. Após a incubação, lave as células três vezes com DEPC PBS em uma placa de seis poços por cinco minutos cada. Em seguida, lave as células com tampão de lavagem FISH três vezes por cinco minutos cada.
E mantenha a lamínula no tampão de lavagem FISH até que o anticorpo secundário, uma mistura de sonda de íntron tenha sido preparada. Em seguida, limpe as lâminas de vidro para incubação de anticorpos primários para hibridização com água e sabão. Depois de secos, limpe-os com etanol e um lenço de papel.
Coloque 40 microlitros do anticorpo secundário e da sonda de íntrons FISH com solução em cada lâmina de vidro. Coloque as lamínulas com as células nas lâminas com o lado das células voltado para baixo na parte superior do tampão. E tome cuidado para não introduzir bolhas.
Coloque as lâminas em um recipiente de plástico com uma toalha de papel úmida no fundo. Embrulhe o recipiente de plástico primeiro em filme plástico e depois em papel alumínio. E incube o recipiente com as lâminas.
Após a incubação, deslize cuidadosamente a lamínula da borda da lâmina de vidro e coloque-a de volta em placas de seis poços, voltadas para cima. Lave as células com tampão de lavagem FISH três vezes em uma placa de seis poços por cinco minutos cada. Em seguida, lave as células duas vezes com SSC duplo.
Adicionar DAPI na concentração de um a 1000 no SSC duplo e deixar a solução repousar durante cinco minutos à temperatura ambiente. Lave as células duas vezes com duas vezes SSC. Limpe as lâminas de vidro usadas para hibridização e adicione 10 microlitros de solução de montagem nas lâminas de vidro.
Coloque as lamínulas voltadas para baixo na solução de montagem. Com um lenço de laboratório, remova suavemente o excesso de solução de montagem, tomando cuidado para não esmagar as células. Usando esmalte, aplique uma ampla camada ao redor da borda das lamínulas e deixe o esmalte secar.
A amostra está agora pronta para microscopia de fluorescência. As células BCBL-1 foram coradas para LANA e RNA K-Rta para examinar onde estão os epissomos virais que transcrevem ativamente e a heterogeneidade da resposta ao Herpesvírus associado ao Sarcoma de Kaposi, ou estímulos de reativação do KSHV. A fluorescência distinta de K-Rta em regiões que correspondem à distribuição de epissomos virais é evidência de transcrição ativa ocorrendo perto dos genomas de KSHV.
Na mesma amostra, podem ser observadas células que exibem fluorescência K-Rta muito mais fraca e difusa que não se sobrepõe significativamente ao LANA, ilustrando a variação considerável e o grau de resposta aos estímulos de reativação dentro de uma população de células. Em seguida, a eficácia da sincronização da timidina foi examinada visualizando a expressão da proteína viral, o que demonstrou claramente que as células sincronizadas responderam mais aos estímulos de reativação do que a população não sincronizada. A coloração DAPI pode servir a várias funções, este exemplo mostra claramente que existem três células separadas em vez de uma.
A microscopia 3D juntamente com essa técnica revelou estruturas de RNA PII em forma de anel vistas com genomas de KSHV pontilhados na periferia. Com seu desenvolvimento, o mini cromossomo viral forneceria ferramentas únicas para os pesquisadores explorarem a organização temporal especial da expressão gênica e a regressão do núcleo celular.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para visualizar a transcrição ativa em fábricas transcricionais virais utilizando FISH de RNA nascente combinado com coloração de aminoácidos de proteínas virais latentes. A técnica tem como objetivo elucidar os detalhes moleculares subjacentes às alterações arquitetônicas genômicas durante a reativação viral.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Virologia
- Biologia Celular
- Genética
Antecedentes
- As fábricas transcricionais virais aumentam a transcrição de genes virais.
- A RNA polimerase II celular está enriquecida nessas estruturas.
- Compreender a atividade transcricional é crucial para a pesquisa em virologia.
- Modelos induzíveis de mini-cromossomo viral fornecem informações sobre alterações genômicas.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a transcrição ativa associada à formação de fábricas de transcrição virais.
- Responder perguntas fundamentais em genética e virologia.
- Explorar os detalhes moleculares dos processos de reativação viral.
Métodos Utilizados
- Combinação de FISH de RNA nascente e coloração de aminoácidos.
- Uso de um modelo de minicromossomo viral indutível.
- Técnicas de coleta de células e centrifugação.
- Coloração por imunofluorescência e hibridização de RNA in situ.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de cromatina viral em transcrição ativa.
- Identificação de fábricas transcricionais no espaço nuclear tridimensional.
- Compreensão da dinâmica da expressão gênica viral durante a reativação.
- Demonstração da aplicabilidade do método na pesquisa em virologia.
Conclusões
- O método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo da transcrição viral.
- Ele aprimora a compreensão dos mecanismos de reativação viral.
- Pesquisas futuras podem se basear nesses achados para explorar a biologia viral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para o Setor
A imagem com resolução espacial de fábricas de transcrição viral usando microscopia de fluorescência 3D permite a visualização direta de eventos de expressão gênica ativos dentro da arquitetura nuclear. Essa capacidade é fundamental para reduzir os riscos associados a hipóteses mecanicistas sobre a regulação do genoma viral e reforça a confiança preditiva na validação precoce de alvos antivirais. A abordagem orienta decisões de portfólio ao esclarecer a dinâmica espacial e temporal da reativação viral em nível de célula única.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a visualização direta de sítios ativos de transcrição viral para a validação funcional de alvos.
- Esclarece a relação espacial entre episomas virais e atividade transcricional, apoiando a redução de riscos mecanicistas.
- Apoia a investigação orientada por hipóteses da regulação gênica viral durante a reativação.
- Fornece evidências de envolvimento da via e relevância biológica dos alvos candidatos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece ensaios de imagem validados para quantificar a atividade transcricional em resposta a perturbações.
- Facilita a detecção reprodutível de RNA recém-sintetizado e marcadores proteicos em formatos de triagem de alto conteúdo.
- Permite a padronização de leituras para avaliação de compostos que visam a expressão gênica viral.
- Apoia a escalabilidade e o reuso da plataforma para sistemas virais relacionados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os resultados de imagem com modelos de reativação viral relevantes para doenças.
- Proporciona continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, vinculando eventos moleculares a desfechos fenotípicos.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados de expressão gênica espaciais e temporais.
- Apoia a identificação de biomarcadores translacionais para o desenvolvimento de antivirais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de imagem integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico, permitindo a medida direta da atividade transcripcional viral e da organização nuclear.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre regulação gênica viral e formação de fábricas de transcrição.
- Triagem: Fornece leituras de imagem quantitativas e reproduzíveis para o desenvolvimento de ensaios e triagem de compostos.
- Análises: Fornece medidas com resolução espacial da colocalização de RNA recém-sintetizado e proteínas para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados de imagem molecular a modelos de reativação viral relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma de imagem reutilizável e adaptável a outros estudos de regulação gênica episomal ou nuclear.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e reduz a ambiguidade mecanicista na regulação gênica viral.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de imagem para garantir reprodutibilidade e escalabilidade entre equipes de P&D.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados quantitativos com alto conteúdo sobre a dinâmica da transcrição viral.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e mecanismos antivirais para avanço.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência avançada e no design de sondas moleculares.
- Exige acesso a instrumentação para imagem 3D e infraestrutura para análise de imagens.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de coloração e parâmetros de aquisição de imagens.
- Adaptável a diversos sistemas modelo virais e nucleares com o desenvolvimento apropriado de sondas.
- Depende da adequação do modelo celular e da especificidade da sonda para uma interpretação precisa.
