Name: Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a quantificar células-tronco e progenitoras hematopoéticas em embriões de peixe-zebra usando ensaio in vitro. Este método rápido e econômico permite detectar defeitos sanguíneos e realizar triagem de fármacos.

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Financiamento foi fornecido pela National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 para D.L.S.), o programa de Universidade de estado de Califórnia para Educação & pesquisa em biotecnologia (CSUPERB: controle Molecular do nicho Hematopoietic vertebrados para D.L.S.) e da Secretaria de pós-graduação na Universidade do estado da Califórnia Chico (a A.C.B).

Conselho Consultivo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) Universidade Estadual da Califórnia, Chico, aprovou todos os métodos descritos abaixo.
1. bleach 48 hpf Zebrafish embriões
<ol><li>Com 15 cm (w) x 15 cm (l) x recipientes plásticos de 7cm (h) criar 3 estações de lavagem: 1) com 1 mL de água sanitária de 5% em 1000 mL de meio de embrião (E3; ver tabela 1), 2) com E3 estéril e 3) com E3 estéril. Certifique-se de que cada contêiner tem 500 mL de solução a submergir os embriões em. Nota: Para cada condição testada, pelo menos 10 embriões serão necessários. Este procedimento de lavagem pode acomodar até 200 embriões.</li>
	<li>Com uma pipeta de transferência, colocar os embriões em um coador de chá e mergulhe os ovos na estação de lavagem #1 por 5 min. Retire o coador de chá (com embriões dentro) e coloque no estação de lavagem #2 por 5 min; Repita para a estação de lavagem #3 para um final 5 min.</li>
	<li>Após a última lavagem, enxaguamento embriões de coador de chá, transformando-o de cabeça para baixo sobre um limpa de Petri de 10 cm e enxaguando suavemente embriões fora o coador de chá com E3 estéril e uma pipeta de transferência.</li>
</ol>2. Dechorionate embriões
<ol><li>Com uma pipeta de transferência, remover e descartar E3 tanto quanto possível da caixa de Petri e adicionar 500 μL de dechorionation protease (10 mg/mL) de embriões. Incube a temperatura ambiente por 5 min. Bata levemente o lado da caixa de Petri para remover completamente o chorions.</li>
	<li>Com uma pipeta sorológica, adicione 20 mL de E3 estéril para diluir a protease. Permitir que embriões resolver e remover o E3 com uma pipeta de transferência. Repita essa etapa de lavagem 3 vezes para remover todos os vestígios de protease a dechorionation.</li>
</ol>3. preparação de amostras de embrião
<ol><li>Usando uma pipeta P1000, coloque 10 embriões em um tubo de microcentrifugadora único estéril 1,5 mL.</li>
	<li>Retire E3 com uma pipeta e descarte. Cuidado: Pipetar com cuidado como embriões podem ser facilmente deslocados e descartados durante as etapas de lavagem a seguir.</li>
</ol>4. preparação de embriões para dissociação
<ol><li>Transferir as amostras para fluxo laminar hood e lavar os embriões, adicionando 1 mL estéril E3. Permitir que os embriões resolver a parte inferior do tubo e remover o sobrenadante com uma pipeta P1000. Repita para um total de 3 lavagens.</li>
	<li>Após a última lavagem, remova a E3 e descarte. Adicione 1 mL de 10mm ditiotreitol (DTT) na E3 para remover o revestimento de muco (e qualquer esporos, leveduras ou bactérias que podem ser presos nele) cercando o zebrafish embrionário. Colocar o tubo microcentrifuga horizontalmente e incubar a temperatura ambiente na capa de fluxo laminar para 25 min.</li>
</ol>5. o embrião dissociação
<ol><li>Lave a amostra 3 vezes com 1 mL de estéril DPBS (com Ca2 + e Mg2 +). Após a última lavagem, adicione 500 μL de DPBS (com Ca2 + e Mg2 +) e adicione 5 μL de protease de dissociação de 5 mg/mL (26 U/mL). Atenção: Esta enzima precisa de Ca2 + e Mg2 +, para garantir que o DPBS contém esses íons.</li>
	<li>Incubar as amostras a 37 ° C em um agitador orbital horizontal a 180 rpm para amostras de 60 min. lugar do capuz de fluxo laminar e triture os embriões com uma P1000 até amostras são totalmente dissociadas. Atenção: Verifique embriões periodicamente para determinar quando eles se tornam dissociados. A solução de embrião deve ter alguma quantidade de tecido presente; Não deve ser completamente homogêneo. É possível digerir excesso, que destruirá as HSPCs (ver suplementar Figura 1).</li>
</ol>6. preparação dos embriões dissociadas
<ol><li>Embriões de pipeta 10 dissociada para o reservatório superior de um poliestireno 5ml redondo tubo inferior com uma tampa de filtro de célula de 35 μm.</li>
	<li>Com uma pipeta, enxaguar o tubo de Petri com solução de transferência para poliestireno tubo de 5 mL contendo e PBS estéril (com nenhum Ca2 + ou Mg2 +) filtrados células da etapa 6.1. Repita até 4 mL de líquido está presente no tubo de poliestireno de 5 mL. Nota: PBS, DPBS ou outras soluções isotônicas em buffer podem ser utilizadas nesta fase, desde que não contenham Ca2 + ou Mg2 +
</li>
	<li>Centrifugar tubos a 4 ° C e 300 x g por 5 min para a amostra homogeneizada célula de Pelotas. Com uma pipeta, remover e descartar o sobrenadante do tubo de fundo redondo. Tome cuidado para não perturbar as células peletizadas na parte inferior do tubo. Ressuspender as células em 100 µ l de PBS.</li>
</ol>7. preparação de metilcelulose
<ol><li>Gerar 1 x solução completa metilcelulose (tabela 1) e adicionar 2,5 mL de tubos estéreis fundo redondo 14 mL com 16G agulhas e seringas de 3 mL. Use um tubo para cada condição testada.</li>
	<li>
Adicione citocinas, moléculas pequenas ou outros agentes para ser investigado para cada amostra.
	<ol>
<li>Para diferenciação mieloide, adicione 1% carpa soro e 0,3 mg/mL zebrafish recombinante granulócitos da colônia fator (Gcsf)34 para meio de metilcelulose. Ver Svoboda et al 37 para uma descrição completa sobre como gerar citocinas de soro e recombinação de carpa.</li>
		<li>Para diferenciação eritroide, adicione 1% carpa soro e 0,1 mg/mL zebrafish recombinante eritropoietina (Epo)38 a médio de metilcelulose.</li>
		<li>Para examinar os progenitores multilineage, adicione Epo e Gcsf. Cuidado: Citocinas e aditivos devem não total superior a 10% do volume total, como o meio não será suficientemente viscoso para discernir as colônias individuais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. adição de embriões dissociadas de metilcelulose
<ol><li>Utilizando uma pipeta, adicione 100 μL de dissociada 10 embriões para a superfície da metilcelulose preparado com soro recombinante de citocinas e carpas. Tampa da tampa e vórtice suavemente para homogeneizar completamente a amostra. Cada tubo agora deve conter o tecido dissociado de 10 embriões.</li>
	<li>Usando 3 mL seringas e agulhas de 16G, alíquota de 1ml da amostra em separado 35 mm 2 placas de Petri. Certifique-se que a amostra é totalmente dispersos por todo o prato de Petri. Repita para cada amostra.</li>
	<li>Coloque os pratos de Petri 35mm com células em metilcelulose em uma placa de Petri de 15 cm. Para cada prato 15cm, adicione uma placa de Petri 35mm com 5 mL de água estéril para umidificar as amostras. Incube a 32 ° C e 5% de CO2 por 7-10 dias.</li>
</ol>9. visualização de HSPC-derivado unidades formadoras (CFUs)
<ol><li>Após 7 dias de incubação, coloca amostras em um microscópio invertido em 40-100 X para visualização e enumeração. Neste ponto, colônias individuais podem ser isoladas com uma pipeta e submetidas a análise de coloração e/ou gene.</li>
</ol>

<ol><li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
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<li>Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD41%2B+cmyb%2B+precursors+colonize+the+zebrafish+pronephros+by+a+novel+migration+route+to+initiate+adult+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis.</a> Development. 135, 1853-1862 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+initiates+through+a+committed+erythromyeloid+progenitor+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo.</a> Development. 134, 4147-4156 (2007).</li>
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<li>Henninger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+fate+mapping+quantifies+the+number+of+haematopoietic+stem+cells+that+arise+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development.</a> Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).</li>
<li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160, 241-252 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O modelo de sistema de zebrafish tornou-se um modelo eficiente, eficaz e barato para o estudo de hematopoiese vertebrado primitivo e definitivo. Geração de ensaios que são rápidos, baratos e apresentar algumas dificuldades técnicas pode ser utilizada para teste de pequenas moléculas, analisando os embriões mutantes e elucidação moleculares vias importantes para a biologia HSPC. Em vitro chapeamento de HSPCs de zebrafish adulto é um método eficaz para estudar mutagênese e citocinas hematopoiéticos defeitos. Este ...

Hematopoiese é o processo de fazer a multidão de células maduras do sangue necessário para a sobrevivência do organismo. É uma chave no desenvolvimento do processo que envolve a diferenciação de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) em uma variedade de tipos de células desenvolvente restrito que compõem o sangue maduro. Estes linfócitos auto devem renovar para que o sistema nunca está esgotado e eles devem persistir de desenvolvimento embrionário precoce até à morte. Nos vertebrados, constante diferenciação e proliferação de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são necessários para repor adequadamente a maioria das células do sangue que são pós mitóticas e sendo reciclados todos os dias. Linfócitos geram células maduras do sangue por primeira diferenciação em subconjuntos de células progenitoras restrito; comum progenitores linfoides (CLPs)1, que eventualmente produzir células T, B e NK e comum progenitores mieloides (CMPs)2 que geram granulócitos, eritrócitos, macrófagos e megacariócitos. Estes progenitores estão empenhados em gerar linhagens de células específicas e diferenciarem ainda mais em mais células progenitoras desenvolvente restrito como progenitores mieloide eritroide (MEPs) que geram eritrócitos e plaquetas ou granulócitos progenitores do macrófago (GMPs) que geram basófilos, eosinófilos, neutrófilos e macrófagos2. Identificando e isolando esses progenitores permitem a identificação de importantes vias moleculares envolvidos na diferenciação hematopoiética e muitas doenças hematopoiéticas, como a leucemia surgem quando essas células progenitoras não corretamente Diferencie-se.
Ao longo das últimas décadas, o modelo de sistema de peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se uma ferramenta chave de pesquisa para estudos hematopoiéticas adultas e embrionárias. Zebrafish são passível de análise genética e são as espécies de vertebrados modelo filogeneticamente menores que têm um sistema vascular semelhante e sistema hematopoiético aos seres humanos. Desenvolvem de embriões de zebrafish ex utero, e dentro de 48 horas pós fertilização (hpf) gerar HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafish são também altamente fecundo, com fêmeas deitado sobre 100 ovos em uma única embreagem, permitindo a replicação experimental e tamanhos de amostra grande. Zebrafish embriões são opticamente transparentes, permitindo a visualização microscópica do sistema hematopoiético. Várias linhas de transgênicas fluorescentes de zebrafish marcando linfócitos como runx1: EGFP peixe9, cd41: EGFP peixe10, e kdrl:mCherry; CMap: animais de duplo-positivo do GFP3 , permitem a visualização em tempo real de HSC surgimento e expansão na vivo3,4,7,8, 9. Geração rápido tempo e desenvolvimento ex utero do zebrafish conduziu a seu uso em mutagênese estudos11,12,13,14,15 e drogas rastreio de16,17,18,19,20 para compostos que mantêm a promessa terapêutica para distúrbios do sangue humano. Em geral, conservação do sistema hematopoiético, a presença e o desenvolvimento fácil de linhas transgénicas e tempo de regeneração rápida fez o zebrafish um modelo barato, rápido, flexível e ideal para estudos hematopoiéticos.
Numerosos métodos de isolamento e testes de linfócitos foram desenvolvidos em mamíferos sistemas hematopoiéticos. Os investigadores podem utilizar uma combinação de receptores de superfície celular para marcar linfócitos21,22,23,24, bem como explorar a capacidade dos linfócitos de efluxo tintura25,26. Depois que eles são rotulados, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação permite que a sua separação física. Provar que é uma célula de um HSC requer irradiando um animal hospedeiro para destruir HSPCs endógenos, transplantando linfócitos putativos e observando a longo prazo, linhagem multi reconstituição de todos amadurecem tipos de células do sangue. Estes ensaios funcionam bem em ratos, como existem numerosos da pilha-superfície anticorpos contra células hematopoiéticas e linhagens puras do mouse que facilitam a correspondência imune para transplante. No entanto, alguns zebrafish anticorpos de superfície de células hematopoiéticas foram gerados27, dificultando a identificação e isolamento de linfócitos. A maneira mais comum para marcar e isolar linfócitos zebrafish é com animais transgénicos, segundo o qual uma sequência do promotor celular específico está dirigindo expressão de uma proteína fluorescente. Estudos têm visualizado e enumerado de linfócitos na parede ventral da aorta dorsal com microscopia utilizando esta técnica3,4,8,9. Outros laboratórios geraram variedades clonais de zebrafish28,29 e realizaram transplantes bem sucedidos em animais MHC-combinadas30. No entanto, essas técnicas são custo proibitivo para muitos laboratórios são tecnicamente difíceis e são demoradas. Para solucionar esses problemas, laboratórios têm gerado vários ensaios em vitro para testar para a presença, as taxas de proliferação e a capacidade de diferenciação de HSPCs31,32,33, 34,35,36. Estes ensaios mostram proliferação e diferenciação dos HSPCs em vitro31,32,33,34,35,36, o resgate de hematopoiéticas defeitos36e um método eficiente para descobrir e testar citocinas33,34,35. Eles também têm sido utilizados para identificar os genes responsáveis pela HSPC biologia31,32. Neste estudo, tomamos estes ensaios um passo adiante, permitindo a quantificação de HSPCs em um embrião em desenvolvimento do zebrafish. Estes ensaios também podem ser utilizados para quantificar o número de HSPCs em animais mutantes e os animais tratados com drogas hematopoiéticas interrupções. Em essência, estes ensaios são rápidos, presentes alguns desafios técnicos e maneiras baratas de dosar números HSPC, examinar sua proliferação e investigar blocos na diferenciação.

<table><tbody><tr><td>10% de albumina de soro bovino em Iscove MDM</td><td>StemCell Technologies&nbsp;</td><td>9300</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) com Cálcio2+ e Magnésio2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>HyClone PBS (1x)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>sh30256.01</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM 500 mL</td><td>Corning CellGrow</td><td>10-017-CVnbsp</td><td></td></tr><tr><td>; Presunto F12 500 mL</td><td>Corning CellGrow</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-108</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 100 mL (1 M)</td><td>Gibco life technologies</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (5000 U/mL e 5000 mg/mL) com L-Glutamina (200 mM)</td><td>Corning Mediatech</td><td>30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Gentamicina 10 mL (50 mg/mL)</td><td>Corning Tubo MCF Mediatech</td><td>30-005-CR</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de injeção de 3 mL 23gx1 com trava Luer Tubo</td> inferior redondo de poliestireno BD <td>Safety Glide</td><td>305905</td><td></td></tr><tr><td>5 mL com tampa de filtro de célula</td><td>Corning Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Methocel MC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64630</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Tubo inferior redondo de poliestireno</td><td>Corning Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de poliestireno de 10 mm easygrip</td><td>Corning Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Librease TM</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>protease de dissociação</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td>protease de descorionação</td></tr><tr><td>15 cm Placa de Petri</td><td>Corning Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>AB</td><td>Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td>A <td>cepa de peixe-zebra</td> <td>ZL1</td> usou</tr><tr><td>Dithiolthreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de um ensaio in vitro para dosar o progenitor e hematopoietic stem cells (hspcs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Hematopoiese é um processo essencial de celular no qual células estaminais e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) diferenciarem-se na multiplicidade de linhagens diferentes de células que compõem o sangue maduro. Isolamento e identificação destes HSPCs é difícil, porque eles são definidos ex post facto; Eles só podem ser definidos após sua diferenciação em linhagens de células específicas. Ao longo das últimas décadas, o peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um organismo modelo para estudar a hematopoiese. Embriões de zebrafish desenvolvem ex uteroe pela pós-fertilização de 48 h (hpf) geraram definitivo HSPCs. ensaios para avaliar a diferenciação HSPC e capacidades de proliferação foram desenvolvidas, utilizando o transplante e subsequente reconstituição do sistema hematopoiético além de Visualizar linhas transgénicas especializadas com microscopia confocal. No entanto, estes ensaios são custo proibitivo, tecnicamente difícil e demorado para muitos laboratórios. Desenvolvimento de um modelo in vitro para avaliar HSPCs seria custo-eficaz, mais rápido, e presentes menos dificuldades em relação ao anteriormente descritos métodos, permitindo que os laboratórios avaliar rapidamente telas mutagênese e drogas que afetam a biologia HSPC. Este romance em vitro ensaio para avaliar a HSPCs é realizado pelo chapeamento dissociado do zebrafish toda embriões e adicionando fatores exógenos que promovem a proliferação e diferenciação de HSPC. Os embriões são dissociados em células únicas e chapeados com HSPC-apoio fatores de estimulante de colônia que levá-los a gerar colônia formando unidades (CFUs) que surgem a partir de uma célula progenitora único. Estes ensaios devem permitir análise mais cuidadosa das vias moleculares responsáveis pela HSPC proliferação, diferenciação e regulamento, que permitirá que os pesquisadores a entender os fundamentos da hematopoiese vertebrado e sua desregulação durante a doença.

Para avaliar os números HSPC no zebrafish embrionário, 48 embriões hpf foram digeridos, banhados em metilcelulose com fatores de crescimento hematopoiéticos-apoio exógenos e incubados durante 7 dias (Figura 1A). Após 7 dias, unidades formadora de Colônia (CFUs) foram enumerados (Figura 1B) e imagem (Figura 1C). Controlando as diferentes citocinas adi...

Aqui, apresentamos um método simples para dosar o tronco e progenitoras células hematopoiéticas (HSPCs) no zebrafish embrionária. HSPCs de zebrafish dissociado são banhados em metilcelulose com fatores de apoio, diferenciando-se em sangue maduro. Isto permite a detecção de sangue defeitos e permite para ser facilmente conduzida de despistagem de drogas.

Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

O objetivo geral deste ensaio é enumerar e examinar a diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas no embrião de peixe-zebra em desenvolvimento. Este método pode ajudar a responder a algumas questões realmente importantes no campo hematopoiético, como quantas células-tronco e progenitoras estão realmente em um embrião de peixe-zebra em desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida, relativamente barata e fácil de executar.Embora esse método possa fornecer informações sobre o número de progenitores presentes no peixe-zebra em desenvolvimento, ele também permite que os pesquisadores meçam o efeito funcional que uma droga ou mutação genética tem na formação de progenitores sanguíneos. Tivemos a ideia para esse método, quando estávamos derrubando genes que hipotetizamos serem cruciais para o desenvolvimento do sangue. Previmos que seríamos capazes de medir a diferença entre embriões em desenvolvimento normal e aqueles que eram morfantes com este ensaio.Para branquear embriões de peixe-zebra, use recipientes de plástico para criar três estações de lavagem, com uma contendo um mililitro de cinco por cento de alvejante por litro de E3 e duas estações cont

development-an-vitro-assay-to-quantitate-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Relata-se o desenvolvimento de um sistema automatizado para geração de imagens e análise de zebrafish embriões transgênicos em placas de vários poços. Isso demonstra a capacidade de medir os efeitos dose-dependente de uma pequena molécula, BCI, na expressão do gene Fator de Crescimento de Fibroblastos repórter e fornecer tecnologia para o estabelecimento de high-throughput telas química zebrafish.

Desenvolvimento de imagem automatizada e análise química para as telas de zebrafish.

O peixe-zebra, um pequeno peixe tropical, tornou-se um modelo popular para estudar a função do gene durante o desenvolvimento de vertebrados e doença. A expressão espacial e temporal dos genes alvo pode ser determinada...

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

O peixe-zebra é um poderoso sistema modelo para biologia do desenvolvimento e pesquisa de doenças humanas devido à sua semelhança genética com vertebrados superiores. Este protocolo descreve uma metodologia para criar embriões de peixe-zebra haplóides que podem ser utilizados para estratégias de triagem direta para identificar mutações recessivas em genes essenciais para a embriogênese inicial.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

Para analisar os perfis de expressão de genes cardíacos durante o desenvolvimento do coração de peixe-zebra, o RNA total foi de ser extraído do coração isolado. Aqui, apresentamos um protocolo para a coleta / corações batendo funcionais por um rápido esvaziamento manual a partir de embriões de peixes-zebra para obter mRNA específico cardíaca.

Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

Este protocolo descreve um método para isolar células únicas de embriões de peixe-zebra, enriquecendo para células de interesse, capturando células de peixe-zebra em sistemas multiplex de célula única baseados em microfluídica e avaliando a expressão gênica de células únicas.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

Este protocolo fornece instruções passo a passo sobre como gerar embriões de peixe-zebra parabióticos de diferentes origens genéticas. Quando combinado com os recursos de imagem incomparáveis do embrião de peixe-zebra, esse método fornece um meio excepcionalmente poderoso para investigar funções autônomas e não autônomas de células para genes candidatos de interesse.

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

Apresentado aqui é um protocolo para análise de hibridização de RNA in situ in situ em zebrafish e ensaio de formação de tubos em células endoteliais derivadas de células-tronco derivadas do paciente para estudar o papel da endoglina na formação vascular.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Este ensaio é um método simples para quantificar células hematopoiéticas no desenvolvimento de zebrafish embrionário. As células sanguíneas de zebrafish dissociados são submetidas à análise de citometria de fluxo. Isso permite a detecção de defeitos sanguíneos em animais mutantes e após modificação genética.

Usando citometria de fluxo para detectar e quantificar a formação sanguínea alterada no zebrafish em desenvolvimento

Aqui, apresentamos um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides de duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal).

Método de Cultura 3D de Esferoides de Linhagens Celulares de Zebrafish Embrionárias e Hepáticas

Este protocolo descreve um método de microscopia de luz de baixo custo para avaliar a morfologia e função cardíaca em embriões de peixe-zebra, permitindo a avaliação reprodutível da cardiotoxicidade do desenvolvimento sem a necessidade de sistemas avançados de imagem.

Imagem cardíaca funcional em embriões de peixe-zebra usando microscopia padrão e análise de vídeo: aplicações em pesquisa ambiental e biomédica

Aprenda a quantificar células-tronco e progenitoras hematopoéticas em embriões de peixe-zebra usando ensaio in vitro. Este método rápido e econômico permite detectar defeitos sanguíneos e realizar triagem de fármacos.

Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal

Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

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