Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

O objetivo geral deste ensaio é enumerar e examinar a diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas no embrião de peixe-zebra em desenvolvimento. Este método pode ajudar a responder a algumas questões realmente importantes no campo hematopoiético, como quantas células-tronco e progenitoras estão realmente em um embrião de peixe-zebra em desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida, relativamente barata e fácil de executar.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o número de progenitores presentes no peixe-zebra em desenvolvimento, ele também permite que os pesquisadores meçam o efeito funcional que uma droga ou mutação genética tem na formação de progenitores sanguíneos. Tivemos a ideia para esse método, quando estávamos derrubando genes que hipotetizamos serem cruciais para o desenvolvimento do sangue. Previmos que seríamos capazes de medir a diferença entre embriões em desenvolvimento normal e aqueles que eram morfantes com este ensaio.

Para branquear embriões de peixe-zebra, use recipientes de plástico para criar três estações de lavagem, com uma contendo um mililitro de cinco por cento de alvejante por litro de E3 e duas estações contendo E3 estéril. Com uma pipeta de transferência, coloque os embriões em uma peneira de chá e mergulhe-os na estação de lavagem número um por cinco minutos. Em seguida, transfira o coador de chá com os embriões para a estação de lavagem número dois por cinco minutos. Repita para a estação de lavagem número três por mais cinco minutos.

Após a última lavagem, remova os embriões da peneira de chá virando-a de cabeça para baixo sobre uma placa de Petri limpa de 10 centímetros e use uma pipeta de transferência e E3 estéril para enxaguar suavemente os embriões da peneira. Para descorionar os embriões, use uma pipeta de transferência para remover e descartar o máximo possível de E3 da placa de Petri. Em seguida, adicione 500 microlitros de prodeas de descorionação aos embriões e incube-os em temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, bata suavemente na lateral da placa de Petri para remover completamente os córions. Em seguida, com uma pipeta sorológica, adicione 20 mililitros de E3 estéril para diluir as prodeas. Deixe os embriões assentarem e use uma pipeta para remover o E3. Repita esta etapa de lavagem três vezes para remover todos os vestígios dos procedimentos de descorionação.

Para preparar amostras de embriões, use uma pipeta para colocar 10 embriões em um único tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro. Em seguida, pipete cuidadosamente o E3 e descarte-o. Transfira as amostras para uma capela de fluxo laminar e lave os embriões adicionando um mililitro de E3 estéril, permitindo que os embriões se depositem no fundo do tubo.

Em seguida, use uma pipeta P1000 para remover o sobrenadante. Repita para um total de três lavagens. Após a última lavagem, remova o E3 e descarte-o.

Em seguida, adicione um mililitro de DTT 10 milimolar em E3 para remover o revestimento mucoso e quaisquer esporos, leveduras ou bactérias que possam estar presos nele ao redor dos embriões. Agora, coloque o tubo da microcentrífuga horizontalmente e incube-o em temperatura ambiente por 25 minutos. Para dissociar os embriões, use um mililitro de DPBS estéril para lavar a amostra três vezes.

Após a última lavagem, adicione 500 microlitros de DPBS com cálcio e magnésio e cinco microlitros de cinco miligramas por mililitro de dissociação prodeas. Incubar as amostras a 37 graus Celsius em um agitador orbital horizontal a 180 rpm por 60 minutos. Em seguida, coloque as amostras e a capela de fluxo laminar e use um P1000 para triturar os embriões até que as amostras estejam totalmente dissociadas.

Tenha cuidado e verifique os embriões periodicamente para determinar quando eles estão dissociados. Você quer que algum tecido esteja presente. É possível digerir demais os embriões que destruirão as células progenitoras.

Pipete os 10 embriões dissociados no reservatório superior de um tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros com uma tampa de filtro de células de 35 micrômetros. Com uma pipeta e PBS estéril, enxágue o tubo embrionário e transfira a solução para o tubo de poliestireno de cinco mililitros contendo células filtradas. Repita o enxágue até que quatro mililitros de líquido estejam presentes no tubo.

Centrifugue os tubos a 300 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por cinco minutos para paletar a amostra de célula homogeneizada. Com uma pipeta, remover e descartar o sobrenadante do tubo inferior redondo, tomando cuidado para não romper as células peletizadas no fundo. Em seguida, use 100 microlitros de PBS para ressuspender as células.

Prepare uma solução estoque de metilcelulose X completa e use seringas de três mililitros e 16 agulhas de calibre para adicionar 2,5 mililitros de tubos estéreis de fundo redondo de 14 mililitros. Use um tubo para cada condição testada. Para diferenciação mielóide, adicione um por cento de soro de carpa e 0,3 miligrama por mililitro de fator estimulador de colônias de granulócitos de peixe-zebra recombinante ou GCSF ao meio de metilcelulose.

Para diferenciação eritroide, adicione um por cento de soro de carpa e 0,1 miligrama por mililitro de eritropoietina ou EPO de peixe-zebra recombinante ao meio de metilcelulose. Para examinar progenitores de várias linhagens, adicione EPO e GCSF. Usando uma pipeta, adicione 100 microlitros dos 10 embriões dissociados à superfície da metilcelulose preparada com as citocinas recombinantes no soro da carpa.

Tampe a tampa e bata suavemente para homogeneizar totalmente a amostra. Cada tubo deve agora conter o tecido dissociado de 10 embriões. Usando seringas de três mililitros e agulhas de calibre 16, alíquota de um mililitro de amostra em duas placas de Petri separadas de 35 milímetros.

Certifique-se de que a amostra esteja totalmente dispersa por toda a placa de Petri. Repita para cada amostra. Coloque as placas de Petri de 35 milímetros com células e metilcelulose em uma placa de Petri de 15 centímetros.

Para cada prato grande, adicione um prato de 35 milímetros com cinco mililitros de água estéril para umidificar as amostras. Incube os pratos a 32 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por sete a 10 dias. Por fim, visualize as unidades formadoras de colônias de acordo com o protocolo de texto.

Após sete dias em cultura com fatores de suporte hematopoiéticos, os progenitores de 48 peixes-zebra embrionários HPF foram contados e fotografados. É importante ressaltar que a quantidade de FC usada se correlaciona diretamente com o número de embriões plaqueados. O plaqueamento de quatro ou oito embriões por mililitro, que se correlaciona com o início com 10 ou 20 embriões, no início do experimento, produz aproximadamente 1200 ou 2400 UFC, respectivamente.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas e meia se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não digerir demais os embriões, pois isso destruirá as células progenitoras. Com este procedimento, você pode comparar o número de progenitores presentes em diferentes momentos.

Você pode comparar animais mutantes com animais selvagens, bem como testar o efeito das drogas no desenvolvimento do sangue. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de metilcelulose para enumerar os progenitores hematopoiéticos do peixe-zebra. Você pode alterar esse procedimento para atender às suas necessidades experimentais específicas, como testar citocinas específicas.

Não se esqueça de que trabalhar com sangue e agulhas de vertebrados pode ser extremamente perigoso e deve-se sempre tomar cuidado ao realizar este ensaio.