Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

O objetivo geral deste protocolo é aumentar a quantidade de DNA de fita dupla isolado e subsequentes bibliotecas de sequenciamento de alto rendimento de espécimes de herbário, maximizando sua utilidade em estudos filogenômicos. Este método desbloqueia o potencial de espécimes de herbário que, de outra forma, não seriam úteis para projetos de sequenciamento como sequências genômicas devido à extensa degradação da amostra. A principal vantagem dessa técnica é que ela é robusta o suficiente para que espécimes de herbário raros e historicamente significativos possam ser usados sem a necessidade de amostragem destrutiva extensiva.

Esta técnica estende a profundidade da amostragem de táxons em projetos espaçados sistemáticos. A aquisição de espécies é uma etapa limitante, mas com este protocolo, coleções históricas podem ser facilmente utilizadas nesses estudos. Adicione nitrogênio líquido e 30 a 50 miligramas de areia esterilizada para moer um centímetro quadrado de tecido de herbário pré-selecionado em pó fino em almofariz e pilão pré-resfriados.

A moagem adequada é essencial para o isolamento bem-sucedido do DNA. E deve-se tomar cuidado para que a amostra seja completamente pulverizada. Em seguida, adicione o pó congelado a dois tubos de dois mililitros, preenchendo não mais do que a metade do volume do tubo.

Em seguida, adicione 600 microlitros de solução quente de CTAB a cada tubo. Misture bem o pó invertendo e vórtice. Em seguida, incube as amostras em banho-maria mantido a 65 graus Celsius por uma a 1,5 horas.

Enquanto isso, vórtice a cada 15 minutos. Em seguida, centrifugar as amostras a 10 000 g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, transfira aproximadamente 500 microlitros do sobrenadante para um novo conjunto de tubos rotulados.

Ao sobrenadante, adicione quatro microlitros de 10 miligramas por mililitro de RNase A a cada melodia. Em seguida, misture o conteúdo do tubo invertendo ou pipetando. Incube as amostras em um bloco de calor ou banho-maria mantido a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Uma vez que os tubos tenham atingido a temperatura ambiente, adicione aproximadamente 500 microlitros de fenol 25:24:1, clorofórmio e mistura de álcool isoamílico às amostras. Em seguida, misture o conteúdo dos tubos invertendo ou pipetando repetidamente. Em seguida, centrifugar as amostras a 12 000 g durante 15 minutos à temperatura ambiente.

Transfira a camada aquosa superior, que é de aproximadamente 400 microlitros, para um novo conjunto de tubos rotulados. À camada aquosa de cada tubo, adicione aproximadamente 400 microlitros de clorofórmio 24:1 e mistura de álcool isoamílico. Misturar bem a amostra por pipetagem repetida ou inversão.

Em seguida, centrifugue os tubos a 12.000 g por cinco minutos e transfira aproximadamente 300 microlitros da camada aquosa superior para tubos pré-resfriados e rotulados. Em seguida, adicione 300 microlitros de isopropanol pré-resfriado e 12 microlitros de acetato de sódio 2,5 molar. Em seguida, incube os tubos a 20 graus Celsius negativos por 30 a 60 minutos.

Após a incubação, retire as amostras do congelador. Em seguida, centrifugar as amostras a 12 000 g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, lave o pellet com aproximadamente 300 a 500 microlitros de etanol a 70%.

Centrifugar novamente os tubos a 12 000 g durante 10 minutos. Em seguida, sem perturbar o pellet, remova cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, seque os pellets ao ar livre e dissolva o DNA em 50 microlitros de tampão 1X Tris-EDTA.

Adicione um a 16 microlitros de DNA isolado e dois microlitros de tampão de reação de fragmentação em um tubo de reação em cadeia da polimerase de 0,2 mililitro. Ajuste o volume final para 18 microlitros com água livre de nuclease. Em seguida, adicione dois microlitros de enzima de fragmentação de DNA de fita dupla e vortex a mistura brevemente por três segundos.

Em seguida, incube as amostras a 37 graus Celsius por 8,5 minutos no termociclador. Após a incubação, adicione cinco microlitros de EDTA 0,5 molar aos tubos. Adicione 25 microlitros de água livre de nuclease para ajustar o volume total do DNA cisalhado para 50 microlitros.

Em seguida, adicione 45 microlitros de esferas de SPRI mantidas em temperatura ambiente a 50 microlitros de DNA cortado e misture bem os dois pipetando-os para cima e para baixo. Deixar a amostra que contém os tubos durante cinco minutos. Em seguida, transfira os tubos para uma placa magnética e aguarde mais cinco minutos.

Expulse cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, adicione 200 microlitros de etanol fresco a 80% aos tubos no suporte magnético e aguarde mais 30 segundos em temperatura ambiente. Após 30 segundos, remova cuidadosamente o sobrenadante.

Deixe a tampa do tubo aberta para secar as contas ao ar por cinco minutos no suporte magnético. Em seguida, remova os tubos do suporte magnético e elua o DNA das esferas em 55 microlitros de tampão Tris-EDTA 0,1X. Misture bem o DNA por pipetagem repetida.

Em seguida, incubar a amostra à temperatura ambiente durante cinco minutos. Novamente, coloque o tubo no suporte magnético e espere que a solução desapareça em aproximadamente dois minutos. Remova 52 microlitros do sobrenadante e, em seguida, execute a análise de quantificação de DNA conforme descrito no protocolo de texto.

A 50 microlitros de DNA limpo e cisalhado, adicione três microlitros de endonuclease, enzimas de rejeito de fosfato e sete microlitros de tampão de reação. Misture bem o DNA e os outros componentes pipetando para cima e para baixo. Em seguida, gire os tubos para remover as bolhas.

Após a centrifugação, transfira as amostras para um termociclador e defina o programa. Dilua o adaptador de 25 a 50 vezes para atingir uma concentração de trabalho de 0,6 a 0,3 micromolar. Para sequenciamento de leitura curta de alto rendimento, adicione 30 microlitros de mistura mestre de ligação, um microlitro de intensificador de ligação e 2,5 microlitros de adaptador aos tubos.

Misture bem o conteúdo dos tubos pipetando para cima e para baixo. Novamente, gire os tubos para remover quaisquer bolhas. Em seguida, incube o tubo a 20 graus Celsius por 15 minutos.

Adicione três microlitros de mistura comercial de uracila-DNA glicosilase e DNA glicosilase liase endonuclease VIII aos tubos. Ajuste o volume total para 96,5 microlitros. Misture bem os componentes e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos no termociclador.

No tubo, prepare a mistura de reação em cadeia da polimerase adicionando todos os reagentes ao DNA limpo e ligado ao adaptador. Em seguida, misture bem a reação por vórtice. Assim que o vórtice terminar, coloque o samples no termociclador e inicie a configuração de amplificação do termociclador.

Adicione cerca de 25 microlitros de esferas magnéticas mantidas em temperatura ambiente à amostra e misture por pipetagem repetida. Incubar a amostra durante cinco minutos. Em seguida, transfira os tubos para um suporte magnético e aguarde mais cinco minutos.

Após cinco minutos, remova o sobrenadante para um novo conjunto de tubos rotulados. Em seguida, ao sobrenadante, adicione seis microlitros de esferas de SPRI mantidas em temperatura ambiente e misture bem. Depois de incubar as amostras por cinco minutos, transfira os tubos na placa magnética e aguarde mais cinco minutos.

Remova e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 200 microlitros de etanol fresco a 80% aos tubos no suporte magnético. Em seguida, incube os tubos em temperatura ambiente por 30 segundos.

Após 30 segundos, remova cuidadosamente o sobrenadante e seque as esferas ao ar por cinco minutos com a tampa do tubo aberta enquanto ainda estiver no suporte magnético. Agora remova os tubos do ímã. Eluir o DNA alvo das esferas em 33 microlitros de tampão Tris-EDTA 0,1X e sujeito a uma mistura completa.

Após a mistura adequada, incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, transfira os tubos para o suporte magnético e aguarde cerca de dois minutos até que a solução fique límpida. Pipete 30 microlitros do sobrenadante para tubos de dois mililitros para armazenamento.

Para mostrar o isolamento do DNA do herbário, um gel de agarose foi executado com DNA de fita dupla isolado de diferentes espécimes de herbário. Usando 10 miligramas de tecido foliar, quase 3,56 a 2.610 nanogramas de DNA de fita dupla isolado foram carregados no gel de agarose. O gel mostra DNA de herbário degradado em forma de esfregaço em todas as pistas.

Em seguida, a fim de mostrar a recuperação da biblioteca de sequenciamento de alta qualidade do DNA isolado de 10 espécimes de herbário, um gel de agarose foi executado. Antes do carregamento no gel de agarose, aproximadamente 1,26 a 464 nanogramas do DNA isolado do herbário foram submetidos ao cisalhamento enzimático e limpeza com 90% do volume do grânulo. O gel de agarose mostra a recuperação de uma biblioteca de sequenciamento de alta qualidade do DNA de 10 espécimes de herbário.

As bibliotecas de sequenciamento final mostram uma banda primária entre 300 a 500 pares de bases. Em seguida, para mostrar a sequência shotgun do DNA derivado do herbário, foi obtido um gráfico circular do genoma do cloroplasto TK 686. A sequência mostra o comprimento total do DNA, a região de repetição invertida e a presença de regiões grandes e pequenas de cópia única.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em 24 amostras em menos de 13 horas, com apenas cerca de oito horas de tempo prático ativo. Após esse procedimento, outros métodos, como a captura de sequências, podem ser realizados nas bibliotecas resultantes para gerar dados nucleares para estudos filogenéticos.