Name: Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Aprenda a isolar DNA de espécimes de herbário degradados e construir bibliotecas de sequenciamento de alto rendimento. Este método robusto maximiza o uso de coleções históricas em estudos filogenômicos sem amostragem destrutiva extensiva.

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Agradecemos a Taylor AuBuchon-Elder, Jordan Teisher e Kristina Zudock para assistência em espécimes de herbário de amostragem e o jardim botânico de Missouri para o acesso aos espécimes de herbário para amostragem destrutiva. Este trabalho foi apoio por um subsídio da Fundação Nacional de ciência (DEB-1457748).

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

O protocolo aqui apresentado é um método abrangente e robusto para isolamento de DNA e sequenciamento de preparação da biblioteca de amostras de planta seca. A consistência do método e necessidade mínima de alterá-lo baseado em amostra qualidade fazer escalável para projetos de sequenciamento de grande baseada no herbário. A inclusão de uma etapa opcional reamplification para baixo rendimento bibliotecas permite a inclusão de baixa qualidade, baixa quantidade, rara ou historicamente importantes amostras que não seriam ap...

Coleções de herbário são uma fonte potencialmente valiosa de espécies e diversidade genômica para estudos incluindo filogenética1,2,3, genética de populações4,5, conservação Biologia6, espécies invasoras biologia7e de evolução do traço8. A capacidade de obter uma rica diversidade de espécies, populações, localizações geográficas e pontos de tempo destaca o "tesouro"9 que é o herbário. Historicamente, a natureza degradada do herbário-derivada de ADN tem prejudicado projetos baseados em PCR, muitas vezes relegando pesquisadores usando apenas marcadores encontrados em cópia elevada, tais como regiões do genoma do cloroplasto ou do espaçador transcrito interno (ITS) do ribossômico RNA. Qualidade dos espécimes e DNA variam amplamente baseado em métodos de preservação9,10, com quebras de dupla-hélice e fragmentação do calor usado no processo de secagem, sendo as formas mais comuns de danos, criando o so-called 90% DNA de lock-up que tem hipotecada estudos baseados em PCR11. Além de fragmentação, a questão segundo mais prevalente no herbário genómica é contaminação, tais como que derivado de fungos endofíticos13 ou fungos adquiriram após a morte, após a colheita, mas antes de montar no herbário12, embora Este problema pode ser resolvido bioinformatically dado do banco de dados bem fúngico (veja abaixo). Um terceiro e menos comum, o problema é a modificação de sequência a citosina desaminação (C/G→T/A)14, embora estima estar baixa (~ 0,03%) em espécimes de herbário11. Com o advento do sequenciamento de alto rendimento (HTS), a questão da fragmentação pode ser superada com leituras curtas e sequenciamento profundidade12,15, permitindo a aquisição de dados de nível de genômica de numerosos espécimes com baixa qualidade DNA e por vezes mesmo permitindo de sequenciamento do genoma inteiro15.
Amostras de herbário são cada vez mais frequentemente utilizadas e são um componente maior de projetos filogenética16. Um desafio atual da utilização de espécimes de herbário para HTS é consistentemente a obtenção suficiente DNA encalhado dobro, uma condição prévia necessária para protocolos de sequenciamento, de inúmeras espécies em tempo hábil, sem a necessidade de otimizar métodos para indivíduo espécimes. Neste trabalho, um protocolo para extração de DNA e preparação da biblioteca de espécimes de herbário é demonstrado que tira proveito dos métodos existentes e modifica-los para permitir resultados rápidos e replicáveis. Este método permite a completo de processamento de amostra para uma biblioteca de 24 amostras em 13 h, com tempo de hands-on de 8 h, ou 16 h, com tempo de hands-on 9 h, quando a etapa opcional reamplification é necessária. Processamento simultâneo de mais amostras é viável, embora o fator limitante é centrífuga capacidade e habilidade técnica. O protocolo é projetado para exigir apenas típico equipamento de laboratório (thermocycler, centrífuga e suportes magnéticos) em vez de equipamentos especializados, tais como um nebulizador ou sonicador, para a tosquia de DNA.
Qualidade de DNA, tamanho do fragmento e a quantidade estão limitando fatores para a utilização de espécimes de herbário em experimentos de sequenciamento de alto rendimento. Outros métodos para isolar o DNA de herbário e criar bibliotecas de sequenciamento de alta produtividade têm demonstrado a utilidade de usar tão pouco quanto 10 ng de DNA16; no entanto eles exigem experimentalmente determinando o número ideal de PCR ciclos necessários para a preparação de biblioteca. Isso se torna impraticável quando lidar com quantidades extremamente pequenas de duplo viável encalhado DNA (dsDNA), como alguns espécimes de herbário produzem DNA apenas suficiente para uma preparação única biblioteca. O método aqui apresentado usa um único número de ciclos, independentemente da qualidade da amostra, para que nenhum DNA é perdido em passos de otimização de biblioteca. Em vez disso, um passo de reamplification é invocado quando bibliotecas não respeitem os valores mínimos necessários para sequenciamento. Muitas amostras de herbário são raras e possuem pouco material, tornando-se difícil justificar a amostragem destrutiva em muitos casos. Para combater isso, o protocolo apresentado permite dsDNA entrada tamanhos menos de 1.25 ng para o processo de preparação de biblioteca, ampliando o escopo das amostras viáveis para alta produtividade de sequenciamento e minimizando a necessidade de amostragem destrutiva de espécimes.
O protocolo seguinte foi otimizado para gramíneas e testado em centenas de espécies diferentes de amostras de herbário, embora esperamos que o protocolo pode ser aplicado a muitos outros grupos de plantas. Ele inclui uma etapa de recuperação opcional que pode ser usada para salvar a baixa qualidade e/ou espécimes raros. Este protocolo baseado em mais de 200 espécimes de herbário testados, funciona em espécimes com tecido baixa entrada e qualidade, permitindo a preservação de espécimes raros através de amostragem destrutiva mínima. Aqui é mostrado que este protocolo pode fornecer bibliotecas de alta qualidade que podem ser sequenciadas para projetos baseados em phylogenomics.

<table><tbody><tr><td>Termociclador Veriti</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 poços&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de Imagem em Gel</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 Series</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>Banho Seco Digital</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Eletroforese</td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (Água ultra pura)</td><td>ELGA&nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de DNA LoBind&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td> Mini centrífuga <td>de 2 ml</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Mortar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td><td>pilão de porcelana</td></tr><tr><td></td><td>fisher Scientific</td><td>S02595</td> tubos <td></td></tr><tr><td>de centrífuga</td> de porcelana <td>fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Tubos de Ensaio</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml Tubo de tira e tampa para PCR</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorômetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>Armazenamento</td> <td>de Curto Prazo de Nitrogênio LíquidoSuporte</td> de Anel Magnético Nalgene <td>F9401</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96 poços</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>Agitadores de placa quente</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td></td><td>Airgas UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 X TE Buffer</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8,0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERCAPTOETANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg / ml solução</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>bio WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>bio WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>bio WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isoamílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio Trihidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS DNA Ladder</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Sal Dissódico</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Kit de Ensaio dsDNA HS</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td>ultra pure</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Purple (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit para Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos para Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primers Set 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 X</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>Solução de fenol</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1016</td> Areia de sílica à <td>prova de 200</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Primers de reamplificação</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>ver texto</td><td></td></tr><tr><td>Sequencher v.5.0.1</td><td>GeneCodes</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento do dna robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbários são uma fonte inestimável de materiais vegetais que podem ser usados em uma variedade de estudos biológicos. A utilização de espécimes de herbário é associada com um número de desafios, incluindo a qualidade de preservação de amostra, DNA degradado e amostragem destrutiva de espécimes raros. Para utilizar mais eficazmente o material de herbário em projetos de sequenciamento de grande, é necessário um método confiável e escalável de preparação de isolamento e biblioteca de DNA. Este artigo demonstra um protocolo robusto, início-a-ponta para DNA isolamento e elevado-throughput construção da biblioteca de amostras botânicas que não exige modificação para amostras individuais. Este protocolo é adaptado para planta baixa qualidade secada material e leva vantagem de métodos existentes através da otimização de moagem de tecido, modificando a seleção de tamanho de biblioteca e introduzindo um passo opcional reamplification para bibliotecas de baixo rendimento. Reamplification de bibliotecas de DNA de baixo rendimento pode salvar amostras provenientes de espécimes de herbário potencialmente valioso e insubstituível, eliminando a necessidade de amostragem destrutiva adicional e sem a introdução de viés de sequenciamento discernível para comum aplicações filogenéticas. O protocolo foi testado em centenas de espécies de gramíneas, mas é esperado para ser adaptável para o uso em outras linhagens de planta após verificação. Este protocolo pode ser limitado por DNA extremamente degradado, onde não existem fragmentos na faixa de tamanho desejado, e por metabólitos secundários presentes em alguns materiais vegetais que inibem limpo isolamento do DNA. Em geral, este protocolo introduz um método rápido e abrangente que permite o isolamento de DNA e preparação da biblioteca de 24 amostras em menos de 13 h, com apenas 8 h de tempo ativo de hands-on com modificações mínimas.

Isolamento de DNA e o rendimento Final da biblioteca Neste estudo, demonstrou-se a eficácia do protocolo para o isolamento do DNA de herbário e a recuperação das bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade usando 50 amostras diferentes com os mais antigos de 1920 e o mais novo a partir de 2012 (tabela 2). Para cada amostra, cerca de 10 mg de tecido foliar foi usado para isolamento de DNA. Tecido de folha verde foi favorecido, se disponível, e não t...

Este artigo demonstra um protocolo detalhado para isolamento de DNA e construção de biblioteca de sequenciamento da elevado-produção de material de herbário, incluindo resgate de má qualidade excepcionalmente DNA.

Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

O objetivo geral deste protocolo é aumentar a quantidade de DNA de fita dupla isolado e subsequentes bibliotecas de sequenciamento de alto rendimento de espécimes de herbário, maximizando sua utilidade em estudos filogenômicos. Este método desbloqueia o potencial de espécimes de herbário que, de outra forma, não seriam úteis para projetos de sequenciamento como sequências genômicas devido à extensa degradação da amostra. A principal vantagem dessa técnica é que ela é robusta o suficiente para que espécimes de herbário raros e historicamente significativos possam ser usados sem a necessidade de amostragem destrutiva extensiva.Esta técnica estende a profundidade da amostragem de táxons em projetos espaçados sistemáticos. A aquisição de espécies é uma etapa limitante, mas com este protocolo, coleções históricas podem ser facilmente utilizadas nesses estudos. Adicione nitrogênio líquido e 30 a 50 miligramas de areia esterilizada para moer um centímetro quadrado de tecido de herbário pré-selecionado em pó fino em almofariz e pilão pré-resfriados.A moagem adequada é essencial para o isolamento bem-sucedido do DNA. E deve-se tomar cuidado para que a amostra seja completamente pulverizada.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

O método de Hi-C permite a identificação imparciais, de todo o genoma de interações cromatina (1). Oi-C casais ligadura proximidade e seqüenciamento massivamente paralelo. Os dados resultantes podem ser usados ​​para estudar a arquitetura genômica em múltiplas escalas: resultados iniciais identificadas características como territórios cromossomo, a segregação da cromatina abertas e fechadas, e estrutura da cromatina na escala megabase.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

Este manuscrito descreve uma abordagem automatizada de seleção de tamanho de gel para purificar fragmentos de DNA para sequenciamento de próxima geração. A tecnologia Ranger fornece automação completa de todo o processo de carregamento de gel de agarose, análise eletroforética e recuperação de fragmentos de DNA direcionados, permitindo bibliotecas de sequenciamento de última geração de alto rendimento e alta qualidade.

Automated Gel seleção de tamanho para melhorar a qualidade das bibliotecas de sequenciação de próxima geração Preparado a partir de amostras de água do ambiente

Nós descrevemos um método eficiente, robusto e de baixo custo para extração de ácidos nucleicos de cotonetes para a caracterização das comunidades bacterianas usando 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento. O método permite uma abordagem comum para processamento de múltiplos tipos de amostras e acomoda uma série de processos analíticos jusante.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

A comparação e otimização de dois métodos de enriquecimento de DNA orgânico de plantas são apresentadas: centrifugação diferencial tradicional e fracionamento do gDNA total com base no estado de metilação. Nós avaliamos a quantidade e a qualidade de DNA resultantes, demonstram desempenho em seqüenciamento de próxima geração de leitura curta e discutimos o potencial para uso em sequenciação de moléculas únicas de leitura longa.

Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração

Gel-seq permite aos investigadores simultaneamente preparar bibliotecas para ambos DNA - e RNA-seq insignificante custo adicionado a partir de 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas.

Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

Contaminação durante o sequenciamento de genoma de organismos microscópicos continua a ser um grande problema. Aqui, nós mostramos um método para sequenciar o genoma de um Tardigrada de um único espécime com tão pouco quanto 50 pg de DNA genômico sem amplificação do genoma inteiro para minimizar o risco de contaminação.

Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento

Long-leitura sequências facilitam grandemente a montagem de genomas complexas e caracterização da variação estrutural. Nós descrevemos um método para gerar as sequências ultra-longa pelas plataformas de sequenciamento baseado em nanopore. A abordagem adota uma extração de DNA otimizada seguida de preparações de biblioteca modificada para gerar centenas de mil leituras com cobertura moderada de células humanas.

Sequenciamento de leitura ultralonga para análise de DNA genômico completo

Este protocolo detalha uma abordagem abrangente para a montagem de um genoma híbrido de bactérias urinárias. Fornece um procedimento reprodutível para a geração de sequências completas de genomas circulares úteis no estudo de elementos genéticos cromossômicos e extracromosômicos que contribuem para a colonização urinária, patogênese e disseminação de resistência antimicrobiana.

Montagem híbrida de genoma de Novo para a geração de genomas completos de bactérias urinárias usando tecnologias de sequenciamento de leitura curta e longa

A viabilidade e a eficácia de métodos scRNA-seq de alto rendimento anunciam uma era de célula única na pesquisa de plantas. Apresentamos aqui um procedimento robusto e completo para o isolamento de tipos específicos de células de raízes de Arabidopsis thaliana e posterior construção e análise da biblioteca de transcriptomas.

Isolamento e Análise do Transcriptoma de Tipos Celulares Vegetais

O presente artigo tem como objetivo fornecer protocolos detalhados e adequados para o isolamento de fungos endofíticos associados a plantas, preservação a longo prazo de isolados, caracterização morfológica e extração de DNA total para posterior identificação molecular e análises metagenômicas.

Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

O presente protocolo descreve o uso da tecnologia de código de barras de DNA para autenticar materiais medicinais à base de plantas, e a planta medicinal Angelica sinensis (Oliv.) Diels foi identificado como um exemplo.

Aplicação de código de barras de DNA para identificar plantas medicinais

Aprenda a isolar DNA de espécimes de herbário degradados e construir bibliotecas de sequenciamento de alto rendimento. Este método robusto maximiza o uso de coleções históricas em estudos filogenômicos sem amostragem destrutiva extensiva.

Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

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