Mapeamento metabólico: Citoquímica quantitativa enzimática e histoquímica para determinar a atividade de desidrogenases em células e tecidos

Este vídeo mostra como realizar o mapeamento metabólico. Um procedimento para quantificar a atividade de enzimas específicas chamadas desidrogenases. As células aderem a uma lâmina de microscopia ou a um tecido congelado.

Décadas atrás, desenvolvemos toda uma série de técnicas de mapeamento metabólico, então chamadas de enziméticos, No entanto, o metabolismo tornou-se obsoleto durante a revolução genética no final do século passado. Mas agora, o metabolismo está quente novamente.

Veja, por exemplo, as células cancerígenas. O metabolismo é agora considerado um alvo terapêutico e, portanto, as determinações da atividade nas células e tecidos estão quentes novamente. Um componente-chave do tampão de reação é o álcool polivinílico, ou PVA.

Isso é dissolvido em tampão fosfato a uma concentração de 18% O PVA é empoeirado e tóxico quando inalado, portanto, certifique-se de pesar o PVA sob uma capela de exaustão. Devido à alta concentração de PVA no tampão fosfato, aqueça o frasco tampão de reação em banho-maria enquanto agita. Certifique-se de enroscar a tampa frouxamente na garrafa ou a garrafa pode explodir.

Pode levar até 15 minutos até que o PVA seja completamente dissolvido no tampão fosfato. Nesse caso, a solução deve ser transparente com pequenas bolhas de ar causadas pela agitação. A solução viscosa de PVA pode ser pipetada em tubos tampão de reação usando uma pipeta larga.

Mantenha os tubos a pelo menos 40 graus centígrados ou mais para evitar que o PVA se solidifique. Um mililitro de solução de PVA é bom para cerca de quatro citospinas ou duas preparações de tecido. Para os outros componentes do tampão de reação, o cloreto de tetrazólio nitroazul amarelo, também chamado de nitroBT, é dissolvido em uma mistura de etanol e dimetilformamida, enquanto o aquece em um frasco de vidro no bico de Bunsen.

A solução não deve ferver ou o volume diminuirá muito. Portanto, não deixe o frasco por muito tempo no fogo e agite regularmente. Mantenha-o no gelo após ser dissolvido e prossiga para a próxima etapa rapidamente, pois o nitroBT dissolvido perece rapidamente.

NitroBT é um pó amarelo que ficará no fundo do frasco de vidro contendo etanol e DMF quando não for mantido dissolvido. Você pode verificar de vez em quando se o nitroBT está dissolvido. A solução será então amarela transparente.

Quando dissolvido, o nitroBT pode ser pipetado nos frascos para injetáveis que contêm a solução de PVA. Mexa delicadamente usando uma colher fina ou uma espátula fina para misturar o nitroBT e o tampão. Faça isso para todos os componentes do buffer de reação passo a passo listados na tabela um do texto completo.

Tente não fazer muitas bolhas de ar enquanto mexe os componentes da reação na solução de PVA. O truque é mexer continuamente sem tirar a colher ou espátula da solução. O transportador de elétrons, metoxifenazinium metil sulfato, deve ser protegido da luz e dissolvido no tampão de reação por último.

A cor vermelha do MPMS é conveniente para verificar se todos os componentes estão dissolvidos corretamente. Enquanto prepara o tampão de reação e agita os componentes nele, pré-aqueça as lâminas por 50 minutos em uma incubadora contendo água morna. Mantenha um nível de água baixo dentro da câmara de incubação.

Com a tampa fechada, isso manterá o ambiente de reação úmido. Com a tampa aberta, a água manterá os slides a uma temperatura quente. Aplique o tampão de reação nas preparações de células ou tecidos usando uma pipeta de vidro.

Não se preocupe com pequenas bolhas de ar, pois elas fluirão para a superfície e não interferirão na reação nas células ou tecidos. Mantenha a tampa da câmara de incubação fechada durante o tempo de incubação. Isso garantirá que a reação ocorra em um ambiente úmido para evitar que o tampão PVA seque.

A maioria das reações de desidrogenase em experimentos de mapeamento metabólico ocorre a 37 graus centígrados. Incube as lâminas no buffer de reação por um período de tempo pré-especificado, que pode ser encontrado na tabela um do artigo de texto completo. Pode-se ver facilmente se a reação funcionou ou não, pois as células, ou tecidos, ficarão azuis escuros ou roxos, devido à atividade das desidrogenases.

Que finalmente se transforma em nitroBT insolúvel incolor para o formazol azul escuro, que precipita no local da atividade da desidrogenase. A reação enzimática é interrompida em três etapas. Primeiro, o excesso de meio de incubação deve ser retirado de um tecido.

Em segundo lugar, o meio de incubação deve ser lavado das lâminas de microscopia usando lavagem mecânica em um tampão fosfato de PH de 5,3 a 60 graus centígrados. Em terceiro lugar, as lâminas de microscopia devem ser deixadas em tampão fosfato fresco de PH 5.3 a 60 graus centígrados por 20 minutos. Quarto, o tampão fosfato pode ser enxaguado com água da torneira e depois destilada.

Pode-se ver facilmente o tampão de reação saindo. O baixo PH do tampão de parada ajuda a interromper a reação da desidrogenase dentro das células. Coloque os slides em um novo buffer de parada uma ou duas vezes, dependendo da quantidade de slides que você está processando por vez.

Enxágue também as lâminas com água da torneira e finalize com água destilada. Agora, as lâminas podem ser secas em um aquecedor de lâminas e fechadas. Seque cuidadosamente a parte de trás da lâmina limpando-a e coloque-a em um aquecedor de lâminas pré-aquecido a 50 a 60 graus centígrados.

Quando as lâminas estão secas, uma solução de glicerina e lamínulas podem ser usadas para encerrar e preservar as lâminas. Guarde as lâminas na geladeira até prosseguir com a aquisição da imagem. Esta é uma micrografia fotográfica colorida de uma seção de tecido representativa em uma lâmina de vidro que foi processada no experimento mostrado neste vídeo.

Esta é uma seção de glioblastoma e a lepto desidrogenase é a enzima que foi investigada. Cada desidrogenase produz PH de entidade e cada molécula de PH converte uma molécula de nitroBT, o sal de tetrazólio amarelo, em uma molécula de formazol, o precipitado roxo mostrado nesta imagem. Pode-se observar alta atividade da lactato desidrogenase intracelularmente nas células tumorais mostradas como roxo escuro.

Os vasos sanguíneos têm menor atividade e são brancos. Esta é uma imagem monocromática da mesma região do slide. Que pode ser usado para quantificar a atividade enzimática conforme descrito no protocolo.

Quanto mais formazan é produzido, mais escuro é o pixel e maior a absorbância. A absorbância pode então ser convertida em picomoles da entidade ph que foram gerados. Portanto, o mapeamento metabólico é fácil de fazer.

É muito rápido e barato. Portanto, use-o em sua pesquisa.