Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

O objetivo geral desta estratégia HMEJ é fornecer uma ferramenta genética promissora para uma variedade de aplicações, incluindo a geração de modelos animais geneticamente modificados e terapias genéticas direcionadas. Este HMEJ aprovou a medida. Pode ter também questões-chave no campo genético e neurológico.

Por exemplo, como melhorar a eficiência da integração direcionada precisa de transgenes in vivo. A principal vantagem desta estratégia baseada em HMEJ é a capacidade de corrigir mutações genéticas com alta eficiência in vivo. O que se seguiu é terapêutico em potencial.

Demonstrando o procedimento estará Xing Wang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar o protocolo, coletar 5000 células N2a, previamente transfectadas com vetores de expressão Cas9 sgRNA EGFP por classificação de células ativadas por fluorescência ou FACS, usando células não transfectadas como controle. Digerir as células coletadas em 2 a 5 microlitros de tampão de lise a 56 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, aqueça e ative a proteinase K a 95 graus Celsius por 10 minutos. Amplifique a amostra por PCR aninhado usando o protocolo do fabricante. Misture um microlitro do produto de lise com DNA polimerase e um par de primers externos reconhecendo a sequência ao redor do local alvo do sgRNA e execute a PCR primária em um volume total de 20 microlitros.

Em seguida, ative a DNA polimerase a 95 graus Celsius por 5 minutos e, em seguida, execute a PCR primária com uma extensão final a 72 graus Celsius por 5 minutos. Realize a PCR secundária usando um microlitro de produto de PCR primário e um par de primers internos aninhados. Desnaturar e recozer 300-600 nanogramas de produto de PCR purificado em 20 microlitros de tampão de reação 1x TC7EI.

Adicione um microlitro de enzima T7EI aos produtos de PCR recozidos e digeri-los a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, execute o produto de digestão em gel de agarose 2% e tampão 1x TAE a 120 volts por 40 minutos, até que os fragmentos sejam separados. Use ImageJ para determinar as intensidades de banda do DNA cortado e não cortado e calcular a frequência indel.

Para a preparação de mRNA Cas9, adicione a sequência do promotor T7 à região codificadora de Cas9 por amplificação por PCR. Em seguida, adicione o primer Cas9 FR a uma concentração final de 0,1 micromolar e 20 nanogramas de vetor expressor de Cas9 à mistura de DNA polimerase de alta fidelidade 1x. Ajuste o volume final para 50 microlitros com água livre de nuclease.

Ative a DNA polimerase a 95 graus Celsius por 5 minutos e execute a PCR. Purifique o produto T7 Cas9 e PCR para transcrição in vitro, ou IVT. Em seguida, transcreva 0,5 a 1 micrograma de DNA, usando um kit de transcrição de mRNA a 37 graus Celsius por 8 horas em um volume total de 20 microlitros.

Adicione 1 microlitro de DNase à mistura para remover o molde de DNA a 37 graus Celsius por 15 minutos. Depois de adicionar uma cauda poli(A)por 45 minutos a 37 graus Celsius, recupere o mRNA Cas9 com um kit de purificação de RNA. Gere o modelo de sgRNA acionado por um promotor T7 com DNA polimerase de alta fidelidade, conforme realizado na seção anterior, e escolha um andaime de sgRNA contendo vetor como modelo.

Depois de purificar o produto de PCR de sgRNA T7, use 0,5 a 1 micrograma de DNA como modelo para transcrição in vitro de sgRNA usando um kit de transcrição de RNA curto a 37 graus Celsius por 6 horas, em um volume total de 20 microlitros. Após 6 horas de incubação, adicione 1 microlitro de DNase à mistura e continue a incubação a 37 graus Celsius por 15 minutos para remover o molde de DNA. Purifique os sgRNAs novamente usando o kit de purificação de RNA.

Dilua o sgRNA a 500 nanogramas por microlitro em água livre de RNase e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius por até três meses. A alta qualidade do mRNA Cas9 e do sgRNA sem degeneração e a linha correta de parâmetros do doador HMEJ são as etapas mais críticas na geração de camundongos knock-in. Coloque os embriões fertilizados em meio KSOM a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono.

Misture 100 nanogramas por microlitro de mRNA Cas9, 50 nanogramas por microlitro de sgRNA e 100 nanogramas por microlitro de vetor doador HMEJ e adicione água para ajustar o volume final para 10 microlitros. Pipete a mistura para cima e para baixo e coloque-a no gelo. Em seguida, puxe as agulhas capilares usando um extrator de micropipeta.

Injete um volume provável da mistura no citoplasma de zigotos com pró-núcleos bem definidos em uma gota de meio HEPES-CZB contendo 5 microgramas por mililitro de citocalasina B usando um microinjetor com configurações de fluxo constante. Finalmente, cultive os zigotos injetados em meio KSOM a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono até o estágio de blastocisto após 3 1/2 dias para observação de fluorescência. Após 3 dias de injeções, 12,9% dos blastocistos que receberam doadores HMEJ foram positivos para mCherry, que foi estritamente expresso no trofectoderma.

Ao sequenciar os camundongos positivos para PCR, todos os eventos de integração examinados foram integrações precisas no quadro em 5 junções primárias e 3 principais. Após 7 dias de injeções, as imagens imunofluorescentes revelaram que quase metade dos hepatócitos transfectados expressaram mCherry como corado nas seções do fígado. Após a retirada do NTBC, a coloração imuno-histoquímica hepática de hepatócitos corrigidos para Fah de camundongos Fah negativos que receberam as construções Fah HMEJ e Cas9 mostrou proliferação mais eficaz do que o método baseado em MMEJ.

A estratégia baseada em HMEJ pode ser uma plataforma ideal para substituir a sequência mutante, como parte da mutação, pela correta. O que não é aplicável a um método baseado em HHEJ. Após este experimento, esta terapia abre caminho para pesquisadores em campo onde a integração precisa do alvo para explorar amplas aplicações de terapia.