Name: Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprenda a estratégia HMEJ para integração precisa de transgenes in vivo usando CRISPR/Cas9. Este método oferece alta eficiência na correção de mutações gênicas com potencial terapêutico para terapias genéticas.

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Este trabalho foi apoiado por CAS estratégica pesquisa programa prioritário (XDB02050007, XDA01010409), o nacional Hightech R & D programa (programa 863; 2015AA020307), Fundação Nacional de ciências naturais da China (NSFC concede 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), programa mil jovens talentos de China (para HY), Break através do projeto da Academia Chinesa de Ciências, Xangai cidade Comissão de ciência e tecnologia de projeto (16JC1420202 para HY), o Ministério da ciência e tecnologia da China (maioria; 2016YFA0100500).

Todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética biomédica pesquisas nos institutos Shanghai para ciências biológicas (CAS).
1. projeto de plasmídeos de doador
<ol><li>
Seleção de sgRNA
	<ol>
<li>Use ferramentas de design on-line CRISPR para prever sgRNAs sobre o destino região11,12,13,14,15. Para o locus Cdx2 , design seis sgRNAs diferentes (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) em torno da paragem códon com maior potencial de rank e inferior fora-alvos (Figura 1A)16.</li>
		<li>Linearizar 2 µ g de vetores de expressão Cas9-CMV-EGFP e sgRNA por digestão BbsI (1 µ l de BbsI por 2 h a 37 ° C, a uma concentração final de 1 U / µ l em um volume de 20 µ l). Em seguida, purifica o produto pelo kit de purificação de gel com um gel de agarose 1% em tampão TAE 1 ×.</li>
		<li>Mistura um par de oligonucleotídeos de sgRNA em 10 µ l de 1 × T4 DNA ligase buffer uma concentração final de 50 µM. Incubar a solução de oligo usando um gradiente de temperatura de 95 ° C e 25 ° C com uma taxa de alteração de temperatura de 5 ° C/5 min (95 ° C por 5 min em seguida, 90 ° C por 5 min, 85 ° C por 5 min, etc.), que será recoze o oligos.</li>
		<li>Mix 4 µ l de recozido produto, 2 µ l do vetor tornado linear com 1 μL de T4 DNA ligase em 10 µ l de 1 × T4 DNA ligase do buffer de e em seguida ligate a 22 ° C, durante 1-2 h (Figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensaio de nuclease Surveyor de sgRNA Nota: A eficiência de direcionamento do sgRNA usado para o experimento de bater-no é avaliada por ensaio de nuclease surveyor (também conhecido como T7 endonuclease (T7EI) ensaio)17. Selecione o sgRNA com alta eficiência de clivagem de DNA e uma baixa distância entre o local de corte de sgRNA e o códon de parada.<ol>
<li>Transfect vetores de expressão Cas9-sgRNA-EGFP em linhas de células N2a cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% PSG e 1% não-essenciais aminoácidos pelo transfection kit (veja a Tabela de materiais). Incube a 37 ° C em 5% CO2células transfectadas.</li>
		<li>Após 48 h de incubação, coletar 5.000 células transfectadas (GFP+) por fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação usando células não transfectadas como um controle.</li>
		<li>Digerir as células coletadas em 2-5 µ l oflysis buffer (0,1% Triton X-100, 0.1% Tween 20 e 100 µ g/mL Proteinase K) a 56 ° C por 30 min, e em seguida o calor inativar proteinase K a 95 ° C por 10 min.</li>
		<li>Amplifica a amostra por PCR aninhado (tabela 1) usando o protocolo do fabricante. O tamanho dos produtos PCR é definido a 300-500 bp.<ol>
<li>Misturar 1 µ l de produto de Lise com DNA polimerase e um par de primers exteriores, reconhecendo a sequência ao redor do local de destino de sgRNA (0,1 µM, concentração final) (tabela 1) e realizar o PCR primária em um volume de 20 µ l.</li>
			<li>Ativar o DNA polimerase a 95 ° C por 5 min e realizar o PCR primária para 30 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 24 s (1min/1 kb), com uma extensão final a 72 ° C por 5 min.</li>
			<li>Realize o PCR secundária usando 1 µ l de produto PCR primário e um par de primers internas aninhadas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Desnaturar e re-recoze 300-600 ng do produto PCR purificado em 20 µ l de 1 × T7EI amortecedor da reação (50mm NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, pH de 1 mM DTT 7,9) usando um gradiente de temperatura de 95 ° C a 25 ° C com uma taxa de 5 ° C/5 min.</li>
		<li>Adicione 1 µ l da enzima T7EI para os produtos PCR recozidos e digerir a 37 ° C por 2 h. Em seguida, execute o produto da digestão em gel de agarose 2% em tampão TAE de 1 × 120 V por 40 min, até que os fragmentos são separados (veja a Tabela de materiais).</li>
		<li>Use o ImageJ para determinar as intensidades de banda de corte e DNA sem cortes. Calcule a frequência de indel usando os métodos como anteriormente relatado9 (Figura 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Construção do vetor de doador Nota: Para gerar vetores de doador HMEJ do gene Cdx2 , construir um doador de DNA (bp bp HAL-p2A-mCherry-800 800 HAR) ladeado com 23 nt Cdx2-sgRNAs segmentação sequência em ambas as extremidades (Figura 1D e 1 FiguraE). O PAM da sequência alvo era adjacente à extremidade do braço homóloga. Recomenda-se o assembly de Gibson para doador HMEJ clonagem.<ol>
<li>Amplificar o braço de homologia esquerdo bp 800 (HAL) com o avançar da primeira demão-1F (que contém a sequência de sobreposição de nt de 15-20 de vetor, 23 nt Cdx2-sgRNA sequência de direcionamento e cerca de 20 nt sequência de HAL) e inverter a primeira demão-1R (que contém a sequência de sobreposição de bp de 15-20 de p2A-mCherry e cerca de 20 sequência de nt de HAL) na concentração final de 0,1 µM usando DNA genômico de rato em 200 ng / µ l (Figura 1D, tabela 1).</li>
		<li>Amplificar o fragmento de inserção p2A-mCherry com o avançar da primeira demão-2F (contendo a sequência de sobreposição de nt de 15-20 de HAL e cerca de 20 nt sequência de fragmento de inserção) e inverter (que contém a sequência de sobreposição de nt de 15-20 de HAR e cerca de 20 nt sequência da primeira demão-2R o fragmento de inserção) na concentração de final 0.1 µM usando genômica DNA ou plasmídeo com sequências de repórter em 100 ng / µ l ou 30 ng / µ l (Figura 1D, tabela 1).</li>
		<li>Amplificar o braço de certa homologia bp 800 (HAR) com o avançar da primeira demão-3F (que contém a sequência de sobreposição de nt de 15-20 de vetor, 23 nt Cdx2-sgRNA sequência de direcionamento e cerca de 20 nt sequência de HAR) e inverter a primeira demão-3R (que contém a sequência de sobreposição de nt de 15-20 de p2A-mCherry e cerca de 20 sequência de nt de HAR) na concentração final de 0,1 µM usando DNA genômico de rato em 200 ng / µ l (Figura 1D, tabela 1).</li>
		<li>Executar todos os produtos PCR em gel de agarose a 1% em tampão TAE 1 × e purificar os produtos PCR de tamanho esperado pelo kit de extração do gel, de acordo com as instruções do fabricante (tabela 1).</li>
		<li>Digeri a 50-100 ng de um vetor de construção com KpnI e XbaI. Misture 2 µ l do vetor tornado linear em 30-40 ng / µ l, com três PCR amplificados fragmentos (1 µ l de cada um, 100-200 ng / µ l) na 2 x mistura de Gibson. Adicione H2O para ajustar o volume final de 10 µL.Incubate a mistura a 50 ° C por 60 min.</li>
		<li>Competentes de Escherichia coli de transformar células com todo o produto montado e extrair o plasmídeo constrói pelo kit de extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante. Verifique se o doador HMEJ por sequenciamento de DNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. genoma edição em embriões de rato usando o método baseado em HMEJ
<ol><li>
Produção de mRNA Cas9
	<ol>
<li>Para a preparação de mRNA Cas9, adicione a sequência de promotor T7 para o Cas9 região de codificação por amplificação por PCR usando o par de primer apropriado listado na tabela 1. Adicionar o primer Cas9 F/R em uma concentração final de 0,1 µM e 20 ng de Cas9 expressando o vetor para 1 × alta fidelidade mistura de DNA polimerase. Ajustar o volume final de 50 µ l com H2O.</li>
		<li>Ativar o DNA polimerase a 95 ° C por 5 min e realizar o PCR para 36 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 68 ° C por 4 min (1min/1 kb), com uma extensão final a 68 ° C por 10 min.</li>
		<li>Purificar o produto do PCR T7-Cas9 em vitro transcrição (IVT) e em seguida transcrever 0.5-1 µ g de DNA pelo kit de transcrição do mRNA em 37 ° C, durante 8 h em um volume total de 20 µ l, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Adicione 1 µ l de DNase à mistura para remover o molde do ADN a 37 ° C durante 15 min. adicionar uma cauda poli-A por 45 min a 37 ° C e recuperar o mRNA Cas9 pelo kit de purificação de RNA, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Produção de sgRNA
	<ol>
<li>Gere o modelo de sgRNA, impulsionado por um promotor T7 com alta fidelidade DNA polimerase, como acima. Escolha um andaime de sgRNA contendo o vetor como o modelo. Os primers utilizados são listados na tabela 1.</li>
		<li>Purificar o produto do PCR T7-sgRNA e use 0.5-1 µ g de DNA como o modelo para a transcrição em vitro de sgRNA usando um kit de transcrição do RNA curto a 37 ° C por 6 horas em um volume total de 20 µ l, de acordo com as instruções do fabricante (ver tabela de materiais de < / c11 >).</li>
		<li>Adicione 1 µ l de DNase à mistura e continue a incubação a 37 ° C por 15 min remover o modelo de DNA. Purificar o sgRNAs pelo kit de purificação de RNA, como acima (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Diluir o sgRNA a 500 ng / µ l em água livre de RNase e armazenar as amostras em −80 ° C por até 3 meses. Nota: Ribonucleoproteínas CRISPR (RNPs) são uma substituição alternativa com uma melhor eficiência de19,corte18,20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura de coleção, microinjeção e in vitro de embriões
	<ol>
<li>Superovulate B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) ratos fêmeas (7-8 semanas de idade) por gonadotropina de soro de égua grávida (PMSG), seguidos de gonadotrofina coriônica humana (hCG) 48 h mais tarde. Após a injeção de hCG, fêmeas de casa com machos de B6D2F1 durante a noite.</li>
		<li>Sacrifica as fêmeas por CO2 anestesia, 24h após a injeção de hCG. Recolha os embriões fertilizados de seus ovidutos (com 30-50 embriões para cada fêmea) médio/M2.</li>
		<li>Lugar os embriões fertilizados (cerca de 300 ovos por injeção de um dia) em meio KSOM (5,55 g/L de NaCl, KCl, 0,05 g/L KH2PO4, 0,05 g/L MgSO4•7H2O, 0,04 g/L de glicose, 1,12 g/L de sódio de 0,19 g/L de lactato, 2,1 g/L NaHCO3 , piruvato de sódio 0,02 g/L, 0,25 g/L CaCl2•2H2O, 0,004 g/L EDTA, 0,146 g/L, L-glutamina e albumina de soro bovino de 1 g/L) a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO2.</li>
		<li>MRNA Cas9 Mix (100 ng / µ l), sgRNA (50 ng / µ l), doador HMEJ vector (100 ng / µ l) e adicionar o H2O para ajustar o volume final de 10 µ l. Coloque a mistura no gelo.</li>
		<li>Puxe capilares agulhas (diâmetro exterior de 1,0 mm, diâmetro interno 0,78 mm com filamento) usando um extrator de micropipeta (parâmetros: calor, 74; puxar, 60; velocidade, 80; retardo, 200, pressão, 300. Consulte tabela de materiais). Agulhas comerciais seria uma substituição alternativa para o microinjection.</li>
		<li>Injetar um provável volume da mistura no citoplasma de zigotos com pró-núcleos bem definidos em uma gota de meio de HEPES-CZB contendo 5 µ g/mL citocalasina B usando um microinjector com constante fluxo de configurações(Figura 2)(ver Tabela de materiais)21. Nota: Cada grupo de zigotos deve ser injectado dentro de 20-30 min. Cytochalasin B poderia aumentar a viabilidade do zigoto rato após a injeção. Alternativamente, microinjeção pode ser operada com o sistema de piezo, conforme descrito anteriormente,22.</li>
		<li>Cultura de zigotos injetados no meio KSOM a 37 ° C, menos de 5% de CO2 até o blastocisto estágio após 3,5 dias para observação da fluorescência (figuras 2B e 2C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transferência de embriões e a geração de ratos
	<ol>
<li>Meu estral ratos fêmeas do ICR com vasectomizado camundongos machos do ICR no mesmo dia como injeção.</li>
		<li>Cultura de zigotos injetados na fase 2-célula a 37 ° C sob 5% CO2e a transferência de 25-30 2-célula de embriões em ovidutos das pseudopregnant fêmeas ICR em 0,5 dia post coitum (dpc). Mães de destinatários entregam filhotes na dpc 19,5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Genotipagem de mouse
	<ol>
<li>Extrair DNA genômico de rato do dedo do pé ou cauda amostras usando um kit de extração de DNA, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Identifica a junção de 5' e 3' do TOC-em eventos usando 200-400 ng de DNA genômico, medido por espectrometria de UV/vis, como um modelo para realizar o PCR ampliﬁcation.<ol>
<li>Ativar o DNA polimerase a 95 ° C por 5 min e realizar o PCR para 38 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C, durante 1 minuto (1 min/1 kb), com uma extensão final a 72 ° C por 10 min. Para 5' junção, use o primer para a frente na jusante do HAL, com o reverso no TOC-no fragmento (p2A-mCherry). Quanto à 3' junção, use o primer para a frente no TOC-no fragmento (p2A-mCherry), com o reverso na jusante do HAR (tabela 1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Execute 6 µ l do produto de PCR em gel de agarose 1% 1 × TAE buffer e verifique o tamanho do fragmento esperado. Em seguida, verificá-los por (Figura 2D) de sequenciamento de DNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HMEJ-baseado no Vivo genoma edição em hepatócitos
<ol><li>Coloque destinatário C57BL/6J rato (8 semanas) em um dispositivo de restrição e coloque a cauda através da fenda.</li>
	<li>Misture vetores de doador HMEJ (30 µ g) e vetores de expressão spCas9 (30 µ g) em 2 mL de solução salina. Para o experimento de controle, suspenda vetores de doador HMEJ (30 µ g) em 2 mL de solução salina(Figura 3).</li>
	<li>Limpe o rabo de rato com etanol a 70%. Inserir a agulha na cauda da veia e injetar a solução de DNA de plasmídeo dentro de 5-7 s. Retire a agulha e solte o mouse do dispositivo de restrição.</li>
	<li>Sacrificar os ratos pelo CO2 anestesia depois de 5-9 dias após a injeção. Perfundir o transcardially de ratos com soro fisiológico a 0,9%, seguido por paraformaldeído 4%, utilizando uma bomba peristáltica e corrigir o fígado durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Desidrate o tecido usando 30% de sacarose durante a noite, até que ele afunda até o fundo do tubo.</li>
	<li>Secção do tecido congelado em uma espessura de 10 µm para amostras de fígado.</li>
	<li>Enxagúe as seções três vezes em tampão fosfato 0,1 M (PB) e incube-os com anticorpo primário: Rabbit anti-mCherry (diluído em 5% NGS) durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Lave as seções três vezes no PB e incube-os então com anticorpo secundário: Cy3-AffiniPure cabra anti-coelho IgG para 2 h à temperatura ambiente em um agitador orbital.</li>
	<li>Counterstain as seções com DAPI por 20 min e montagem com glicerina em lâminas de vidro para observação de fluorescência posterior (Figura 3B).</li>
</ol>

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<li>Park, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Knockin+in+Porcine+Somatic+Cells+Using+CRISPR%2FCas+Ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins.</a> International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).</li>
<li>Woo, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-free+genome+editing+in+plants+with+preassembled+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).</li>
<li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li>
<li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os passos mais críticos na construção de plasmídeos de doador HMEJ são: (1) seleção da sgRNA com alta eficiência de clivagem de DNA e baixa distância entre local de corte de sgRNA e stop códon e (2) a boa construção de doador HMEJ. Clivagem CRISPR/Cas9-mediada em ambos vetor de doador do transgene (contendo sites de destino sgRNA e braços de homologia ~ 800 bp) e genoma alvo é necessária para a integração de alvo eficiente e precisa in vivo. Os passos mais importantes da geração de batida-em ratos usando o métod...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay"  to " T7 endonuclease I" respectively. 
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>Surveyor nuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
to:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>T7 endonuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
<img alt="CRISPR-Cas9 gene editing; sgRNA design, transfection, surveyor assay results; molecular diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Gene editing workflow with CRISPR, sgRNA, Cdx2 locus; includes T7E1 assay result and vector diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases&#160;&#34;surveyor assay&#34;&#160;and&#160;&#34;Surveyor&#160;Nuclease&#34; have&#160;been updated to &#34;T7E1 assay&#34;&#160; to &#34; T7&#160;endonuclease I&#34; respectively.&#160;

Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Edição de genoma preciso, alvo é muitas vezes necessária para a produção de modelos de animais geneticamente modificados e terapias clínicas. Muito esforço foi feito para desenvolver várias estratégias para eficiente genoma alvo de edição, tais como nuclease dedo de zinco (ZFN), nucleases efetoras como ativador de transcrição (TALENs) e CRISPR/Cas9 sistemas. Estas estratégias criar quebras de dobro-costa de DNA alvo (DSB) no genoma e tirar proveito dos sistemas de reparo de DNA intrínsecos, como recombinação homóloga (HR)1,2, microhomology-mediada final juntar-se (MMEJ)3 , 4 , 5e não-homólogas final juntando (NHEJ)6,7,8 , para induzir a integração específica de transgenes1,9. A estratégia baseada no HR é atualmente o mais usado do genoma edição de abordagem, que é muito eficiente em linhas celulares, mas não é facilmente acessível de células não-dividindo devido a sua ocorrência restrita na fase tardia do S/G2. Assim, a estratégia baseada no HR não é aplicável para na vivo edição do genoma. Recentemente, a estratégia baseada em NHEJ foi desenvolvida para gene eficiente bata no rato tecidos8. No entanto, o método baseado em NHEJ geralmente introduz puntuais nos cruzamentos, tornando difícil gerar edição genoma preciso, especialmente quando tentando construir em-frame fusão de genes8. Alvo de integração baseada em MMEJ é capaz de genoma preciso de edição. No entanto, apenas moderadamente aumenta a eficiência de integração orientada em anteriores relatórios5. Por conseguinte, melhorando a eficiência da integração alvo precisos na vivo é urgentemente necessária para aplicações terapêuticas amplo3.
Em um trabalho recentemente publicado, demonstrámos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-com base em estratégia, que mostrou a mais alta eficiência de integração orientada em tudo relatado estratégias ambos in vitro e in vivode10. Aqui, descrevemos um protocolo para o estabelecimento do sistema de HMEJ, e também a construção de vetores de RNA (sgRNA) o single-guia como alvo o gene de interesse e o doador vetores abrigar sites de destino sgRNA e ~ 800 bp de braços de homologia (Figura 1) . Este protocolo, também descrevemos as etapas detalhadas para geração de DNA bater-em ratos e breves etapas de integração alvo em tecidos na vivo. Além disso, um estudo de prova de conceito da estratégia baseada em HMEJ demonstrou sua capacidade de corrigir a mutação Fah e resgatar Fah- / - fígado falha ratos, que revelou ainda mais o seu potencial terapêutico.

<table><tbody><tr><td>pX330</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>vetor pAAV</td><td>Addgene</td><td>37083</td><td></td></tr><tr><td>pX260</td><td>Addgene</td><td>42229</td><td></td></tr><tr><td>AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td><td>Addgene</td><td>97307</td><td>Vetor AAV para codificar um SpCas9 otimizado para códon humano impulsionado pelo promotor EFs</td></tr><tr><td>AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA</td><td>Addgene</td><td>97308</td><td>Doador HMEJ para fundir um repórter p2A-mCherry ao camundongo Actb. EGFP impulsionado pelo promotor EF1a e sgRNAs acionados por U6 direcionados a Actb. Backbone AAV.</td></tr><tr><td>AAV_Cdx2 doador HMEJ</td><td>Addgene</td><td>97319</td><td>doador HMEJ por fundir um repórter p2A-mCherry ao camundongo Cdx2.&nbsp;</td></tr><tr>Tecnologia de <td>vida</td> de <td>reagente de transfecção de lipofectamina 3000</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>água livre de nuclease</td><td>Life Technologies</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Bbs I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonuclease I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Montagem Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid EndoFree-Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>MEGACLEAR KIT 20 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Instrumento de Extração de Micropipeta</td><td></td><td>P-97</td><td>&nbsp; Extrator de Micropipeta (parâmetros: calor, 74; tração, 60; velocidade, 80; tempo/atraso, 200; pressão, 300)</td></tr><tr><td>Instrumento Sutter</td> de <td>vidro borossilicato</td><td>B100-78-10</td><td>tipo de capilares (diâmetro externo 1,0 mm, diâmetro interno 0,78 mm com filamento)&nbsp;</td></tr><tr><td>Microinjetor FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo de congelamento</td><td>Leica</td><td>CM1950-Espessura do criostato</td><td>&nbsp; de&nbsp; 40&nbsp; &mu; m&nbsp; para&nbsp; cérebro,&nbsp; 10 &mu; m&nbsp; para&nbsp; fígado</td></tr><tr><td>Coelho anti-mCherry</td><td>GeneTex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen, Strep, Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD AriaII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Ningbo Sansheng Medicina</td><td>S141004</td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Ningbo Sansheng Medicina</td><td>B141002</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Sigma</td><td>CAT#C6762</td><td></td></tr><tr><td>KSOM+AA com D-Glicose e Fenol Vermelho</td><td>Millipore</td><td>CAT#MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium com Phenol Red</td><td>Millipore</td><td>CAT#MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

integração de alvo crispr/cas9-mediada na vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Como uma promissora plataforma de edição do genoma, o sistema CRISPR/Cas9 tem um grande potencial para manipulação genética eficiente, especialmente para a integração específica de transgenes. No entanto, devido a baixa eficiência de recombinação homóloga (HR) e várias mutações indel de fim não-homóloga ingressar (NHEJ)-com base em estratégias em células não-divisão, na vivo genoma edição permanece um grande desafio. Aqui, descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado sistema CRISPR/Cas9 para integração eficiente na vivo precisos alvo. Neste sistema, o alvo do genoma e o doador vector contendo armas de homologia (~ 800 bp) ladeado por alvo de RNA (sgRNA) único guia sequências são clivadas por CRISPR/Cas9. Esta estratégia baseada em HMEJ alcança a integração do transgene eficiente em zigotos de rato, bem como em hepatócitos na vivo. Além disso, uma estratégia baseada em HMEJ oferece uma abordagem eficiente para correção de fumarylacetoacetate hidrolase (Fah) mutação nos hepatócitos e resgata Fah-deficiência induzida ratos de insuficiência hepática. Tomados em conjunto, focalizando direcionados a integração, esta estratégia baseada em HMEJ fornece uma ferramenta promissora para uma variedade de aplicações, incluindo a geração de modelos de animais geneticamente modificados e terapias do gene alvo.

Edição de genoma HMEJ-baseado em embriões do rato: Para definir a eficiência de bater-do método baseado em HMEJ de zigotos de rato, nós entregamos Cas9 mRNA, sgRNA, tendo como alvo o gene Cdx2 e o doador HMEJ em zigotos de rato, que foi projetado para fundir um gene repórter de p2A-mCherry para o último códon do Cdx2 gene(Figura 2). Os zigotos injetados desenvolveram em blastocistos na cultura. Para avaliar ...

O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornece uma ferramenta promissora para a engenharia genética e abre a possibilidade de integração específica de transgenes. Descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado estratégia eficiente DNA alvo integração na vivo e alvo de terapias do gene usando CRISPR/Cas9.

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

O objetivo geral desta estratégia HMEJ é fornecer uma ferramenta genética promissora para uma variedade de aplicações, incluindo a geração de modelos animais geneticamente modificados e terapias genéticas direcionadas. Este HMEJ aprovou a medida. Pode ter também questões-chave no campo genético e neurológico.Por exemplo, como melhorar a eficiência da integração direcionada precisa de transgenes in vivo. A principal vantagem desta estratégia baseada em HMEJ é a capacidade de corrigir mutações genéticas com alta eficiência in vivo. O que se seguiu é terapêutico em potencial.Demonstrando o procedimento estará Xing Wang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar o protocolo, coletar 5000 células N2a, previamente transfectadas com vetores de expressão Cas9 sgRNA EGFP por classificação de células ativadas por fluorescência ou FACS, usando células não transfectadas como controle. Digerir as células coletadas em 2 a 5 microlitros de tampão de lise a 56 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, aqueça e ative a proteinase K a 95 graus Celsius por 10 minutos. Amplifique a amostra por PCR aninhado usando o protocolo do fabricante. Misture um microlitro do produto de lise c

crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Neste vídeo, demonstramos a edição completa do genoma baseada em CRISPR-Cas9 em células cultivadas, onde Cas9 e sgRNA são fornecidos como uma única construção de plasmídeo para as células. O sistema CRISPR-Cas9 e o gene desejado a ser inserido foram introduzidos nas células por meio da técnica de eletroporação para facilitar a edição gênica bem-sucedida.

Edição do genoma CRISPR tudo-em-um: um método para knock-in de gene baseado em reparo dirigido por homologia em células cultivadas usando o sistema CRISPR-Cas9

Os avanços recentes na capacidade de manipular geneticamente as linhas celulares somáticas possuem grande potencial para pesquisas básicas e aplicadas. Aqui, apresentamos duas abordagens para CRISPR / Cas9 gerado produção knockout e triagem em linhas de células de mamíferos, com e sem o uso de marcadores selecionáveis.

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de um gene CRISPR/Cas9-baseado edição sistema de reparação de mutações pontuais em células de mamíferos. Aqui, usamos uma abordagem combinatória para gene edição com uma estratégia detalhada de follow-on experimental para medir indel formação no local de destino — em essência, analisando o mutagenesis local.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Genoma alvo edição no sistema modelo Danio rerio (zebrafish) tem sido facilitada pela emergência de abordagens baseadas em CRISPR. Aqui, descrevemos um protocolo simplificado, robusto para a geração e a identificação de alelos CRISPR-derivado absurdo que incorpora o ensaio de mobilidade doheteroduplex e identificação de mutações usando sequenciamento de próxima geração.

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Utilizando um Cas9 preassembled ribonucleoprotein complexo (RNP) é um método poderoso para edição de genoma preciso e eficiente. Aqui, destacamos a sua utilidade em uma ampla variedade de células e organismos, incluindo células humanas primárias e os dois clássicos e emergentes organismos modelo.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

Aqui descrito é um protocolo para marcação endogenamente expressas proteínas com etiquetas fluorescentes em células-tronco pluripotentes induzidas humana usando CRISPR/Cas9. Células presumidamente editadas são enriquecidas por fluorescência ativada celular classificação e linhas celulares clonal são geradas.

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

O protocolo descreve como alcançar modificações direcionadas ao local no genoma dos mosquitos anofelinos da malária usando o sistema φC31 . As modificações descritas incluem tanto a integração quanto a troca de fitas transgênicas no genoma das linhas de acoplamento de rolamento attP.

Integração mediada pelo site φC31 e troca de em vetores anofelinos da malária

Este estudo fornece um procedimento sistematicamente otimizado de construção de mutantes homozigotos de gafanhotos baseado em ribonuclease CRISPR/Cas9, bem como um método detalhado para criopreservação e ressuscitação dos ovos de gafanhotos.

Construção de mutantes homozigotos de gafanhotos migratórios utilizando tecnologia CRISPR/Cas9

Uma barreira significativa para tecnologias como o CRISPR são os eventos fora do alvo que podem interromper genes vitais. 'Circularização para relatórios in vitro de efeitos de clivagem por sequenciamento' (CIRCLE-seq) é uma técnica projetada para identificar locais de clivagem não intencionais. Este método mapeia a atividade de todo o genoma do CRISPR-Cas9 com alta sensibilidade e sem viés.

CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

Um protocolo detalhado é fornecido para o uso da tecnologia CRISPR / Cas9 para obter knock-in direcionado altamente eficiente de grandes construções multicistrônicas em células T humanas primárias por meio da via de reparo de DNA de junção de extremidade mediada por homologia (HMEJ). As células T projetadas com este protocolo adaptável ao cGMP mantêm excelente expansão celular, citotoxicidade e produção de citocinas.

Engenharia não viral de células T humanas primárias por meio de integração direcionada de junção de extremidade mediada por homologia de grandes modelos de DNA

Aprenda a estratégia HMEJ para integração precisa de transgenes in vivo usando CRISPR/Cas9. Este método oferece alta eficiência na correção de mutações gênicas com potencial terapêutico para terapias genéticas.

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

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