Name: Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a caracterizar o microbioma global de amostras fecais usando sequenciamento de 16S rRNA. Este protocolo padronizado permite identificar bactérias aeróbias e anaeróbias, incluindo espécies de difícil cultivo, de forma reprodutível.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo programa-CORE (subvenções n º 41/11), a Israel Science Foundation (grant no. 908/15) e o Europeu de Crohn e colite organização (ECCO).

Aprovação ética para o estudo foi concedida pelo Comitê Local de ética pesquisa de Sheba e todos os métodos foram realizados em conformidade com as normas orientadoras aplicáveis e regulamentos. O protocolo recebido uma exceção de consentimento paciente do Conselho local de revisão ética, desde o material fecal que foram usados foram já apresentados para o núcleo de microbiologia como parte do exame clínico e sem informações identificáveis do paciente além de idade, gênero e resultados microbianos. Escrito, foi obtido o consentimento de voluntários saudáveis e o Conselho de revisão institucional aprovado o estudo. Algumas dessas amostras já foram incluídas em um anterior análise1.
1. manipulação de amostra
<ol><li>Recolher um esfregaço2 mm com aproximadamente 5 (aproximadamente do tamanho de uma borracha de lápis) de uma amostra fecal fresca com um cotonete estéril em um teste de tubo (ver Tabela de materiais). Armazene todos os esfregaços contendo amostras fecais a-80 ° C dentro de 24 h. Os esfregaços fecais podem permanecer lá até o processamento adicional.</li>
</ol>2. extração de DNA
<ol><li>Descongelar as soluções de extração e diluição à temperatura ambiente (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Transferência o swab fecal em uma coleção vazia de 2 mL do tubo (ver Tabela de materiais). Ajuste o tamanho da vara cotonete cortando-o usando uma tesoura limpa para permitir o fechamento do tubo com contaminação mínima. Adicione 250 μL de solução de extração para cada tubo de coleta contendo o swab fecal e vórtice para misturar.</li>
	<li>Aquecer as amostras por 10 min em um banho de água a ferver (95-100° C). Adicione 250 μL de solução de diluição para cada amostra e o vórtice para misturar.</li>
	<li>Armazenar os tubos de 2 mL contendo o DNA extraído e o cotonete a 4 ° C.</li>
</ol>3. PCR e preparação de biblioteca
Para obter as etapas 3.1 e 3.2, ambiente de trabalho em uma estação de trabalho PCR que fornece limpa, modelo e amplicon livre.
<ol><li>Rotule os primers (tabela 1), de acordo com seu código de barras. Diluir cada primer na água bidestilada (DDW) a uma concentração de μM 50 e loja a-20 ° C.</li>
	<li>Use uma placa de 96 poços para reações de PCR. Cada placa pode conter 32 amostras diferentes, que são marcadas por 32 primeiras demão índice diferente. Descongelar o primer para a frente e os 32 primers inverso à temperatura ambiente e diluí-los a 5 μM.</li>
	<li>Prepare misturas de reação de PCR para 100 reações (volume final em cada poço será 20 μl) misturando-se 100 μL de cartilha para a frente de 5 μM, 1ml 2 X PCR Master mix e 400 μL DDW. Colocar 15 μL desta mistura de PCR em cada poço (total de 96 poços). Adicione 1 μL de cada 5 μM de primer indexado reverso 3 diferentes poços (32 diferentes cartilhas em triplica dá um total de 96 poços).</li>
	<li>Em uma zona dedicada do pre-PCR, significando uma bancada limpa que é modelo e amplicon livre, adicionar 4 μL de cada amostra de DNA extraída de misturas de reação (cada amostra de DNA coletada é amplificada em triplicado — 32 amostras por placa de 96 poços).</li>
	<li>Executar o PCR com as seguintes configurações: desnaturação inicial de 94 ° C por 3 min; seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 1 min, recozimento a 55 ° C, durante 1 minuto e extensão a 72 ° C por 1 min; e uma extensão final a 72 ° C por 10 min.</li>
	<li>Em um banco diferente, que será definido como uma zona dedicada post-PCR, combine cada reação de PCR triplicada em um tubo de volume único (60 μL por amostra).</li>
	<li>Para avaliar a qualidade do PCR amplicons, execute 4 μL de cada reação de PCR combinados em um gel de agarose a 1% manchadas de brometo de ethidium. Sob UV comprimento de onda de 260 nm, o positivo amplicons aparecerá em um tamanho de banda esperada da bp 375-425. Só estes amplicons serão incluídos nas etapas subsequentes. Nota: Cada amostra é amplificada em triplicado, significado que cada amostra é amplificada em 3 diferentes reações de PCR. Não aumenta.</li>
</ol>4. Biblioteca quantificação e limpeza
<ol><li>A fim de obter uma piscina de concentração equimolar de todas as amostras PCR, quantificar cada amplicon por um ADN encalhado dobro (dsDNA quantificar reagente) fluorescente ácido nucleico mancha (ver Tabela de materiais), adequado para a quantificação simultânea de um grande quantidade de amostras. Nota: Uma vez que a escala do tamanho do amplicon é equívoca, a quantidade real em nanogramas é usada para carregar uma concentração equimolar.</li>
	<li>Combine 500 ng de cada amostra para um tubo estéril e único. Vórtice de misturar.</li>
	<li>Execute 200 μL da biblioteca em pool em um gel de agarose a 1% manchadas de brometo de etídio. Extraia faixas de bp de 375-425 do gel usando um kit de extração do gel de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais) e eluir a biblioteca agrupada em 80 μL DDW. Nota: A biblioteca em pool deve ser tamanho selecionado para reduzir os produtos de amplificação não-específica do host DNA.</li>
	<li>Medir a concentração final de biblioteca usando um dsDNA altamente sensível detectando o kit de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais). Medir o tamanho exato de biblioteca usando um kit de separação e análise altamente sensível para bibliotecas de DNA de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).</li>
</ol>5. sequenciamento
<ol><li>Diluir a biblioteca em pool para 19:00 com adição de biblioteca de controle de 20% (ver Tabela de materiais), de acordo com o protocolo de máquina de sequenciamento.</li>
	<li>Para sequenciamento, uso personalizado projetado Leia as primeiras demão que são gratuitas para os primers de amplificação de V4 (ver tabela 1).</li>
	<li>Cartilha de uso um terço personalizado projetado sequenciamento que lê o código de barras em um adicional ciclo (ver tabela 1) e gera leituras emparelhado-fim de 175 bases de comprimento em cada sentido, de acordo com as especificações do fabricante.</li>
	<li>Executar a máquina de sequenciamento e obter os arquivos FASTQ de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
</ol>6. processamento de dados
<ol><li>Costurar e processar os arquivos FASTQ emparelhado-final sobrepostos em um pipeline de curadoria de dados implementado em QIIME 2 versão 2017.7.017. Demultiplex as leituras de acordo com a amostra de códigos de barras específicas.</li>
	<li>Use DADA218 para a deteção de variante (SVs) controle de qualidade e sequência. Truncar leituras 15 bases da extremidade 5', e 13 bases da extremidade 3' descarte lê com mais de 2 erros esperados. Identificar e remover as quimeras usando o método do consenso — quimeras são detectadas em amostras individualmente, e sequências encontradas quiméricoes em uma fração suficiente de amostras são removidas.</li>
	<li>Executar a classificação taxonômica de SVs usando um classificador Naive Bayes equipado, treinado em de 2013 a agosto 99% identidade Greengenes banco de dados6, para 175 tempo leituras e o primer de avanço/retrocesso definido.</li>
	<li>Rarefy todas as amostras, a profundidade de 2.146 sequências.</li>
	<li>Use UniFrac não ponderada para medição da diversidade-β (entre amostra diversidade19,20) nas amostras de rarefeita, para evitar um efeito de tamanho de amostra.</li>
	<li>Use a matriz de distância resultante para realizar uma análise de coordenadas principais (PCoA). Nota: Os arquivos de script e mapeamento de processamento de dados são fornecidos como material suplementar (complementar Material 1 e 2).</li>
</ol>

<ol><li>Braun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbial+characterization+of+hospitalized+patients+with+suspected+infectious+diarrhea+shows+significant+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis.</a> Scientific Reports. 7, 1088(2017).</li>
<li>De Filippo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+diet+in+shaping+gut+microbiota+revealed+by+a+comparative+study+in+children+from+Europe+and+rural+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).</li>
<li>Yatsunenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiome+viewed+across+age+and+geography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiome viewed across age and geography.</a> Nature. 486, 222-227 (2012).</li>
<li>Rodriguez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+gut+microbiota+throughout+life%2C+with+an+emphasis+on+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life.</a> Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).</li>
<li>Bakken, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+Clostridium+difficile+infection+with+fecal+microbiota+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).</li>
<li>Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+human+fecal+microbiome+after+bacteriotherapy+for+recurrent+Clostridium+difficile-associated+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).</li>
<li>Nood, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+infusion+of+donor+feces+for+recurrent+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile.</a> The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).</li>
<li>Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6105529">Value of stool cultures.</a> The Lancet. 316, 413-416 (1980).</li>
<li>Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+diagnostics+for+infectious+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">New concepts in diagnostics for infectious diarrhea.</a> Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).</li>
<li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-filtering+vastly+improves+diversity+estimates+from+Illumina+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10, 57-59 (2013).</li>
<li>Leek, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+widespread+and+critical+impact+of+batch+effects+in+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data.</a> Nature Reviews Genetics. 11, (2010).</li>
<li>Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Create+a+global+microbiome+effort%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Create a global microbiome effort.</a> Nature. 526, 631-634 (2015).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> PNAS. 108, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+PCR+approach+to+accelerate+analyses+of+human-associated+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li>
<li>Lozupone, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+A+new+phylogenetic+method+for+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).</li>
<li>Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+An+effective+distance+metric+for+microbial+community+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison.</a> The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+16S+rRNA+gene+for+identification+of+a+broad+range+of+clinically+relevant+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens.</a> PloS One. 10, e0117617(2015).</li>
<li>Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+intestinal+microbiota%3A+culture+versus+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing.</a> ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).</li>
<li>Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).</li>
<li>Salipante, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+16S+rRNA+next-generation+sequencing+of+polymicrobial+clinical+samples+for+diagnosis+of+complex+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections.</a> PloS One. 8, e65226(2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

16s rRNA-amplicon e sequenciamento de espingarda metagenomics ganharam popularidade em aplicações de Microbiologia clínica21,22,23. Estas técnicas são vantajosas em sua capacidade aumentada para capturar táxons viáveis e não viáveis, fornecendo dados sobre a abundância relativa de inóculo patogênico e sua capacidade de identificar mais precisamente um polymicrobial infecciosa impressão digital24. Os avanços no campo da pesquisa microbiome ...

Esforços concentrados foram feitos para entender melhor microbiome diversidade e abundância, como outro aspecto de captar a diferença e semelhanças entre os indivíduos em condições saudáveis e patológicos. Idade2,3, geografia4, estilo de vida5,6e doença5 foram mostrados para ser associado com a composição de microbiome o intestino, mas muitas condições e populações ainda não foram totalmente caracteriza-se. Recentemente foi relatado que o microbiome pode ser modificado para aplicações terapêuticas7,8,9. Portanto, insights adicionais sobre a relação entre várias condições fisiológicas e a composição microbiana é o primeiro passo para a otimização dos potenciais futuras modificações.
Os métodos tradicionais de cultura microbiana são limitados por baixos rendimentos de10,11e são conceitualizados como um estado binário, onde uma bactéria está presente no intestino, ou não. Sequenciamento de alto rendimento baseado em DNA revolucionou a ecologia microbiana, permitindo a captura de todos os membros da comunidade microbiana. No entanto, a sequência ler comprimento e qualidade permanecem entraves significativos à taxonomia exata atribuição12. Além disso, experimentos com base alta produtividade podem sofrer de efeitos em lote, onde as medições são afetadas por variáveis não-biológicos ou não-científica13. Nos últimos anos, vários programas foram estabelecidos para estudar a microbiome humano, incluindo o projeto americano Gut, o projeto de Microbiome humano dos Estados Unidos (EUA) e o projeto MetaHIT do Reino Unido (UK). Estas iniciativas têm gerado grandes quantidades de dados que não são facilmente comparáveis devido à falta de consistência em suas abordagens. Uma variedade de projetos internacionais como o consórcio internacional de Microbiome humano, o projeto humana Microbiome as normas internacionais e o National Institute of Standards e tecnologia (NIST) tentou abordar algumas dessas questões14 e desenvolveu padrões para medições de microbiome que deverá permitir a obtenção de resultados reprodutivos confiáveis. Aqui descrito é um protocolo integrado de vários métodos amplamente utilizados15,16 para 16S rRNA elevado-throughput sequenciamento (16S-seq) a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. O protocolo descreve uma abordagem PCR coluna-livre, projetada originalmente para extração direta de planta DNA16, para habilitar a manipulação simultânea de um grande número de fecal amostras em um tempo relativamente curto com alta qualidade amplificado DNA para alvo sequenciamento da região de V4 microbiana da variável sobre uma plataforma comum de sequenciamento. Este protocolo visa orientar cientistas interessados em iniciar o uso do 16S rRNA-amplicon sequenciamento de forma robusta, reprodutiva, fácil de usar, detalhada, usando controles importantes. Tendo um protocolo guiada e detalhadas passo-a-passo pode minimizar o efeito de lote e assim permitirá resultados de sequenciamento mais comparáveis entre laboratórios.

<table><tbody><tr><td>Primers</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de extração</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7526</td><td></td></tr><tr><td>Solução de diluição</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5688</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td><td>KAPABIOSYSTEMS</td><td>KK2601</td><td>PCR Master mix</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit de reagentes</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>dsDNA quantificar o</td></tr><tr><td>reagente Kit de extração de gel MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28606</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Amresco</td><td>0710-250G</td><td></td></tr><tr><td>Água Ultra Pura Dnase e Rnase Free</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio Qubit dsDNA HS</td><td>Sondas moleculares</td><td>Q32854</td><td>Kit de detecção de dsDNA</td></tr> Alta <tr><td>Sensibilidade D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>Fita de tela 5067-5582</td><td>separação e análise</td></tr><tr><td>Ensaio de fita de tela</td><td>Reagentes Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>para bibliotecas de DNA</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td> Biblioteca de <td>controle</td><td>de 15017666</td><td>Illumina</td></tr><tr><td>Kit de reagentes MiSeq v2 (500 ciclos)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Amresco</td><td>E406-10mL-TAM</td><td></td></tr><tr><td>coleção de 2 mL tubos</td><td>SARSTEDT</td><td>72.695.400</td><td>Tubos de coleta Safe Seal</td></tr><tr><td>Cotonete de plástico em tubo de ensaio</td><td>em PP INTERIOR ESTÉRIL</td><td>23117</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</strong</td></tr><tr><td>>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>Sequncing Machine</td><td>Illumina</td><td>Miseq</td><td></td></tr><tr><td>PCR workstation</td><td>Biosan</td><td>UV-cleaner</td><td></td></tr><tr><td>tesoura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vortexer</td><td>Indústrias Científicas</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo guiado para caracterização microbiana fecal de 16s rrna-amplicon sequenciação

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

A humana microbiome intestinal desempenha um papel central em proteger as células de uma lesão, no processamento de energia e nutrientes e na promoção da imunidade. Desvios do que é considerado uma composição da microbiota saudável (disbiose) podem prejudicar as funções vitais levando a condições patológicas. Esforços recentes e em curso de investigação tem sido direcionados para a caracterização das associações entre composição microbiana e a saúde humana e a doença.
Avanços em tecnologias de sequenciamento do elevado-throughput permitem a caracterização a composição microbiana do intestino. Estes métodos incluem 16S rRNA-amplicon sequenciamento e sequenciamento de espingarda. 16s rRNA-amplicon sequenciamento é usado para perfil composição taxonômica, enquanto o sequenciamento de espingarda fornece informações adicionais sobre as previsões de gene e anotação funcional. Uma vantagem em usar um método de sequenciamento alvo da região variável do gene de rRNA 16S é seu custo substancialmente menor comparado ao sequenciamento de espingarda. Diferenças de sequência no gene 16S rRNA são usadas como uma impressão digital microbiana para identificar e quantificar diferentes táxons dentro de uma amostra individual.
Grandes esforços internacionais tem alistado padrões para 16S rRNA-amplicon sequenciamento. No entanto, vários estudos relatam uma fonte comum de variação causada pelo efeito do lote. Para minimizar esse efeito, protocolos uniformizados para colheita de amostras, processamento e sequenciamento devem ser implementado. Este protocolo propõe a integração de protocolos amplamente usados a partir de coleta de amostra fecal para análises de dados. Este protocolo inclui uma abordagem direta-PCR coluna-livre, que permite a manipulação simultânea e extração de DNA de um grande número de amostras fecais, juntamente com a amplificação por PCR da região V4. Além disso, o protocolo descreve o pipeline de análise e fornece um script usando a versão mais recente do QIIME (QIIME 2 versão 2017.7.0 e DADA2). Este protocolo passo a passo é destinado a orientar os interessados em iniciar o uso do 16S rRNA-amplicon sequenciamento de forma robusta, reprodutiva, fácil de usar, detalhada.

Uma ilustração esquemática do protocolo é mostrada na Figura 1.
Prospectivamente, nós recolhemos amostras de fezes de pacientes hospitalizados com diarreia infecciosa suspeita. As amostras foram submetidas ao laboratório de Microbiologia clínica no centro médico de Sheba entre fevereiro e maio de 2015, como foi descrito anteriormente1. Amostras de fezes foram submetidas a cul...

Este manuscrito descreve um protocolo padronizado detalhado de arranjar em sequência do elevado-throughput 16S rRNA-amplicon. O protocolo apresenta um protocolo integrado, uniformizado, viável e barato a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. Este protocolo permite a análise de um grande número de amostras com padrões rigorosos e vários controles.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

O objetivo geral deste sequenciamento de 16S rRNA-Amplicon de alto rendimento é caracterizar a composição do microbioma global a partir de amostras fecais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a composição microbiana global associada a muitos campos de interesse, como metabolismo, digestão e inflamação intestinal e sistêmica. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um censo das comunidades microbianas aeróbicas e anaeróbicas presentes na amostra fecal, incluindo as bactérias que são difíceis de cultivar.Este método pode lidar simultaneamente com um grande número de amostras fecais graças à linha de bomba de processamento rápido sem cólon e resultou em um sequenciamento robusto e reprodutível de 16S rRNA-Amplicon. Para este protocolo, tenha amostras de fezes congeladas que são aproximadamente do tamanho de uma borracha de lápis. As amostras devem ser armazenadas em tubos de dois mililitros com a ponta aparada do cotonete de coleta.Inclua controles negativos que consistem em swabs sem fezes e controles internos duplicados e tenha duplicatas de amostra das fezes originais da amostra para servir como controle interno. Comece descongelando as soluções

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve o protocolo de isolamento de DNA de amostras de fezes de camundongos portadores de tumor de cólon. O DNA extraído é amplificado usando PCR e o produto é posteriormente limpo usando uma abordagem baseada em esferas magnéticas. Este método pode ser usado para determinar o efeito do enriquecimento ambiental na microbiota do cólon e na mortalidade animal.

Isolamento de DNA microbiano de fezes: estudando o efeito do enriquecimento ambiental na diversidade do microbioma em modelo de tumor murino

Caracterizar a comunidade microbiana tem sido um objetivo de longa data na microbiologia ambiental. Os métodos de sequenciamento de última geração agora permitem a caracterização de comunidades microbianas em uma profundidade sem precedentes, com custo e mão de obra mínimos. Detalhamos aqui nossa abordagem para sequenciar genes de RNA ribossômico 16S bacteriano usando um sequenciador de bancada.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

Nós descrevemos um método eficiente, robusto e de baixo custo para extração de ácidos nucleicos de cotonetes para a caracterização das comunidades bacterianas usando 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento. O método permite uma abordagem comum para processamento de múltiplos tipos de amostras e acomoda uma série de processos analíticos jusante.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

Aqui, descrevemos um protocolo para obter dados de sequência de amplicons da rizosfera, solo e raiz endosphere microbiomes. Esta informação pode ser usada para investigar a composição e diversidade de comunidades microbianas associadas a planta e é apropriada para o uso com uma ampla gama de espécies de plantas.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

Aqui nós apresentamos um protocolo de sequenciamento de próxima geração para sequenciação de rRNA 16S, que permite a identificação e caracterização das comunidades microbianas na vetores. Este método envolve a extração de DNA, amplificação e código de barras das amostras através de PCR, sequenciamento em uma pilha de fluxo e bioinformática para combinar dados de sequência de informação filogenética.

Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

Aqui, apresentamos um protocolo para cultivo a microbiota do intestino do cólon in vitro, usando uma série de biorreatores que simulam as condições fisiológicas do tracto gastro-intestinal.

Aplicação avançada em Vitro cultivo tecnologia para estudar a Microbiota do intestino humano

Este protocolo descreve um sistema de fermentação em lote-cultura in vitro de microbiota fecal humana, utilizando inulina (um prebiótico bem conhecido e um dos moduladores de microbiota mais amplamente estudados) para demonstrar o uso deste sistema na estimativa de efeitos de intervenções sobre a composição da microbiota fecal e atividades metabólicas.

Um modelo de cultura em lote in vitro para estimar os efeitos dos regimes intervencionistas na microbiota fecal humana

É descrito aqui um procedimento de funcionamento padrão simplificado para o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica 16s rRNA e a análise usando ferramentas livremente disponíveis. Este protocolo ajudará os investigadores que são novos ao campo do microbioma assim como aqueles que exigem actualizações em métodos para conseguir o perfilamento bacteriano em uma definição mais elevada.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

Apresentamos o processo de isolamento, propagação e caracterização de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos de habitats aquáticos. O protocolo descreve o isolamento bacteriano, a identificação pelo método 16S rRNA e o teste de seu potencial degradador de hidrocarbonetos. Este artigo ajudará os pesquisadores na caracterização da biodiversidade microbiana em amostras ambientais e, especificamente, na triagem de micróbios com potencial de biorremediação.

Isolamento, Propagação e Identificação de Espécies Bacterianas com Propriedades Metabolizadoras de Hidrocarbonetos de Habitats Aquáticos

Pyrosequencing é uma técnica versátil, que facilita a sequenciação do genoma microbiano que pode ser utilizado para identificar espécies bacterianas, discriminar estirpes bacterianas, e detectar mutações genéticas que conferem resistência a agentes anti-microbianos. Neste vídeo, o procedimento para a geração microbiana amplicon, amplicon pyrosequencing, e análise da seqüência do DNA será demonstrado.

Pirosequenciamento de Identificação Microbiana e Caracterização

Aprenda a caracterizar o microbioma global de amostras fecais usando sequenciamento de 16S rRNA. Este protocolo padronizado permite identificar bactérias aeróbias e anaeróbias, incluindo espécies de difícil cultivo, de forma reprodutível.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

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