Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

O objetivo geral deste sequenciamento de 16S rRNA-Amplicon de alto rendimento é caracterizar a composição do microbioma global a partir de amostras fecais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a composição microbiana global associada a muitos campos de interesse, como metabolismo, digestão e inflamação intestinal e sistêmica. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um censo das comunidades microbianas aeróbicas e anaeróbicas presentes na amostra fecal, incluindo as bactérias que são difíceis de cultivar.

Este método pode lidar simultaneamente com um grande número de amostras fecais graças à linha de bomba de processamento rápido sem cólon e resultou em um sequenciamento robusto e reprodutível de 16S rRNA-Amplicon. Para este protocolo, tenha amostras de fezes congeladas que são aproximadamente do tamanho de uma borracha de lápis. As amostras devem ser armazenadas em tubos de dois mililitros com a ponta aparada do cotonete de coleta.

Inclua controles negativos que consistem em swabs sem fezes e controles internos duplicados e tenha duplicatas de amostra das fezes originais da amostra para servir como controle interno. Comece descongelando as soluções de extração e diluição à temperatura ambiente, juntamente com as amostras fecais e as amostras de controle. Depois de descongelado, adicione 250 microlitros de solução de extração a cada tubo de amostra e misture as fezes em solução usando um vórtice.

Introduza os controles negativos somente de buffer neste momento. Em seguida, aqueça as amostras por 10 minutos em banho-maria fervente. Após a incubação em água fervente, adicione 250 microlitros de solução de diluição a cada amostra e vortex as amostras a serem misturadas.

Em seguida, armazene os tubos de amostra a quatro graus Celsius até que a PCR possa ser realizada. Configure os PCRs em uma estação de trabalho pré-PCR que tenha sido limpa de possíveis contaminantes de DNA, como modelos e Amplicons. Rotular os primers de acordo com seu código de barras e diluí-los em água bidestilada até uma concentração de 50 micromolares.

Armazene os estoques de primer diluído a menos 20 graus Celsius e descongele-os completamente antes de usar. Para cada amostra, prepare uma placa de 96 poços para 32 reações em triplicata. Após o aquecimento à temperatura ambiente, diluir as alíquotas do primer direto e dos 32 primers reversos a cinco micromolares para a reação em cadeia da polimerase (PCR).

Em seguida, prepare uma mistura de PCR de base suficiente para 100 reações. Combine 100 microlitros de primer direto de cinco micromolares com um mililitro de mistura master de PCR 2X e 400 microlitros de água bidestilada duplamente. Vortex esta mistura e, em seguida, carregue 15 microlitros desta mistura em cada um dos 96 poços.

Em seguida, carregue conjuntos de três poços, cada um com um microlitro de cinco micromolares de primer reverso. Assim, carregue todos os 32 índices reversos diferentes na placa. Em seguida, em cada poço de placa, adicione quatro microlitros da amostra de DNA extraída.

Isso é feito em um banco limpo. Agora execute o PCR com uma desnaturação inicial de três minutos seguida de 35 ciclos com um minuto de desnaturação e ajoelhado a 55 graus Celsius e um minuto de extensão. Termine com uma extensão final de 10 minutos.

Após a conclusão da reação, trabalhe em uma bancada de trabalho dedicada à pós-PCR. Lá, combine cada conjunto de produtos de PCR triplicado em um único tubo para 60 microlitros por amostra. Em seguida, execute quatro microlitros de cada amostra em um gel de agarose 1% manchado com brometo de etídio.

Os Amplicons positivos aparecerão entre 375 e 425 pares de bases. Os controles negativos são mostrados e processados junto com os Amplicons positivos do estudo. Quantificar as concentrações de ADN dos produtos de reacção positiva de acordo com as instruções do fabricante.

Em seguida, combine 500 nanogramas de DNA de cada um dos produtos em um único tubo. Vortex esta mistura e, em seguida, esgotar 200 microlitros em um gel de 1% como antes. Agora extraia as bandas do gel entre 375 e 425 pares de bases.

Em seguida, prepare a biblioteca para sequenciamento. Meça a concentração usando um kit de detecção de DNA de fita dupla altamente sensível de acordo com as instruções do fabricante, seguido pelo uso de um kit de separação e análise altamente sensível. Em seguida, dilua a biblioteca para sete picomolares e combine-a quatro para um com uma biblioteca de controle.

Agora que a amostra está pronta para sequenciamento, transfira-a para a máquina de sequenciamento. O método descrito para uma preparação de biblioteca a partir de amostras de fezes foi usado para analisar o microbioma de pacientes hospitalizados com suspeita de diarreia infecciosa. Paralelamente, as amostras de fezes também foram submetidas à cultura tradicional em um laboratório de microbiologia.

Amostras de fezes de adultos saudáveis foram sequenciadas para comparação. Foram incluídas várias amostras de controlo negativo, PCR sem molde, PCR em zaragatoas limpas e estéreis em solução de extracção e diluição e PCR em soluções mistas de extracção e diluição. Cada um deles teve menos de 118 leituras no total, que eram principalmente táxons de micoplasma.

As amostras padrão tiveram uma média superior a 10.000 leituras sem identificação de Mycoplasma após o controle de qualidade. A consistência e variabilidade das amostras foram medidas usando 16 amostras de fezes preparadas com dois primers codificados por barras diferentes para, portanto, construir duas bibliotecas diferentes de cada amostra. Metade das amostras foi positiva para Campylobacter salmonella ou Shigella na técnica tradicional de cultivo.

Usando os resultados do sequenciamento 16S, um gráfico de área no nível do filo mostra consistência entre as bibliotecas feitas a partir das mesmas amostras, independentemente dos resultados tradicionais de cultivo. A partir desse conjunto de 16 amostras pareadas, a análise de coordenadas principais revelou que os pares de amostras estão estreitamente alinhados e que as amostras de cultura positivas tiveram um valor de PC1 significativamente diferente das amostras de cultura negativas. Uma análise mais aprofundada das amostras revelou que altos níveis de Proteobactérias foram encontrados apenas nos pacientes hospitalizados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como processar simultaneamente um grande número de amostras fecais usando uma extração de DNA sem cólon e PCR para gerar bibliotecas de sequenciamento com código de barras da região V4 variável microbiana. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em um ambiente organizado e limpo, especialmente ao preparar as bibliotecas. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de fezes humanas é perigoso e o equipamento de proteção individual deve sempre ser usado durante a execução deste procedimento.