Quantificação absoluta dos níveis plasmáticos de MicroRNA em macacos Cynomolgus, usando o quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR

O objetivo geral deste procedimento é medir os níveis absolutos de MicroRNAs plasmáticos usando PCR quantitativo de transcrição reversa em tempo real. Este método pode ajudar a avaliar a quantidade de microRNAs plasmáticos, mesmo que seu nível de expressão seja baixo. A principal vantagem desta técnica é que os dados medidos podem ser comparados com outros de diferentes estudos ou laboratórios.

As implicações desta técnica se estendem às amostras de outras espécies porque uma curva padrão pode ser gerada usando o RNA sintético ou o nucleotídeo. Este método pode fornecer informações sobre a pesquisa translacional para investigar biomarcadores de segurança promissores. Primeiro, descongele as amostras de plasma congeladas obtidas da veia femoral dos macacos Cynomolgus no gelo.

Transfira o reagente de lise em clorofórmio no gelo para resfriamento antes da extração do RNA. Em seguida, adicione 1.000 microlitros de reagente de lise a 200 microlitros da amostra. E vórtice por um minuto para garantir a mistura adequada.

Em seguida, adicione cinco microlitros de cinco microRNAs sintéticos nanomolares de Caenorhabditis elegans e 200 microlitros de clorofórmio à amostra. Vortex a amostra por um minuto para misturar corretamente. Em seguida, coloque a amostra no gelo por dois a três minutos.

Em seguida, centrifugar a amostra a 12 000 g, durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira cuidadosamente 650 microlitros da fase aquosa para um novo microtubo. Em seguida, adicione 975 microlitros de etanol à fase aquosa e pipete várias vezes para garantir a mistura completa.

Transfira a amostra para a coluna e o adaptador correspondentes e seque a vácuo por três minutos usando coletores de vácuo. Em seguida, adicione 200 microlitros de etanol à coluna e seque a vácuo por um minuto. Após a secagem a vácuo, adicione 800 microlitros de tampão RWT à coluna e, novamente, seque a vácuo por dois minutos.

Em seguida, adicione 800 microlitros de tampão RPE à coluna e seque a vácuo por dois minutos. Adicione o tampão RPE duas vezes, seguido de secagem a vácuo. Em seguida, adicione 300 microlitros de etanol à coluna.

Depois de adicionar etanol, seque a vácuo por um minuto. Em seguida, transferir a coluna para um novo microtubo e centrifugar a mesma a 12 000 g à temperatura ambiente durante um minuto. Após a centrifugação, transfira a coluna para um novo microtubo e adicione 50 microlitros de água livre de nuclease.

Deixe a coluna repousar à temperatura ambiente durante três minutos e centrifugue em seguida a 8 000 g à temperatura ambiente durante um minuto. Por fim, armazene o eluído a 80 graus Celsius negativos até o uso. Para preparar uma concentração de oligonucleotídeo de RNA sintético que corresponda ao microRNA alvo, dilua a solução estoque 10 vezes para obter uma solução de trabalho com a concentração mais alta para traçar as curvas padrão.

Em seguida, para constituir um conjunto multiplex de primers de transcrição reversa, misture volumes iguais dos primers de 20 potências para microRNAs alvo. Em seguida, prepare a mistura de reação de transcrição reversa. Em seguida, adicione 10 microlitros de mistura de reação de transcrição reversa a cinco microlitros de amostra de RNA.

Misture os dois pipetando várias vezes. Em seguida, incube a mistura no gelo por cinco minutos. Depois de colocar a amostra no termociclador, inicie o ciclo.

Quando o programa terminar, armazene a amostra transcrita reversa a menos 80 graus Celsius. Para constituir o conjunto de primers de ensaio multiplex, adicione volumes iguais de cinco microlitros de primers de ensaio correspondentes aos microRNAs alvo no tubo contendo tampão Tris-EDTA no volume final de 1.000 microlitros. Em seguida, constitua a mistura de reação de pré-amplificação.

Uma vez que a mistura de reação esteja concluída, transfira 22,5 microlitros de mistura de reação de pré-amplificação para dois vírgula cinco microlitros de amostra transcrita reversa. Em seguida, pipete para misturar bem a amostra e a mistura mestre de pré-amplificação e incubar no gelo por cinco minutos e, em seguida, deixar os tubos de PCR no termociclador e iniciar a corrida. Quando o programa terminar, transfira todas as amostras a menos 80 graus Celsius.

Depois de descongelar as amostras pré-amplificadas ou não pré-amplificadas, dilua-as cinco vezes com água estéril. Para gerar a curva padrão, faça uma diluição serial de 10 vezes das amostras derivadas de oligonucleotídeos de RNA sintéticos. Em seguida, constitua a mistura quantitativa de reação de PCR em um tubo mantido em gelo.

Em seguida, adicione 18 microlitros da mistura de reação de PCR quantitativa às placas de reação óptica rápida de 96 poços. Em seguida, adicione dois microlitros das amostras diluídas nos poços. Depois de selar a placa com filme adesivo, centrifugue brevemente a amostra a 500 G por 15 segundos.

Em seguida, inicie o programa Thermocycler em tempo real. Use um software SDS versão 2.4 que funcione com o termociclador em tempo real correspondente para calcular o número de cópias brutas de cada amostra. Em seguida, calcule o número absoluto da cópia a partir do número da cópia bruta usando o software Excel.

A eficiência de amplificação do miR-122, miR-192 e miR-133a foi analisada por meio do gráfico de curvas padrão, o que explica a relação entre a concentração logarítmica versus o ciclo de quantificação para as amostras não pré-amplificadas. As curvas padrão para miR-122, miR-192 e miR-133a mostram uma relação linear entre os ciclos de quantificação e a concentração logarítmica das amostras. Em seguida, a eficiência de amplificação de miR-1, miR-499a e miR-206 foi analisada traçando curvas padrão para amostras pré-amplificadas.

Para analisar a eficiência da amplificação, a inclinação foi calculada por meio de regressão linear. A inclinação na curva padrão A mostra a ausência de amplicons específicos na concentração de 1.000 cópias por microlitro para miR-499a e miR-206. No entanto, os amplicons não específicos foram obtidos a 1.000 cópias por microlitro para miR-1.

Aqui, amostras de miR-206 não pré-amplificadas e pré-amplificadas foram usadas em duplicatas para derivar os gráficos de amplificação. Os valores do ciclo de quantificação para miR-206 não pré-amplificado e pré-amplificado foram estimados em 39,9, mais ou menos um vírgula nove e 27,0, mais ou menos dois vírgula dois, respectivamente, representando valores quase semelhantes entre as duplicatas, conforme mostrado nos gráficos. Em seguida, microRNAs plasmáticos obtidos de macacos Cynomolgus foram submetidos a perfis para calcular seus valores absolutos.

Os gráficos de pontos, obtidos a partir do perfil de microRNA representando seus níveis de expressão, mostram que o miR-122, miR-133a e miR-192 são detectáveis sem pré-amplificação. Considerando que, miR-1, miR-206 e miR-499a exigirão pré-amplificação devido aos baixos níveis de expressão. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir os níveis absolutos de microRNA plasmático, usando RT-qPCR.

E pré-amplificação; é útil para melhorar a detecção com pequenas quantidades de microRNAs.